La Esterilizacion en El Laboratorio Micr

LA ESTERILIZACION EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO
La Esterilización en el Laboratorio Microbiológico
D esde hace mucho tiempo es un reto el control de enfermedades infecciosas por destrucción,
disminución de su número o inhibición de microorganismos.
Se puede llevar a cabo con diferentes métodos en función del lugar a aplicar y el grado de
erradicación microbiana que se pretende conseguir.
Por esto es conveniente definir algunos conceptos:
• Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida de vida
microbiana, incluidas las esporas.
• Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante agentes de
naturaleza química (desinfectantes), con el fin de disminuir el número de formas
vegetativas a niveles mínimos.
• Desinfectante: es la sustancia química que inhibe o destruye microorganismos al aplicarla
sobre material inerte sin alterarlo significativamente.
• Asepsia: término que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que los
microorganismos progresen en un medio determinado (quirófano, laboratorio. etc.)
• Antisépticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre superficies corporales con el
fin de reducir la cantidad de flora normal y de contaminantes microbianos de carácter
patógeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los desinfectantes y generalmente
menor grado de actividad. Determinados preparados pueden utilizarse como antisépticos o
como desinfectantes indistintamente, pero a diferentes concentraciones en cada caso.
• Antimicrobianos: son sustancias químicas producidas por microorganismos o sintetizadas
químicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e incluso de destruir
microorganismos sin producir efectos tóxico en el huésped.
Los métodos más importantes son:
Físicos
a. Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un objeto a

efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta forma, p. ej. ansas de
cultivo de siembra.
Ansas calibradas de cultivo
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Flameado en mechero Bunsen
b. Incineración: es el mejor sistema para esterilizar todas aquellos productos en los que no
importe su destrucción, p. ej. material biológico
c. Estufa: calor seco a alta temperatura, 20 minutos durante 180º, 60 minutos a 160º, siendo
suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º, se lo utiliza para esterilizar
material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.

d. Autoclave de Chamberland: La esterilización con calor húmedo (vapor de agua) es mucho

más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan
las proteínas de forma irreversible mediante rotura de los uniones H entre los grupos
peptídicos a temperaturas relativamente bajas. Consiste en una cámara en la que el aire
puede ser sustituído por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de
presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas
vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa
temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivo.
Autoclave de Chamberland

e. Tindalización: (esterilización intermitente) consiste en someter el producto a

calentamientos intermitentes entre 56 y 100ºC durante 30 minutos con lo que se asegura
destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a temperatura ambiente o a
37ºC, las esporas germinan y las bacterias resultantes se hacen más sensibles al
calentamiento posterior.
Radiaciones
a. Luz UV: es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por ácidos nucleicos
causando daños genéticos alterando las bases. Se la utiliza en la preparación de vacunas,
cabinas de seguridad biológica, lugares de trabajo como mesadas de laboratorios, est.
b. Radiaciones ionizantes: actúan lesionando ácidos nucleicos. Se la utiliza sobre todo en
procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos, guantes, jeringas, etc.
Agentes Químicos:
Los agentes químicos como el óxido e etileno, formaldehído o glutaraldehído reaccionan con
gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los ácidos nucleicos y proteínas alquilando
éstos radicales esenciales.
a) Óxido de etileno.
Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que incativa microorganismos

sustituyendo átomos de hidrógeno lábiles por otros grupos como hidroxilos, carboxilos, etc.
El material se expone a esterilizar a un 5-10% de óxido de etileno en dióxido de carbono a 50-60º

en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es necesario someterlo después a un
período de aireación debido a su carácter mutagénico. Es un agente efectivo en la esterilización
de material termolábil como prótesis, catéteres, etc.
Estufa para ETO

b) Formol o formaldehído.
Es un gas fácilmente soluble en agua que se utiliza al 40% (formalina). Usado en forma gaseosa y
en cámara cerrada se emplea en la esterilización hospitalaria y en la industria farmacéutica.
También es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas altamente contaminadas que
una vez tratadas deben airearse.
c) Glutaraldehído.
Se emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se emplea sobre todo en la
esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria.
La actividad de los compuestos derivados de metales pesados (como plata, mercurio, etc.,) se
debe a la formación de sales que se disocian con dificultad de los grupos sulfidrilos de las
proteínas.
d) Nitrato de plata y derivados agénticos: Son buenos bactericidas. El nitrato de plata se ha

utilizado en el tratamiento de quemaduras en soluciones al 0,5% y en la profilaxis de la oftalmia
neonatorum por Neisseria gonorrhoeae.
e) Derivados mercuriales: El más utilizado como desinfectante de la piel es el mercuriocromo, no

es tóxico y sigue siendo activo en presencia de materia orgánica.
f) Agua oxigenada (peróxido de hidrógeno): Es un agente oxidante de efecto fugaz por ser
descompuesto por las catalasas de los tejidos.
g) Permanganato de potasio: Agente oxidante que se inactiva en presencia de materia orgánica.

Es poco utilizado. En dermatología es utilizado por su propiedad antifúngica.
h) Derivados clorados: Se inactivan en presencia de materia orgánica. El cloro y derivados son

agentes oxidantes muy usados en la potabilización del agua en forma de cloro gaseoso en grandes
establecimientos, y en forma de hipoclorito es utilizado para descartar material biológico (sangre,
suero, etc.) La cloramina es un antiséptico menos potente que el hipoclorito, de acción más lenta
pero mejor tolerada en la aplicación tópica.
i) Derivados yodados: Son agentes oxidantes que se usan en forma de solución acuosa,
combinándolos con detergentes o sustancias orgánicas. Los yodoformos son compuestos que se
liberan progresivamente. El Yodo se encuentra en la polivinilpirrolidona (povidona yodada).
Existen también soluciones alcohólicas.
j) Alcoholes: Actúan desnaturalizando proteínas. Su acción es rápida pero se evaporan con

facilidad. El alcohol etílico se utiliza en antisepsia a una concentración del 70%, a esta
concentración se reduce más la tensión superficial de la célula bacteriana facilitando el proceso
de desnaturalización.

k) Fenoles: Actúan precipitando proteínas. El hexaclorofeno y el fenol no se emplean por su

toxicidad. Otros derivados fenólicos son los cresoles, los que unidos a jabones originan
compuestos estables.
l) Clorohexidina: Es un derivado fenólico que actúa alterando la permeabilidad de la membrana

celular bacteriana. Tiene inactivación rápida y es bien tolerado por la piel. Se emplea mucho en
hospitales en el lavado de la superficie cutánea en forma de solución (acuosa o alcohólica) o
asociada a detergentes no iónicos.
ll) Detergentes aniónicos: Actúan desorganizando las membranas citoplasmáticas. Tienen escaso
poder bacteriostático. Se pueden mejorar combinándolos con desinfectantes u otras sustancias
tensoactivas como laurilsulfato.
m) Detergentes cationicos: Tienen acción antiséptica, se inactivan en contacto con jabón, algodón
y materia orgánica. Son poco usados.
n) Glicoles: Propilenglicol y Etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos llamados

glicosatos o en forma de aerosoles para desinfección ambiental.
Los productos descritos como estériles deben satisfacer el ensayo de esterilidad. Estos productos
se esterilizan en su recipiente definitivo, excepto en los casos en que el producto, a causa de su
naturaleza, no pueda ser sometido al correspondiente tratamiento en su recipiente. Los productos
que no pueden ser esterilizados en su recipiente definitivo se preparan por métodos y en
condiciones determinadas para evitar contaminación microbiana después de someter a un proceso
de esterilización adecuada todos sus componentes, si es posible, así como los recipientes y
cierres.
La eficacia de los procedimientos de esterilización está notablemente influenciada por el grado

inicial de contaminación microbiana, debiéndose observar las precauciones siguientes
— Las condiciones de trabajo deben controlarse de forma adecuada tratando de evitar la

introducción y crecimiento de microorganismos,
— El nivel de contaminación microbiana de las materias primas, del equipo y de todo el
material utilizado debe ser el menor posible antes de la esterilización.
— Debe efectuarse un control microbiológico de las materias primas susceptibles de
presentar un nivel elevado de contaminación a causa de su naturaleza o de su modo de
preparación.
— Cada proceso concreto de esterilización debe ser validado.
— Los procedimientos y las precauciones empleadas deben ser tales que se alcance en el
producto final un nivel teórico de contaminación, correspondiente a no más de 1
microorganismo vivo por 1 x 10 exp6 unidades sometidas a la esterilización.

Para todos los métodos de esterilización, las condiciones críticas de la operación deben
controlarse de forma que aseguren que todas las unidades del lote hayan sido sometidas, al
menos, a las condiciones mínimas de esterilización.
La duración del tratamiento se mide a partir del momento en el que se consiguen las condiciones
prescritas para la esterilización en el conjunto de productos a esterilizar.
Esterilización por vapor. En el autoclave, la temperatura y la presión de vapor deben medirse

independientemente con una precisión superior a ± 2° C y a ± 10 KPa (0,1 atm) respectivamente;
preferentemente se debe obtener un registro continuo de estos parámetros. La temperatura debe
medirse en la parte más fría del autoclave que está situada generalmente cerca de la conducción
de salida del vapor. La temperatura debe medirse también, preferentemente, en dos o más
recipientes, situados en diferentes lugares del autoclave, de forma que las temperaturas medidas
representen en lo que cabe los valores extremos de todos los recipientes del lote.
Cuando es difícil que en un autoclave se consiga rápidamente el desplazamiento del aire por el
vapor (por ejemplo al tratar materiales porosos, textiles, utensilios de varios tipos), es necesario
evacuar el aire del autoclave antes de la admisión del vapor. La eficacia del procedimiento puede
ser confirmado por la utilización de indicadores biológicos apropiados.
Esterilización por calor seco. El horno debe normalmente estar provisto de un sistema de
circulación de aire forzado y llenarse de forma que se alcance una distribución uniforme de la
temperatura en toda la carga. La temperatura se debe medir y, preferentemente, registrar en al
menos dos lugares en los que haya menos probabilidades de alcanzar las condiciones de
esterilización. La eficacia del procedimiento puede confirmarse utilizando indicadores biológicos
adecuados.
Esterilización por radiaciones. Durante el procedimiento de esterilización, la dosis de radiación

debe ser controlada regularmente. Este control implica procedimientos dosimétricos,
independientes de la tasa de radiación, que permitan una medida cuantitativa de la dosis recibida
por el propio producto. Debe demostrarse que la dosis de radiación aplicada es eficaz y apropiada
para la naturaleza del producto a esterilizar y su material de acondicionamiento. La eficacia del
procedimiento puede ser confirmada por la utilización de indicadores biológicos adecuados.
El sistema de dosimetría se compara con la ayuda de métodos físicos, químicos o

microbiológicos con el mismo sistema dispuesto en una instalación de radiación de referencia.
Este control se efectúa cada vez que se realiza un cambio en los procedimientos de radiación y, al
menos, una vez al año.
Esterilización por gases. Los parámetros físicos y químicos significativos (tiempo, temperatura,
humedad relativa, presión, concentración del gas) deben medirse y registrarse con la mayor
frecuencia posible.
Los productos que no pueden ser esterilizados en su recipiente definitivo necesitan precauciones
especiales. Deben ser preparados en condiciones concebidas para evitar cualquier contaminación
microbiana. Los locales de producción y el sistema de ventilación deben estar diseñados para
reducir al máximo la contaminación microbiana y deben someterse periódicamente a un control
7

apropiado. El equipo, los recipientes y los tapones y, si es posible, los componentes deben ser
sometidos a un proceso de esterilización adecuada.
— Filtración a través de filtros que retienen bacterias. Las disoluciones pueden ser filtradas a
través de membranas de porosidad nominal inferior o igual a 0,22 µm, o a través de otro
tipo de filtro que retenga bacterias. Se deben tomar precauciones que aseguren el
mantenimiento de las propiedades del filtro durante su utilización. En el caso de la
filtración de un líquido en el que se pueda desarrollar un crecimiento microbiano, los
mismos filtros no deben ser utilizados si la duración del procedimiento es superior a un
día de trabajo.
— Preparación en condiciones asépticas. Los productos que se someten al proceso de
filtración descrito anteriormente y algunos otros, son preparados en condiciones asépticas.
Pueden someterse a un tratamiento final por el calor compatible con su termoestabilidad,
si este tratamiento se demuestra justificado. Las condiciones de preparación pueden, en
ciertos casos, ser controladas con la ayuda de un medio de cultivo apropiado, previamente
esterilizado repartido en las mismas condiciones que el producto a examinar; el medio se
incuba y después se examina a fin de descubrir una eventual contaminación.
Los indicadores biológicos son preparaciones de microorganismos seleccionados por su alta

resistencia a uno o más métodos de esterilización. Pueden utilizarse para confirmar la eficacia
de un proceso de esterilización. El indicador biológico tiene que ser claramente distinguible
del producto a esterilizar, con el fin de evitar cualquier mezcla o contaminación del producto.
El crecimiento de los microorganismos testigos que son sometidos al proceso de

esterilización demuestra que éste es insuficiente. Un indicador biológico puede estar
constituido por unidades del producto a examinar inoculadas artificialmente o por sustancias
fibrosas, arena, vidrio, láminas metálicas que sirven de soporte a los microorganismos testigo,
simulando los productos contaminados.
Los microorganismos testigo deben depositarse en sitios considerados como los más difíciles
de esterilizar. La elección de los microorganismos testigos se basa en los criterios siguientes:
a) La resistencia de la cepa testigo al método particular de esterilización debe ser grande,

comparada con la resistencia de todos los microorganismos patógenos y la de los
contaminantes microbianos del producto.
b) La cepa testigo no debe ser patógena.
c) La cepa testigo debe ser cultivada fácilmente.
Un indicador biológico se caracteriza por la cepa de microorganismos testigo que incorpora,

el número de unidades formadoras de colonias por unidad de indicador, el valor D (1) y la
fecha de caducidad. Sólo los microorganismos indicados deben estar presentes. Se debe
precisar toda la información referente al medio de cultivo y a las condiciones de incubación.

Esterilización por vapor. Las esporas de bacillus stearothermophilus, por ejemplo ATCC
7953 O CIP 52.81, se recomiendan como microorganismos testigos. El número de esporas
viables debe ser superior a 1 x 10 exp5 por unidad de indicador y el valor D a 121° C debe ser
de 11/2 min aproximadamente.
Esterilización por calor seco. Las esporas de Bacillus subtilis, por ejemplo var. niger ATCC
9372 0 CIP 77.18, se recomiendan como microorganismos testigos. El número de esporas
viables debe ser superior a 1 x 10 exp5 por unidad de indicador y el valor D debe ser a 160° C
de 5 a 10 min aproximadamente.
Esterilización por gases. Las esporas de Bacillus subtilis, por ejemplo var. niger ATCC 9372
0 CIP 77.18, o las esporas de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 o CIP 52.81, se
recomiendan como microorganismos testigos. Es esencial que el indicador biológico sea
capaz de revelar una humidificación insuficiente en el esterilizador y en el producto para
asegurarse que incluso los microorganismos deshidratados son inactivados.
Esterilización por radiaciones. Las esporas de Bacillus pumilus, por ejemplo ATCC 14884 ó
CIP 3.83, se recomiendan para una dosis mínima de 25 KGy (2,5 Mrad). EI número de
esporas debe ser de 1 x 10 exp7 a 1 x 10 exp8 por unidad de indicador y el valor D debe ser
de 3 KGy (0,3 Mrad) aproximadamente.
Otras cepas formadoras de esporas (mutantes de Bacillus cereus, por ejemplo SSI C1/1),
Bacillus sphaericus, por ejemplo (SSI C1A) que presentan una mayor resistencia, pueden ser
utilizadas para dosis de radiación más alta.
(1) El valor D es el valor de un parámetro de esterilización (duración o dosis absorbida)

necesario para reducir a un 10% el valor inicial del número de microorganismos viables. El
valor D sólo adquiere significación bajo condiciones experimentales bien definidas.
El ensayo de Esterilidad, se aplica a las sustancias, preparaciones y objetos que, según la

Farmacopea, deben de ser estériles, pero un resultado favorable solamente significa que no ha
sido encontrado ningún microorganismo en la muestra examinada en las condiciones del
ensayo. La extensión de este resultado a todo un lote de producto necesita la certeza de que
todas las unidades que lo componen han sido preparadas de tal manera que hay un alto grado
de probabilidad de que hubieran satisfecho el ensayo. Es evidente que esto depende de las
precauciones tomadas en el curso de la fabricación. Para los productos sometidos a un
proceso de esterilización en sus recipientes finales y sellados, la prueba física, con
fundamento biológico y registrado automáticamente que testimonia el correcto desarrollo del
tratamiento de esterilización en la totalidad del lote, es de una fiabilidad superior a la del
ensayo de esterilidad. Este último sin embargo es el único método analítico disponible para
cualquier autoridad que tenga que controlar la esterilidad de un producto.
Un ensayo de esterilidad debe realizarse en las condiciones estudiadas para eliminar todo
riesgo de contaminación accidental del producto en el curso del ensayo, por ejemplo
utilizando campanas de flujo laminar de aire estéril. Las precauciones tomadas para evitar tal
contaminación no deben afectar a los microorganismos cuya presencia deba ponerse de
manifiesto en el ensayo.
9

La eficacia de las precauciones observadas debe ser regularmente verificada por un control
del aire y de las superficies de trabajo, efectuando paralelamente controles de preparaciones
de las que se sabe que son estériles.
Los medios de cultivo adecuados para el crecimiento de bacterias anaerobias y aerobias y

para hongos, así como sus métodos de preparación se describen más adelante. Pueden
utilizarse otros medios siempre que haya sido demostrada su capacidad para asegurar el
crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Deben satisfacer los ensayos que se
indican, efectuados sobre cada lote de los medios elegidos, antes de utilizarlo, o
paralelamente al ensayo del producto a examinar.
Esterilidad. Se incuban en cada caso durante 7 días como mínimo, a 30-35 °C, porciones de
los medios destinados a evidenciar las bacterias y a 20-25° C, las porciones de los medios
destinados principalmente a evidenciar contaminación por hongos. No deben presentar
ningún crecimiento microbiano.
Propiedades nutritivas. Se siembran tubos de los medios escogidos respectivamente con 100
microorganismos viables aproximadamente (aerobios, anaerobios y hongos) y se incuban
durante 7 días como máximo a las temperaturas indicadas arriba (Esterilidad). El medio es
adecuado si permite un crecimiento rápido y abundante de los microorganismos que
correspondan.
Si el medio destinado principalmente a la búsqueda de hongos sirve también para el ensayo

de esterilidad bacteriana, debe ser sometido a un ensayo con ambos tipos de
microorganismos. Si en el curso de la incubación, el crecimiento microbiano es similar en
presencia y en ausencia del producto a examinar (crecimiento precoz y abundante), este
último no tiene actividad antimicrobiana y el ensayo de esterilidad puede ser efectuado sin
modificación. Si los cultivos que contienen el producto a examinar presentan un crecimiento
más débil, retardado, o totalmente inhibido respecto a los cultivos que no contienen éste
producto, éste último tiene una actividad antimicrobiana por lo que debe ser eliminado por
filtración, por dilución, o por neutralización, antes o durante el curso del ensayo de
esterilidad. La eficacia de la eliminación debe de ser controlada volviendo a repetir el ensayo.
CORDOBA, 12 de enero de 2007.
Teniente Coronel Veterinario SANTIAGO PABLO BAGGINI

JEFE del SERVICIO de BROMATOLOGÍA – HOSPITAL MILITAR REGIONAL CÓRDOBA
10

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Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que incativa microorganismos

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Estufa para ETO

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d) Nitrato de plata y derivados agénticos: Son buenos bactericidas. El nitrato de plata se ha

e) Derivados mercuriales: El más utilizado como desinfectante de la piel es el mercuriocromo, no

g) Permanganato de potasio: Agente oxidante que se inactiva en presencia de materia orgánica.

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n) Glicoles: Propilenglicol y Etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos llamados

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a) La resistencia de la cepa testigo al método particular de esterilización debe ser grande,

b) La cepa testigo no debe ser patógena.

c) La cepa testigo debe ser cultivada fácilmente.

Un indicador biológico se caracteriza por la cepa de microorganismos testigo que incorpora,

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(1) El valor D es el valor de un parámetro de esterilización (duración o dosis absorbida)

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Si el medio destinado principalmente a la búsqueda de hongos sirve también para el ensayo

CORDOBA, 12 de enero de 2007.

Teniente Coronel Veterinario SANTIAGO PABLO BAGGINI

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