TRATAMIENTO BIOLOGICO CON BASIDIOMICETOS DE LOS LICORES NEGROS DE

LA INDUSTRIA PAPELERA
L. Mesa Garriga(1), R. Santos Herrero(1), E. González Suárez(2), X. Gabarrell Durany(3), G. Caminal(3)
Centro de Análisis de Procesos. Facultad de Química-Farmacia. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.
Carretera a Camajuaní Km 5½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. teléfono 281164, leyanimg@qf.uclv.edu.cu
Centro de Innovación Tecnológica. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní Km
5½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. teléfono 205390
Departamento de Ingeniería Química. Universidad Autónoma de Barcelona. Bellaterra. Barcelona, España

Resumen
El licor negro que proviene del pulpeo con etanol del bagazo de la caña de azúcar, obtenido en un
digestor semipiloto de la papelera Sergio González de la provincia de Cienfuegos, es necesario para
su vertido al medio ambiente realizarle un tratamiento biológico debido a que presenta valores de
DQO superiores a lo establecido por la norma cubana, y baja biodegradabilidad, por lo que fue
tratado con los hongos de podredumbre blanca Phanaerochaete chrysosporium y Trametes
versicolor, para así determinar las condiciones necesarias para su detoxificación, reducción de color,
de compuestos aromáticos y de la demanda química de oxígeno (DQO). Se utilizó para medir color
y compuestos aromáticos un spectrophotometer PU 8620 uv/vis/nir a 440 nm y 280 nm
respectivamente en cubetas de cuarzo. La DQO se determinó por el método propuesto por el
Standard Methods y la toxicidad en el Microtox Systems de Microbiol Corporation, la presencia de
actividad enzimática se determinó a través de una versión del método de Paszczynski y et al. Los
principales resultados obtenidos con P. chrysosporium y T. versicolor son una reducción del 24% y
93% de la DQO, 36% y 92% de reducción de color respectivamente y una reducción de toxicidad
hasta valores no tóxicos en ambos casos.
No se pudo hallar la actividad enzimática con P. chrysosporium, pero si se determinó la presencia de
lacasa en el tratamiento con T. versicolor. La importancia principal de este estudio radica en la
disminución de la toxicidad de este efluente lo que permite su vertimiento al medio sin afectaciones
de este.
Palabras Claves: licor negro, P. chrysosporium, T. versicolor, color, compuestos aromáticos,
detoxificación.

Introducción.
Uno de los sectores industriales que contribuye sustancialmente a la contaminación ambiental es la
industria de la pulpa y el papel. Durante la producción de pulpa a través de proceso organosolv, el
licor negro obtenido tiene mayores valores de demanda química de oxígeno (DQO) que los
permitidos para su vertido al medio ambiente. Esta agua residual contiene principalmente lignina,
un biopolímero aromático, heterogéneo y complejo que protege a las plantas de los ataques
microbianos y de los insectos, además juega un rol estructural muy importante. La
biodegradabilidad anaerobia de este licor negro es baja debido a la presencia de lignina y sus
derivados. La baja biodegradabilidad y la toxicidad del licor negro sugieren una detoxificación y
facilitar su posterior degradación. (1,2,5)
El objetivo principal de este trabajo fue determinar las condiciones necesarias para lograr una
reducción de la toxicidad, de color y DQO a través de la degradación de la lignina que presenta este
efluente obtenido del pulpeo con etanol del bagazo de la caña de azúcar, con P. chrysosporium y T.
versicolor a escala de erlenmeyers.

Materiales y métodos
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Efluente
El efluente se obtiene a partir del pulpeo con etanol del bagazo de la caña de azúcar, de una fábrica
de papel para corrugar, de la provincia de Cienfuegos, Cuba. Este proceso se realiza en un digestor
semipiloto y se obtiene la pulpa para la fabricación del papel onda como principal producto y el licor
negro como producto secundario.
Las condiciones de operación en las que se obtuvieron la pulpa y el licor negro son:
Temperatura: 170ºC
Presión: 7 Kgf/cm2
Para la cocción del bagazo se prepara un licor blanco que tiene un 45% de etanol, 1,5% de hidróxido
de sodio, estos por cientos se utilizan en base a la masa de bagazo seca a cocer. Se trabaja con una
relación de licor de cocción: fibra seca 5:1.
El licor negro generado en las condiciones mencionadas tiene las siguientes características:
DQO 7150 mg/l Compuestos aromáticos 20.5
Sólidos Sedimentables 4.66 mg/l Sólidos Totales disueltos 918 mg/l
pH 7.3 Color 1.617
Contenido de glucosa 0.3 g/l Sólidos Totales suspendidos < 0.5 mg/l
Contenido de etanol 4.59 g/l EC50% 3.28% (ligeramente tóxico)

El licor negro no tiene suficiente nitrógeno y carbono asimilable para permitir el crecimiento de los
hongos, por lo que es necesario añadirle una fuente de carbono y nitrógeno adicional. Glucosa y
NH4Cl fueron añadidos como fuente adicional.
Producción del inóculo
El medio de crecimiento utilizado en Phanerochaete chrysosporium es el propuesto por Kirk y col.
(1978). La concentración de glucosa y de nitrógeno varía en dependencia del medio limitante.(6) La
cepa del P. chrysosporium es CECT 2777.
La obtención del micelio de Phanerochaete chrysosporium se ha obtenido a partir de la inoculación
de erlenmeyers de 500 ml con un volumen de medio de 100 ml de malta al 2%, con una
concentración final de esporas del orden de 105 esporas/ml. Se ha dejado a 25ºC y agitación orbital
(135 rpm). Después de 5 días se ha formado una densa capa de micelio, el cual se ha separado del
medio y se ha triturado hasta obtener un medio homogeneizado. A la suspensión resultante se ha
añadido el mismo volumen de solución salina (NaCl 0.8%).
Se ha añadido 10 ml de la suspensión de micelio obtenida en 90 ml de medio (25% licor negro).
Los erlenmeyers fueron dejados a una temperatura de 25ºC y 37ºC y una agitación de 135 rpm,
durante 5 días.
La suspensión micelial de T. versicolor (ATCC 42530)fue obtenida por inoculación de un segmento
de 1 cm de diámetro de la zona de crecimiento del hongo en agar malta al 2%, en 100 ml de medio
de extracto de malta 2%(m/v) en erlenmeyers. Los erlenmeyers fueron incubados a 25ºC y con una
agitación de 135 rpm. Después de 3 días una densa capa de micelio se ha formado, la cual fue
separada del medio de cultivo y se ha triturado con un homogenizador Polytron hasta obtener un
medio homogenizado. A la suspensión resultante se ha añadido el mismo volumen de solución
salina (NaCl 0.8%).
Se ha añadido 10 ml de la suspensión de micelio en 90 ml de medio (85% licor negro). Los
erlenmeyers fueron dejados a una temperatura de 25ºC y una agitación de 135 rpm durante 5 días.
Métodos analíticos
La Glucosa fue medida con un analizador de Glucosa y Lactato Model 2700 de la Yellow Spring
Instrument.

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La absorbancia de la muestra en el espectro ultravioleta a 280 nm en cubetas de cuarzo de 1 cm se
utiliza como indicador de la concentración total de compuestos aromáticos. Las muestras de agua
residual fueron filtradas y diluidas con tampón tetraborato 0,02 M a pH=9,1; se diluye para obtener
absorbancias inferiores a 0,8 unidades, corresponde diluir 0,030 ml de muestra en 2 ml de tampón.
La absorbancia en el espectro visible a 440 nm en cubetas de cuarzo de 1 cm se utiliza como
indicador del color. Las muestras de agua residual filtradas fueron diluidas en tampón tetraborato
0,02 M a pH=9,1 por tal que tuvieran una absorbancia inferior a 0,8 unidades, con una dilución de
0,100 ml de la muestra y 2 ml de tampón.
La Demanda Química de Oxígeno (DQO) se determina de acuerdo al método propuesto por el
Standard Methods.
La toxicidad se determina en el Microtox System de Microbics Corporation, basado en el porcentaje
de pérdida de la llama emitida por una bacteria biolumniscente (Photobacterium phosphoreum) al
ponerla en contacto con una muestra filtrada a pH 7. El valor de la EC50 medidas a los 5 minutos y
15 °C representa la concentración efectiva de muestra que causa un 50% de disminución de la luz
emitida. Las reducciones de EC50 se expresan como (EC50final-EC50inicial)/ EC50inicial.
Pruebas de actividad enzimática
La actividad de Manganeso peroxidasa fue medida usando una versión modificada del método de
Paszczynski et al, para la determinación de MnP donde el 2,6 dimetoxifenol (DMP) es oxidado por
la lacasa aun en ausencia de un cofactor. La oxidación por Manganeso peroxidasa requiere la
presencia de H2O2 como cofactor y Mn2+ catalíticamente activo. La unidad de actividad fue definida
en términos del número de micromoles de DMP convertidos en litros por minuto.
La actividad de LiP fue determinada por la oxidación del alcohol veratrílico. La unidad de actividad
fue definida en términos del número de micromoles de alcohol veratrílico convertidos en litro por
minuto.

Resultados y discusion
Los experimentos con P. chrysosporium fueron llevados a cabo en erlenmeyers de 500 ml,
utilizando 100 ml de medio que contiene un 25% de licor negro. Estos experimentos se realizaron
bajo 2 condiciones de nutrientes y temperatura para seleccionar las más adecuadas, una con medio
limitante de nitrógeno y otra con medio limitante de glucosa y a dos temperaturas a 25ºC y a 37ºC.
En estos experimentos se observó una elevada producción de biomasa después de 2 días. Los
experimentos se hicieron por triplicado.
Phanerochaete Chrysosporium
CECT 2777
Erlenmeyer

Temperatura 25˚C Temperatura 37˚C

Limitante glucosa Limitante Nitrógeno Limitante glucosa Limitante Nitrógeno

(Exp.1) (Exp.2) (Exp.3) (Exp.4)
Figura 1: Experimentos con P. chrysosporium.

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 Fig.2 P. chrysosporium, medio limitante de Nitrógeno a 37ºC, -♦- color, -■- Comp. Aromáticos
En estos ensayos no se detectó actividad enzimática (LiP o MnP). La capacidad para degradar
contaminantes de estos microorganismos no se limita a la presencia de LiP o MnP. En el
mecanismo utilizado para la degradación de algunos componentes, los pasos iniciales comienzan
con la formación de radicales libres intermediarios de alta reactividad, lo que pudo contribuir a
obtener los resultados finales. Al final de los experimentos se aprecia un aumento en el por ciento de
reducción de color y de los compuestos aromáticos, como se aprecia en la figuras 1,2,3 y 4. Además
en este caso el pH del medio se mantuvo primeramente en los valores cercanos a 5 luego ascendió a
6 descendiendo nuevamente y estabilizándose en valores de 5, con esto se puede decir que el acetato
utilizado como tampón en la composición del medio utilizado no tampona, el hongo lo consume.y la
mayor capacidad de degradar la lignina presente en el licor negro aumenta al disminuir el pH, así
que a pH 3 la degradación es el doble que a pH 4.5 y el cuádruple que a pH 6.5.(4)
Con P. chrysosporium se trabajaron estas dos temperaturas ya que a 37ºC es la óptima del hongo y
se probó para analizar los resultados y compararlos con los obtenidos a 25ºC, que es una de las
temperaturas reportadas en la literatura. En estos resultados obtenidos existen diferencias, ya que
comprobamos que con Phanerochaete chrysosporium creciendo a 37°C se obtuvieron reducciones
de color (38%), de compuestos aromáticos (34%) y de DQO (12%) mejores que cuando crecía a
25°C y el medio que más favorecía estas reducciones es el medio limitante de nitrógeno. Cada vez
que nos referimos a experimentos con P. chrysosporium estamos hablando que son a 37°C y en
medio limitante de nitrógeno por lo explicado anteriormente.
Se realizaron estudios con las enzimas LiP y MnP ya que con el hongo no fueron detectadas y los
resultados se muestran a continuación.

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 60

50

Reducción de color
40

30

20

10

0
0 0.2 0.4 0.6
LiP
Figura 3: Reducción de color en function de la LiP.
70
60
Reducción de color

50
40
30
20
10
0
-10
-20
0 0.2 0.4 0.6 0.8
MnP
Figura 4: Reducción de color en función de la MnP
Finalmente podemos decir, que las reducciones del color y de los compuestos aromáticos son
independientes de la enzima MnP, y se deben a otras enzimas diferentes a la MnP y/o la acción de
otros compuestos como el agua oxigenada y radicales libres. Los licores negros son sustratos muy
complejos y, seguramente, la reducción del color y de los compuestos aromáticos no es debida
solamente a una intervención individualizada, sino que ha de haber la suma de actuaciones de
diferentes especies y/o enzimas.
El licor es ligeramente tóxico (toxicidad 3.25) y al realizar la dilución con que se trabajó dio no
tóxico, pero al medir la toxicidad final de la muestra también hubo una disminución considerable de
este valor hasta 10.5

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Resultados con T. versicolor

100
90
80

Reducción (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 48 72 100 124 148
Tiempo (horas)

Figura 5: Reducción de color en el tiempo.

T. versicolor puede producir lacasa, MnP y LiP, solamente la lacasa fue detectada. Varios autores
han referido problemas con la determinación de la actividad de la LiP. Por ejemplo, Lobarzewski
encontró que la lignina, los lignocelulósicos y las ligninas solubles pueden reaccionar con
peroxidasas formando complejos y reduciendo o eliminando su actividad. Daniel et al, demostró
que la LiP puede formar estos complejos. Archivald arribó a una conclusión similar.

8 12
7 10
6
Laccase (UA)
Glucose (g/l)

5 8
4 6
3 4
2
1 2
0 0
6 50 81 100 110
Time (h)

Figura 6: Evolución de la actividad de la lacasa (●) y la glucosa (■ ).

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 100
90

Reducción del color (%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12
Actividad de l a lacasa (UA)

Figura 6: Correlación entre la actividad de la lacasa y la reducción del color.

La figura 6 muestra la relación existente entre la producción total de lacasa y la reducción de color.
Se encontró que este comportamiento puede ser representado por una ecuación lineal,
y = 34.77+ 5.533X (R2 = 0.9463) a un 99% de confianza
Esta correlación indica que la reducción del color depende en gran medida de la actividad
enzimática de la lacasa, lo que corrobora el mecanismo de acción de estos hongos; en una primera
etapa se absorbe el colorante y luego este es degradaddo en el interior del hongo por la enzima, en
este caso la lacasa.

Conclusiones:
El licor negro proveniente del pulpeo con etanol puede ser decolorado y detoxificado con P.
chrysosporium y T. versicolor y se aprecian mejores resultados con T. versicolor con la detección de
la actividad de la lacasa.

Referencias bibliográficas
1. Romero Solé, Sílvia.. Tractament amb fongs d'aigües residuals colorades. Tesis. Universitat
Autònoma de Barcelona. 2001.
2. Moreira, Maria Teresa.. Producción en contínuo de MnP por Phanerochaete chrysosporium y
Bjerkandera sp. B0S55. Aplicación al bioblanqueo de pasta de celulosa. Tesis. Universidad
de Santiago de Compostela. 1997
3. Gabarrell Durany, Xavier.. Tractament biològic de lleixius negres de paperera amb el fong
Phanerochaete chrysosporium. Tesis. Universitat Autònoma de Barcelona. 1995
4. Font Segura, Xavier.. Tractament de lleixius negres amb Trametes versicolor. Monitoratge
del procés. Tesis. Universitat Autònoma de Barcelona. 1997
5. Font Segura, Xavier; Caminal, Gloria; Gabarrell, Xavier; Romero, Silvia; Vicent, Teresa.
Black liquor detoxification by laccase of Trametes versicolor pellets. J. Chem. Technol
Biotechnol, 548-554, 2003
6. Kirk, Tk; Schultz E; Connors WJ; Lorenz LF and Zeikis JG, Influence of culture parameters
on lignin degradation by P. chrysosporium. Arch Microbiol 117:277-285, 1978.
7. Hammel, K.E, Fungal degradation of lignin. Ed. Anxet, Fungal Biotechnology, 1997.

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8. Paszczynski, A., Huynh, V-B and Crawford, R.L. Comparison of ligninase-I and peroxidase-
M2 from the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Archives of biochemistry and
biophysics 244, 750-765.
9. Pelaez, F., Martinez, M.J., Martinez, A.T, Screening of 68 species of basidiomycetes for
enzymes involved in lignin degradation. Mycol. Res. 99 (I): 37-42, 1995.

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