Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Incidencias y Mantenimiento en HPLC Compress
Incidencias y Mantenimiento en HPLC Compress
-1-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... - 4 -
2 EL CROMATÓGRAFO LÍQUIDO BÁSICO ....................................................................... - 6 -
2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0) .......................................................................................... - 9 -
2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LÓGICO .................................................................... - 11 -
2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNÓSTICO DE AVERÍAS ............................................................... - 12 -
2.4 PROBLEMAS TÍPICOS EN HPLC ............................................................................................. - 12 -
3 LA FASE MÓVIL .................................................................................................................. - 14 -
3.1 COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA ...................................... - 14 -
3.2 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
3.3 DESGASIFICACIÓN DE LA FASE MÓVIL .................................................................................. - 33 -
3.4 FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL ........................................................................................... - 40 -
4 SISTEMAS DE BOMBEO .................................................................................................... - 46 -
4.1 FUNCIONES DE LA BOMBA .................................................................................................... - 46 -
4.2 BOMBA RECÍPROCA DE PISTÓN SIMPLE ................................................................................ - 47 -
4.3 LA BOMBA RECÍPROCA DE DOBLE PISTÓN ........................................................................... - 49 -
4.4 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE ..................................................................................... - 50 -
4.5 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ........................................................................... - 51 -
4.6 FORMACIÓN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (“DWELL-TIME”) .................................... - 52 -
4.7 INCIDENCIAS DE LA BOMBA .................................................................................................. - 55 -
TUTORIAL 1 ................................................................................................................................... - 61 -
5 INYECTORES ............................................................................................................................. - 65 -
5.1 COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIÓN ........................................................................ - 65 -
5.2 AUTOMUESTREADORES ......................................................................................................... - 71 -
5.3 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................ - 76 -
6 COLUMNAS ................................................................................................................................ - 86 -
6.1 LIMPIEZA, PURGA Y ALMACENAMIENTO DE LA COLUMNA ................................................... - 86 -
6.2 INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
-2-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
-3-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1 Introducción
El objetivo de esta sección es:
• Incidencias y Mantenimiento
Buenas prácticas de mantenimiento para;
Fase Móvil
Bomba
Sistemas de Inyección
Columnas
Detectores
-4-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
-5-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase móvil están contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposición mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase líquida por efecto sifón bajo influencia de la gravedad.
-6-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
-7-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Desgasificador
Bomba HPLC
-8-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Automuestreador
Columna
Detector
-9-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 10 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Perspectiva Sintomática
- 11 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 12 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Línea de Base
Picos
- 13 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
3 La Fase Móvil
El objetivo de esta sección es;
- 14 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 15 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Ejemplo de una línea de base con deriva (figura superior) y una línea de
base errática (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado
- 16 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
• Fase móvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
• H2O
Cualquier tampón usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separación isocrática con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deberá ser purgado adecuadamente.
• H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampón.
• Isopropanol
• Isopropanol:Hexano (u otros disolventes “no localizadores”(*)) 50:50
• Elución en Fase Normal
- 17 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 18 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 19 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 20 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
10
O
9
R C O
8 H
7
Weakly Basic
6
k’ 5
4 Weakly Acidic
3
2
O
1
R C
0 O
2 4 6 8
pH = pK pH
- 21 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fuerza Tamponadora
- 22 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cualquier pesada estará sujeta a errores que deben ser minimizados para
asegurar la menor desviación posible en la cuantificación final obtenida. Se
conseguirán mínimos errores siguiendo los siguientes criterios:
- 23 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Es decir, para una balanza de cuatro cifras (de lectura 0.0001g) se tendrá
una MAQ igual a:
Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
Balanza de 4 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg Balanza de 3 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g
- 24 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fuentes de Deriva
- 25 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efectos Estáticos
Muestras Higroscópicas
- 26 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Muestras Volátiles
- 27 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efectos de la Temperatura
El pH Metro y el Ajuste de pH
- 28 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Determinación del pH
• Un electrodo de pH.
• Un electrodo de referencia.
• Un pH metro de alta impedancia.
Electrodo de Referencia
Electrodo de pH
Electrodos de pH Combinados
- 29 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Electrodo de pH
Combinado ROSS®
Bulbo detector de pH
El pH-metro
- 30 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Soluciones Tampón
- 31 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
60 5.40 2.72
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'
- 32 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 33 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una burbuja que entra en la columna forzará su recorrido a través del lecho
de relleno de la fase estacionaria, provocando la formación de “canales”.
Dicha canalización disminuye rápidamente el rendimiento de la columna ya
que los analitos son capaces de atravesar la columna por dichos canales, lo
que se traduce en un menor tiempo de retención sobre la fase estacionaria,
saturándose rápidamente dichos huecos por moléculas de analito.
Tal efecto conduce generalmente a la formación de frentes en la forma de
los picos cromatográficos.
- 34 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 35 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 36 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Métodos de Desgasificación
Cuando se está usando el borboteo por helio hay que ser consciente de los
potenciales cambios que pueden tener lugar en la composición de la fase
móvil debido a la volatilidad selectiva de cualquier aditivo de la fase móvil,
p.ej., ácido Trifluoroacético (TFA).
- 37 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
• En discontinuo
• Incidental
• Desgasificación en línea
- 38 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Ultrasonidos
- 39 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 40 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 41 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 42 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 43 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Crecimiento microbiológico
Rango del pH
Ácido clorhídrico
Ácidos inorgánicos y ácidos fuertes
Haluros Básicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, ácido cítrico, ácido acético)
Si se usan los compuestos anteriores será necesario un mantenimiento más frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el análisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
- 44 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 45 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4 Sistemas de bombeo
El objetivo de esta sección es:
- 46 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Principio de Operación
- 47 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 48 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Principio de Operación
- 49 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 50 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
• Efectos de Cavitación
Durante la mezcla de disolventes en la válvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
- 51 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 52 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 53 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 54 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
No sustituir la frita puede dar como resultado una línea de base errática
- 55 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El material del sello del Pistón puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analítica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos también pueden originarse por
otro tipo de anomalías, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocará hombros en todos los picos cromatográficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistón y Sellos
Los sellos del Pistón están diseñados para desgastarse con el uso, siendo su
vida útil muy dependiente del tipo y de la concentración de las fases
móviles tampón que se utilicen.
- 56 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cualquier cambio del sello del pistón deberá implicar una inspección visual
del mismo, ya que si existen arañazos en la superficie del pistón, pueden
llevar prematuramente al fallo del nuevo sello reemplazado. Antes de la
inspección del pistón se deben limpiar los posibles depósitos de sales,
principalmente los restos de los tampones o del sello, utilizando un trapo
limpio, sin pelusas, empapado con una mezcla 1:1 de H2O:MeOH , y solo en
una dirección , desde la base hacia el extremo.
Luego, lo examinaremos con luz brillante y con la ayuda de una lupa para
verificar que no hay presente ningún arañazo o estrías.
Los sellos del Pistón están diseñados con frecuencia para deformarse con el
fin de ajustarse al pistón con el que están emparejados. En consecuencia es
posible que haya que sustituir el pistón y el sello al mismo tiempo.
- 57 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Válvulas Antirretorno
- 58 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 59 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 60 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 1
Pregunta 1
- 61 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
- 62 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 3
Pregunta 1
Observaciones:
- 63 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 4
- 64 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5 Inyectores
El Objetivo de esta sección es:
- 65 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 66 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 67 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 68 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 69 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 70 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.2 Automuestreadores
Los automuestreadores son ampliamente utilizados en los laboratorios de
análisis para aumentar el nº de muestras analizadas, mejorar la precisión,
eliminar la necesidad de que haya personal presente para hacer las
inyecciones manuales y reducir los costes laborales asociados al análisis
rutinario.
- 71 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Load
Position
Inject
Position
- 72 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Load
Position
Wash Inject
Step Position
- 73 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Aunque es más complicado de operación que los dos diseños previos, las
características del diseño del automuestreador de loop integrado aseguran
que no haya pérdidas de muestra y como consecuencia de ello haya ido
aumentando su popularidad.
El volumen máximo que puede inyectarse es función del tamaño del loop
integrado, típicamente 100µL. Los fabricantes ofrecen también una
función de multi-extracción (multidraw option) para compensar esta
limitación en el volumen de inyección. Cuando se emplea esta opción se
permite que varios volúmenes de 100µL sean combinados hasta un máximo
de 1.400mL aumentando así el volumen de inyección y ayudando al análisis
de trazas.
- 74 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Posición de
Inyección
- 75 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La aguja de muestra
- 76 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El Rotor Seal
- 77 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 78 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 79 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fase Móvil
La mejor situación posible es que el disolvente de la muestra y la fase móvil
sean iguales, tanto en poder de elución como en pH. En esta situación,
debido a la homogeneidad de disolventes, no hay que preocuparse por los
efectos de dilución.
Sin embargo, el volumen de inyección es limitado. La contribución del
volumen de inyección al ensanchamiento del pico cromatográfico puede
determinarse con la siguiente ecuación:
- 80 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 81 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 82 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Problemas Mecánicos
- 83 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efecto Memoria
- 84 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fugas
- 85 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
6 Columnas
Los objetivos de esta sección son:
Purga de la Columna
- 86 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Almacenamiento de la Columna
1. Sustituya la fase móvil que contiene el tampón por H2O, y cambie a una
composición idéntica de H2O: orgánico a la utilizada en el método de
separación original. Esta etapa limpia de forma muy eficiente la
columna y el sistema dejándolos libres de cualquier sal de los tampones
que pudiera precipitar.
Por ejemplo, Si la fase móvil es 50mM KH2PO4 y Acetonitrilo 60:40
(v/v), sustituiremos el 60% de tampón KH2PO4 con Agua purgando
abundantemente.
Se recomienda utilizar típicamente 10 volúmenes de columna, aunque
si se han empleado reactivos formadores de pares de iones, pueden ser
necesarios de 30 a 50 volúmenes para asegurar la limpieza correcta.
- 87 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 88 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 89 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La tabla siguiente relaciona los problemas más frecuentes con las columnas:
- 90 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Este hecho también puede observarse cuando se utiliza una misma columna
con diferentes métodos y analitos. En este caso pudiera ser necesario
realizar varias inyecciones de acondicionamiento (“priming” injections) con
el nuevo analito para llegar a conseguir una cromatografía reproducible. Los
tiempos de equilibrado de la columna deberán a menudo aumentarse para
adecuar la columna a los cambios en la selectividad.
Filtros de Línea
- 91 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Guarda Columnas/Discos
- 92 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 93 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 94 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Sustitución de la Columna
- 95 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 96 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
• Trimetilclorosilosano (TMCS)
• Hexametildisilazano (HMDS)
- 97 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 98 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 99 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Un único pico con cola también podría producirse por un pequeño pico
eluyendo inmediatamente después del pico cromatográfico de interés. La
posibilidad de que esto ocurra es la razón primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse. Como se describía en el apartado
“desdoblamiento de picos y hombros”, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de detección, o mejorar la
resolución de la separación empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna más larga o empaquetada con partículas de menor
tamaño.
- 100 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Un único pico que muestre frente también puede deberse a un pequeño pico
que eluya justo antes del pico cromatográfico de interés. Esta posibilidad es
la principal razón por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describía en el apartado “desdoblamiento de picos y hombros”,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de detección, o mejorar la resolución de la separación empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna más larga o empaquetada
con partículas de menor tamaño.
- 101 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 2
Pregunta 1
Usando la tabla siguiente enumere cinco partes del Automuestreador de
Loop completo que pueden requerir mantenimiento rutinario.
- 102 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
A continuación se muestran dos cromatogramas que pueden o no darnos
información sintomática del status operacional del sistema HPLC.
Condiciones:
Incidencia Solución
- 103 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9 Detectores
El objetivo de esta sección es:
1. Ser igual de sensible para todos los picos eluidos o registrar únicamente
aquellos picos que sean de interés.
2. No ser afectado por cambios de temperatura o composición de la fase
móvil.
3. Ser capaz de monitorizar trazas de las especies a analizar.
4. No contribuir de forma apreciable al ensanchamiento de los picos.
5. Proporcionar una respuesta rápida que le permita detectar picos
cromatográficos estrechos provenientes de la columna.
6. Ser robusto y fácil de mantener.
Selectividad
Un Detector no selectivo reacciona frente a una propiedad general del
eluyente que pasa a través de él. Cuando un analito eluye de la columna, las
características de esa propiedad cambian, y ese cambio bruto se mide y se
registra. Esta detección no-selectiva es característica del detector de índice
de refracción.
Sensibilidad
La señal más baja detectable no debe ser nunca menor de tres veces la
altura del ruido promedio en la línea de base; Es decir, una relación señal a
ruido (S/N) de 3:1 para un analito determinado determina su "Limite de
Deteccion".
- 104 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 105 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Rango Lineal
El Detector ideal debería proporcionar una señal de respuesta cuya área
fuera proporcional a la cantidad de muestra inyectada, independientemente
de si está cantidad es grande o pequeña. Esta linealidad no es infinita, pero
debe extenderse en el rango más amplio posible. La pendiente de la recta
en el diagrama de abajo se denomina respuesta y representa en que
magnitud el detector responde a un cambio específico en la concentración
de la muestra:
- 106 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Beam Splitter
- 107 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 108 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 109 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 110 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La Celda de Flujo
Este procedimiento debe aplicarse con precaución puesto que una presión
excesiva sobre la celda de flujo podría provocar fugas alrededor de las
- 111 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una celda de flujo sucia puede atrapar microburbujas cuando pasan a través
de ella. Estas microburbujas pasan normalmente a través de la celda sin ser
notadas pero cuando se atrapan pueden asociarse para generar burbujas
mayores afectando al ruido y la deriva de línea de base. Cualquier burbuja
atrapada debe purgarse de la celda requiriendo en ocasiones el uso de
isopropanol, cuya mayor viscosidad comparada con el acetonitrilo o
metanol, ayuda a arrastrar la burbuja enviándola a desechos.
- 112 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 113 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 114 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, típicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
- 115 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 116 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La Celda de Detección
Eventualmente la celda de detección de cada instrumento de light
scattering se ensuciará: esto es especialmente cierto para la cromatografía
acuosa. Detenga el flujo de fase móvil, y aumente el flujo de gas de
nebulización para arrastrar cualquier partícula no volátil del interior de la
celda. Por favor, consulte el manual de operación antes de realizar
cualquier procedimiento de limpieza.
Cualquier fase móvil que se utilice sin filtrar o tampones que empleen sales
o modificadores no volátiles contribuirán a un ruido excesivo de línea de
base o a picos continuos (spikes). En el peor de los escenarios dichos
aditivos pueden contaminar el tubo de deriva del detector y la celda de
detección. Modificadores volátiles que son aceptables incluyen: Ácido
Trifluoroacético, Ácido Acético, Formiato Amónico, Acetato Amónico e
Hidróxido Amónico.
- 117 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 118 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 119 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 120 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 121 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Iones Contaminantes
La contaminación de iones en el espectro de masas produce una pérdida de
sensibilidad en los analitos y aumenta la complejidad en la asignación de las
masas. Estos iones contaminantes pueden provenir de diferentes orígenes,
incluyendo:
1. La Fase Móvil
La mayoría de los solventes de grado HPLC contendrán impurezas que
no absorban en el UV, o estén presentes a niveles de concentración por
debajo de los límites de detección de la mayoría de otros detectores
LC, pero pueden ser la mayor fuente de contaminación de iones
observada en el espectro de masas.
Las botellas de vidrio de H2O grado HPLC son extraordinariamente
proclives a contener iones sodio y potasio que generan iones aducto de
una intensidad significativa.
2. Modificadores de la Fase Móvil.
Muchos de los modificadores típicos de las fases móviles pueden
generar por sí mismos iones fuertes, o introducir iones contaminantes
en la fase móvil.
Siempre que sea posible deben utilizarse reactivos de la mayor pureza
posible, y minimizar la concentración empleada.
3. Tubos de Conexión.
Evite los tubos de plástico para minimizar la introducción de iones
Ftalato. El ión de Ftalato 609Da es a menudo el pico base de cualquier
espectro de masas, y puede ser introducido inadvertidamente desde los
tapones con septum.
Minimice la contribución de los Ftalatos purgando la fuente con N2 gas
a temperaturas más altas de las utilizadas por término medio para
eliminar la contaminación.
Utilice tubo PEEK incoloro para reducir el ruido de fondo.
- 122 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 123 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
- 124 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 3
Pregunta 1
Evaluar los problemas mostrados en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas de éstos y cómo pueden corregirse:
Observaciones:
- 125 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
Usando los conocimientos adquiridos durante el curso complete un programa de
mantenimiento para su sistema de HPLC empleando la tabla de abajo como guía.
Frecuencia de Mantenimiento.
Procedimiento de Cada……..
Componente
Mantenimiento
48 Horas Semana Mes + Mes
La Fase Móvil
Solvente
Tamponado
Filtros de
Solvente
La Bomba
Check
Valves
Pistones y
Sellos
Frita Válvula
de Purga
Cebado
El Autoinyector
Sello del
Rotor
Aguja y
Asiento de
la Aguja
La columna
Guarda
Columna
Columna
El Detector
Lámpara
Celda Flujo
- 126 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
• Líneas de Base
La apariencia o el perfil de la línea de base pueden ayudar en la
identificación de muchos de los problemas asociados con los
componentes del sistema.
• Forma de los Picos
La forma del pico cromatográfico proporciona una valiosa información
al caracterizar las prestaciones proporcionadas tanto por los
componentes del sistema como por la columna.
• Tiempos de Retención
Cualquier variación observada en los tiempos de retención de los
analitos es crítica en el diagnóstico para eliminar problemas del
sistema LC.
- 127 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La siguiente tabla enumera una serie de razones por las cuales la línea de
básica puede ser errática, junto a la solución apropiada sugerida.
- 128 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Fallos en la Válvula Proporcional de Gradiente (mezclado) Llene las 4 botellas de disolvente con el mismo volumen del mismo y
realice una mezcla 1:1:1:1 durante un tiempo suficiente. El consumo en
cada botella de disolvente debe ser el mismo si las válvulas individuales de
cada canal operan correctamente.
Bomba HPLC Válvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente Sustituya y compruebe
bloqueadas. Realice los tests de mantenimiento específico indicados por el fabricante
para evaluar la integridad de los componentes individuales del cabezal de
la bomba.
Limpie o sustituya los que sean necesarios siguiendo el protocolo descrito
(ver pg. 46 ss), o las instrucciones del fabricante.
Tiempo de Reequilibración insuficiente Mínimo 10 volúmenes de columna. En métodos con Par Iónico 20−50
volúmenes de columna.
Detector Polvo o suciedad en los tarjetas electrónicas Sustituya el detector y compruebe. Si es necesario solicite una visita al
servicio técnico.
Lámpara cerca del fin de su vida útil. Mantenga un diario del uso de la lámpara.
Establezca un tiempo obligatorio de sustitución de la lámpara p.ej. 80%
del total de su vida útil esperada.
Celda de Flujo contaminada con muestra y/o matriz
Desmonte y limpie o sustituya la celda de flujo según las directrices del
fabricante.
Captura de Datos Conversor Analógico-Digital o tarjetas electrónicas defectuosas Sustituya el sistema de captura de datos y compruebe. Si es necesario
solicite una visita al servicio técnico.
Conexiones con mala toma de tierra.
Perdída de contacto en los cables Compruebe y ajuste todos los cables de conexión visibles.
- 129 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 130 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la línea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de corta frecuencia junto con
su solución adecuada.
- 131 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Válvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente Afloje la rosca de la válvula de salida para desplazar el aire atrapado.
bloqueadas. Sustituya y compruebe.
Limpie o sustituya si es necesario utilizando el protocolo genérico descrito
(ver página 46 ss), o siguiendo las instruccines del fabricante.
Sustituya o repare el amortiguador de pulsos (damper) Solicite una visita del servicio técnico si se requiere.
Automuestreador Fuga potencial en el cuerpo de la válvula de inyección que introduce aire. Realice el test de mantenimiento especificado por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes del automuestreador.
Loop o conexión de la aguja potencialmente defectuosos. Revise la válvula conmutable para buscar conexiones flojas.
Desmonte y re-asiente la válvula conmutable o sustituya sus comentes si
es necesario.
Detector Burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. Purge el aire. NO exceda el límite máximo de operación-típicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13µL de volumen.
Revise la documentación del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
Fluctuaciones de la corriente eléctrica de alimentación Compruebe otros instrumentos e instale protección contra las
fluctuaciones si es necesario.
- 132 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la línea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de larga frecuencia junto con
su solución adecuada.
- 133 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Detector Burbuja(s) de aire atrapada(s) en la celda del detector Purge el aire. NO exceda el límite máximo de operación-típicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13µL de volumen.
Revise la documentación del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
- 134 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 135 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La tabla siguiente indica diferentes razones por las que la línea de base del
cromatograma puede mostrar deriva junto con su solución adecuada.
- 136 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Re-equilbrado insuficiente de la columna o del gradiente de elución. Si empleamos un gradiente completo (i.e. 5 − 100% solvente B), debemos
asegurar un cambio de 10 volúmenes de columna antes de realizar una
nueva inyección de muestra.
Automuestreador Adsorción de muestra en los componentes de la válvula de inyección. Mantenga la posición de inyección de la válvula del inyector al menos unos
minutos después de la introducción de la muestra para asegurar un lavado
intenso.
Use un disolvente de la muestra tan fuerte como sea posible sin que se
comprometa la forma de pico
Implemente un régimen de lavado de la válvula después de cada
inyección.
Columna Ligero “sangrado” de muestra o matriz fuertemente retenida. Asegúrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte después de
cada muestra o lote de muestras.
Método de Fase Reversa con formación de Pares Iónicos. Aumente el tiempo de re-equilibrado a 20-25 volúmenes.
Exposición del Sistema gradientes de temperatura. Termostatice la columna y las líneas de entrada y salida de la misma.
Detector Dirección Negativa − Componente fuertemente absorbente en un eluyente Seleccione en el DAD la longitud de onda de referencia y un ancho de
débil. banda adecuados para eliminar el efecto de absorbancia del (los)
componente(s)
Compruebe que está usando el disolvente correcto.
Dirección Positiva − Componente fuertemente absorbente en un eluyente
fuerte. Asegúrese de que la polaridad de la señal del detector está correctamente
seleccionada.
- 137 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Las especificaciones del detector se suelen dar sobre una celda seca y vacía
a 255nm. No es muy práctico tener que crear una celda seca,
especialmente si se desea medir el ruido bajo condiciones similares a las del
análisis cromatográfico. Es aceptable sustituir la técnica de la celda de flujo
seca por una fase móvil isocrática y estacionaria. Si el ruido observado en
estas condiciones está aproximadamente a 2x de la especificación, el
detector está funcionado correctamente. El ruido a λs más bajas, como
215nm, será mayor aquel mostrado a 255nm con la fase móvil fluyendo a
través de la celda.
- 138 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Bomba HPLC Compruebe todas la conexiones buscando fugas que pudieran provocar la Elimine está posibilidad parando el flujo de fase móvil: si aún se muestra
entrada de aire el ruido entonces el conjunto de suministro de disolvente no es la causa.
Compruebe las áreas alrededor del cabezal de la bomba por si hubiera Apriete las conexiones si es necesario.
depósitos de sales de los támpones. Sustituya los componentes dudosos si es necesario.
© Crawford Scientific 2007
Automuestreador Introducción de aire durante la inyección. Realice los test de mantenimiento especificados por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes individuales del
Automuestreador.
Disolvente de la muestra o Fase móvil incorrectas
Si la viscosidad del disolvente de la muestra es alta, o posee un bajo punto
de ebullición, es conveniente reducir la velocidad de succión de muestra y
la de inyección para evitar cavitación.
Columna Temperatura de la Columna mayor que el punto de ebullición de alguno de Disminuya la temperatura de separación para evitar la ebullición del
los componentes de la fase móvil. disolvente.
Revalide el método si hay una pérdida de©resolución
Crawford Scientific
o cambia la 2007
Pérdida de los ligandos de la fase estacionaria. selectividad de la columna.
Compruebe que el método está operando en el rango correcto de pH para
esa columna.
Compruebe que el método funciona dentro de los límites de pH
Disolución de la sílice de la fase estacionaria. especificados para esa columna.
Detector Pertubaciones eléctricas “spikes” provenientes de los circuitos Sustituya el detector y compruebe.
electrónicos. Solicite una visita del servicio técnico si se requiere.
Purge el aire. NO EXCEDA el límite superior de presión establecido para la
Burbujas de aire atrapadas en la celda del detector. celda del detector, típicamente de 120 bares para una celda estándar de
1cm de paso óptico y 13µL de volúmen.
Revise la literatura del fabricante para confirmarlo.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
Mantenga un registro de las horas de uso de la lámpara.
Lámpara cerca del límite de su vida útil. Establezca un periodo de sustitución obligatorio de la lámpara. P.ej. al
80% de su tiempo de vida útil esperada.
Captura de Datos Mala toma de tierra / Conexión floja Sustituya el sistema de adquisición de datos y compruebe.
Revise y reconecte todos los cables de conexión visibles.
- 139 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Si todos los picos separados se han ensanchado, siendo los primeros los que
muestren más ensanchamiento, el problema vendrá causado simplemente
por la introducción de un gran volumen extra-columna en el sistema;
Dónde;
- 141 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
tR = 0.425 x (w0.5) x √N y
tR = 12.0
- 142 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 143 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 144 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Dónde;
ωmax = Masa de muestra en µg
k' = Factor de Capacidad
dc = Diámetro interno de la Columna en cm
- 145 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 146 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
• Trimetilclorosilosano (TMCS)
• Hexametildisilazano (HMDS)
- 147 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 148 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 149 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Un único pico con cola también podría producirse por un pequeño pico
eluyendo inmediatamente después del pico cromatográfico de interés. La
posibilidad de que esto ocurra es la razón primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse. Como se describía en el apartado
“desdoblamiento de picos y hombros”, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de detección, o mejorar la
resolución de la separación empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna más larga o empaquetada con partículas de menor
tamaño.
- 150 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Un único pico que muestre frente también puede deberse a un pequeño pico
que eluya justo antes del pico cromatográfico de interés. Esta posibilidad es
la principal razón por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describía en el apartado “desdoblamiento de picos y hombros”,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de detección, o mejorar la resolución de la separación empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna más larga o empaquetada
con partículas de menor tamaño.
- 151 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 152 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 153 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 154 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, típicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
- 155 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 156 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 157 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 158 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 159 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 160 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 161 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 162 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 163 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 164 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
- 165 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.5 Sensibilidad
Una baja sensibilidad puede producirse por alguna de las razones siguientes:
- 166 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.6 Recuperación
Una mala recuperación de la muestra puede producirse por múltiples
razones, pero se debe típicamente a la adsorción irreversible de los
ananlitos en la fase estacionaria o en los componentes extra-columna.
- 167 -