Estudio del metabolismo hidrocarbonado del aspergillus ochraceus bajo la influencia de agentes qumicos

POR EL

DR. NGEL ORTUO

Profesor Adjunto de la Facultad

MARTNEZ
de Ciencias

INTRODUCCIN La idea que nos indujo a realizar este trabajo de investigacin, iniciado en octubre de 1946, fu en principio de carcter prctico: la eliminacin de pectinas en los jugos ctricos por hidrlisis enzimtica (accin pectinsica) por medio de cultivos directos sobre los mismos, haciendo posible as la cristalizacin inmediata del cido ctrico que contienen. E n el desdoblamiento enzimtico de la pectina, ster metlico de grado de esterificacin variable de un cido poligalacturnico, intervienen, segn se conocen desde los trabajos de Ehrlich, dos enzimas, la pectinasa o poligalacturonasa, que desdobla por hidrlisis los enlaces glucosdicos entre los eslabones de cido galacturnico y la pectasa o pectinestearasa, que determina la saponificacin de los grupos carbometoxlicos con formacin de alcohol metlico y cido pectnico. r<cr>u

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Este proceso, tambin de inters en otro aspecto, el de la formacin y estabilizacin de jaleas y jugos de frutas, se realiza en la actualidad de

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NGEL ORTUNO MARTNEZ

un modo totalmente emprico, por fermentacin espontnea, sin controlar ni los gneros ni las especies de microorganismos que las producen. Nosotros elegimos en principio como material de trabajo dos especies de hongos: Penicillium chrysogenum y Aspergillus ochraceus. De ellos no se conoca en aquella fecha trabajo alguno en que se estudiase sus actividades sobre substratos pectnicos. nicamente Waksman y Alien (1) haban estudiado en 1933 un Penicillium, que no llegaron a caracterizar, y el Aspergillus nger, pero los resultados conseguidos no coinciden con los nuestros. Simultneamente a la comunicacin de nuestros primeros resultados (abril de 1948) (2), conocimos un trabajo de Phaff (3) en el que estudia la actividad de una cepa de Penicillium chrysogenum sobre substratos pectnicos, encontrando que producen pectinasa; y- otros de Gumann (4) en los que se ocupan del comportamiento enzimtico del Aspergillus niger, observando la produccin de pectinestearasa por el hongo, solamente en presencia de pectina. Posteriormente a dicha fecha se encuentran citados en la bibliografa otros trabajos sobre este tema, as Beavan y Brown (5) investigaron las enzimas pcticas del hongo Byssochlamys fulva sin conseguir caracterizar la presencia de dichas enzimas. Eleanor J. Calesnick y otros (6), estudian el comportamiento de la pectinestearasa procedente de hongos, la que consideran distinta de la producida por plantas superiores. Jermyn y Tomkins (7) determinan la marcha de la hidrlisis del cido pctico, producida por poligalacturonasa procedente de hongos, cromatografiando sobre papel los fragmentos de la misma. Holdenn (8) utiliza poligalacturonasa de hongos sobre fibras de hojas de tabaco y Reid (9), finalmente encuentra, en el Byssochlamys estudiado anteriormente por Beavan, arnbas enzimas. Tambin se han observado en los ltimos aos enzimas pectnicas de origen bacteriano por Raynaud, Woodi y Talboys (10) (*). Todos estos trabajos son posteriores a la publicacin de nuestra segunda comunicacin (11), en la que estudiamos el comportamiento de las pectinasas y poligalacturonasas aisladas.de los citados hongos. De la comparacin entre las actividades de ambos hongos, as como de las enzimas pectinsicas segregadas por ellos, hemos deducido, en principio, un comportamiento anlogo, que se diferericia cuantitativamente con una mayor actividad en las enzimas producidas por el Aspergillus ochraceus.
(*) Wolf recoge en una tabla las enzimas producidas por hongos parsitos sobro la madera; entre aqullas la pectinasa. {The Fungi, p. 46, T. II, New York, London, 1947).

METABOLSMO

HIDROCARBNADO

DEL

ASPEfGILLS

OClfACES

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Este hecho nos llev a una generalizacin ~y particularizacin simultnea en nuestra labor; ya que, por una parte, la continuamos limitndonos a slo la especie de Aspergillus, y por otra, la ampliamos a un estudio general y detallado sobre dicha especie, extendindonos preferentemente en la influencia de diversos agentes qumicos sobre la morfologa macro y microscpica del hongo y las relaciones de las mismas con la actividad metablica, apreciada sta desde diferentes puntos de .vista y siempre empleando como medios de cultivo substratos hidrocarbonados. Nuestra hiptesis, como instrumento de trabajo,, est fundamentada en los modernos conocimientos de la Biofisicoqumica. Para explicar los. diversos fenmenos de la materia protoplasmtica de los hongos, consideramos dos estructuras qumicas en continua alteracin : por una parte, la correspondiente a la unidad viva, y por otra, la composicin qumica del medio ambiente en que se desarrolla.

BIBLIOGRAFA
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
(11)

WAKSMAN, S . A . y ALLEN, M . C . : J. Am. Soc. 55 - 3408 - (1933). SoLRR, A. y OnTuo. A . : An. B. Soc. F. y Q, 4 - .511 - (1948). PiiAFF, H. J-. : Arch. Biochcm. l - 67 - 81 - (1947) en C/icm, /l)s. - (1947) - G.301. GAUMAN, E . y EHIKA BonNi: Hclv. Chim. Acia. 30 - 1 5 9 1 - (1947). BEAVAN, G . H . y BBOWN, V.: Biochcm. J. 5 - 221 - (1949). CALESNICK, E . J . y o t r o s : Archiv. Bioch. 29 - 432 - (1950), en C. /t. - (1951). JEOMYN, M . A . y TOMKINS, R . G.: Biochem. J. 47 - 437 - (1950). HOLDENN, M . : Biochcm. J. 47 - 415 - (1950). RED, W . W . : Nalure 166 - 76 y 569 - (1950). RAYNAUD : ' / ( n n . Ins. Posiciir, - 77 - 341 - (1949), en C. A. (1951) - 210.
SOLER, A. y ORTUO, A.: An. f. Soc. F. y Q. 40 - 741 - (1950).

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METABOLISMO HIDfOCAfBONADO DEL ASPEfGlLLUS OCHRACEUS

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ESTRUCTURA BIOFISICOQUIMICA DE LOS HONGOS

EL

PROTOPLASMA

Planteamos la organizacin qumico-fsica del protoplasma de los hongos no como un lquido desprovisto de estructura, ni un saco repleto de una solucin coloidal o enzimtica, sino un complejo sistema disperso integrado por tina vasta formacin de partculas: iones, molculas y agregados moleculares, formando un sistema coloidal de fases numerosas con diversos grados de estructura comprendidos desde la organizacin macroscpica hasta la inframiscroscpica, existiendo elevadas organizaciones estructurales biocatalticas con distribuciones espaciales apropiadas y las ms favorables orientaciones moleculares. Qumicamente, todo el conjunto protoplsmico est integrado por albuminoides, nucleoprotedos, fosfoprotedos, lipoides, grasas, hidratos de carbono, cidos, sales, etc., pero las protenas con los lquidos y el agua representan los principales componentes. El protoplasma est diferenciado en orgnulos: ncleos, nucleolosomas, condriosomas (diferenciados n mitocondrias, condriomitos y condriocontos), dictiosomas y microsomas, en los que las propiedades dependen de su constitucin qumica y de su grado de dispersin. Las reacciones qumicas en regiones particulares del protoplasma marchan a la par con sus diferenciaciones estructurales, constitucin qumica y grado de dispersin. En el lmite entre el citoplasma y cada uno de los orgnulos del protoplasma existen tenues membranas lipoideas de naturaleza tonoplsmi-

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ANGBL ORTUO MARTNEZ

ca, que se interponen entre el orgnulo y el citoplasma. Tienen notables propiedades de semipermeabilidad, oscilante y selectiva, susceptibles de variar, ya por la proporcin inica, bien por la cantidad y naturaleza de fosfolpidos que fijen y por la orientacin-de los grupos hidrfilos y lipfilos, acidfilos, y basfilos, en sus superficies interna y externa. La naturaleza protenica de estos orgnulos es especfica, propia y con enlaces y terminaciones qumicas diferentes unos de otros. Cada uno de ellos es, en cierto modo, autnomo dentro del conjunto; pero lio puede existir fuera de ste. Los virus pueden ser considerados como elementos de esta natiuraleza y que, por tanto, slo en el seno citoplsmico pueden multiplicarse; pero fuera de l conservan su vitalidad latente. Las relaciones qumico-fsicas entre piezas protoplsmics tan distintas se establecen por la masa viva citoplsmica general, en la que todas estn incluidas. La actividad qumica entre el citoplasma general y sus distintas partes diferenciadas, as como en el seno de cada una de ellas es realizada, ordenada y dirigida por agentes qumicos catalticos. El protoplasma de los hongos es un sistema organizado, delicadamente equilibrado de materias qumicas complejas combinadas en ciertas proporciones y patrones, interaccionando armoniosamente y desarrollando ciclos de vida largos y variados. La actividad bioqumica del protoplasrna de los hongos no es efecto de la organizacin de un conjunto de protenas en red complicada, sumergida en fase dispersante no menos compleja, sino que resulta .de las reacciones o acciones mutuas entre sistemas heterogneos, tales como los componentes del 'citoplasma y ncleo, que puestos en presencia producen series continuas de procesos vitales. Los caracteres exhibidos por los hongos estn determinados por la constitucin y composicin qumica del protoplasma y por las condiciones del medio ambiente, externo e interno, en cooperacin con los cuales dicho protoplasma emprende su desarrollo. La especificidad en la composicin de los hongos se corresponde con la especificidad morfolgica. Todo cambio morfolgico es precedido por un cambio qumico que es su inmediato determinante. . En los hongos, el conidio o espora es un sistema protoplsmico que realiza el desarrollo de la mayora de los caracteres exhibidos por la especie a que pertenece, pero en realidad no son transmitidos en el sentido literal de la expresin: ellos se desarrollan de nuevo en cada generacin. El sistema protoplsmico que realiza este desarrollo es en s una herencia directa de la generacin anterior; por lo tanto, lo transmitido es una masa de protoplasma capaz de desarrollar los caracteres bajo condiciones de ambiente apropiadas. Dado que cada generacin comienza como

METABOLISMO HIDROCARBONADO DEL ASPERGILLUS OCHRCEUS

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una porcin de protoplasma derivado de la generacin anterior, es. de esperar semejanzas entre las dos bajo condiciones uniformes de ambiente. E n los hongos, el citoplasma participa en la determinacin de los caracteres. Los ncleos nunca se desarrollan solos: siempre^ es un sistema nucleocitoplsmico el que experimenta el desarrollo. Cuando el citoplasm a asociado con el ncleo es alterado, los caracteres tambin se alteran, mostrando la importancia de la interaccin ncleocitoplsmica en el desarrollo del carcter. D e aqu que, en lneas puras el citoplasma contribuye a la semejanza de stos, y la semejanza es un aspecto principal en la herencia. La insistencia en considerar al ncleo como un sistema de elementos necesarios para el desarrollo y su organizacin cromosmica como la clave del fenmeno mendeliano, est seguramente garantizado, pero ello no debera obscurecer el hecho de que (da base fsica de la herenciai\ en un sentido amplio,- incluye todos los elementos protoplsmicos relativamente estables que afectan el carcter desarrollado, donde quiera que estos elementos estn localizados, ya sea que su actividad resulte en semejanza o desemejanza de los caracteres. A u n q u e nos inclinramos a considerar el protoplasma de los hongos como un medio de cultivo en el cual el ncleo de alguna manera elabora los caracteres, debe recordarse que este medio, aun ms que los mismos caracteres, es heredado directamente de las generaciones anteriores. Las protenas de la materia protoplsmica de los hongos estn constituidas por cadenas de a-aminocidos unidos por enlaces carboamdicos, originando cadenas de polipptidos de longitud considerable. Estas cadenas son prcticamente indiferentes desde el punto de vista qumico, apenas si son capaces de reaccionar con otros compuestos, pero ellas determ i n a n realmente la estructura del protoplasma. Este hecho es consecuencia de la presencia de las cadenas laterales y sobre todo de los grupos localizados en las mismas. D e estos. grupos depende el comportamiento de la molcula frente al agua y otros constituyentes del protoplasma, como en la formacin de la red molecular constituida por acoplamiento de varias cadenas polipeptdicas inicialmente independientes. As, los fosftidos se adicionan a los grupos lipfilos e hidrfilos form a n d o complejos, en los que la unin no est determinada por fuerzas de valencia, pues se pueden separar de nuevo los fosftidos por medio del ter. T a m b i n los esteroides se unen con los polipptidos con intervencin de enlaces hidrgeno, siendo mayor la capacidad de fijacin de las lecitinas que de, las esterinas, ya que las primeras poseen dos grupos po-

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NGEL ORTUi^O MARTNEZ

lares y las segundas no presentan, naturalmente, carcter polar. En las esterinas tambin debe tomarse en consideracin la posibilidad de formacin de esteres con intervencin de sus funciones alcohol y de los carboxilos libres sobre las cadenas polipptdicas. Las grasas no reacionan con los grupos funcionales en cadenas laterales y nicamente se puede admitir, un acoplamiento de tipo de enlaces de Van der Wals entre los radicales alqulicos del cido graso y las cadenas laterales no sustituidas del polipptido. El acoplamiento entre molculas de polipptidos, originando lo que hemos llamado red molecular, se realiza por intermedio de las citadas cadenas laterales pudiendo originar estructuras de variada estabilidad. Estas estructuras pueden ser consecuencia de la formacin de los siguientes tipos de enlaces: a) Enlaces de Van der Waals entre cadenas laterales no sustituidas. b) Enlaces por acoplamiento de dipolos o formacin de puentes hidrgeno, como los que se producen entre, grupos oxhidrilos alcohlicos. c) Enlaces inicos consecuencia de la salificacin de los carboxilos libres de una cadena con los grupos amino de otras. d) Enlaces no polares con formacin de nuevos grupos funcionales no disociados como el ster a partir de carboxilo y oxhidrilo alcohlico de cadenas diferentes, el amdico formado por carboxilo y amino, y finalmente el disulfuro orgnico originado en la oxidacin de dos grupos tiol vecinos.

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Pero al aproximarse las cadenas de polipptidos como consecuencia de los anteriores tipos de enlaces, entran en juego, reforzndolos, los acoplamientos entre las estructuras doble ion que colabgran en el sistema

MUTAliOUSMO

inOnOCAfliONADO

DEL

ASPlnClLLUS

OCHIUCEUS

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resonante del enlace carboamdico (*). Ellos originan redes tridimensionales. _ (_, O O
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E n nuestro criterio este ltimo tipo de enlace intermolecular ser el de mayor importancia para la estabilizacin de la citada red protoplsmica, ya que si bien las energas ligadas a los enlaces entre cadenas laterales son mayores, estos tipos de enlaces sern, a partir de simples consideraciones estadsticas, menos frecuentes. La red molecular albuminoidea determina espacios o alvolos abiertos, ocupados por el jugo celular y en los cuales se introducen las cadenas laterales libres, sumergindose en el jugo. Es ste un lquido acuoso complejo, en que hay electrlitos junto a micelas ms o menos grandes, de albuminoides, de hidratos de carbono, de cuerpos fosforados, de lipoides, etc. Estos distintos elementos del jugo estn en agitacin desordenada y perpetua por el movimiento browniano y, a la vez, movindose con u n cierto orden, en obediencia a las fuerzas de sus cargas elctricas. El movimiento browniano impide que, en caso alguno, pueda llegarse a u n a disposicin equilibrada, estable, en la ordenacin de tan diversas partculas. Esto, sin duda tiene gran importancia para la actividad viviente, con sus caractersticas de continuidad. . E n los alvolos, las afinidades especiales de los grupos libres de los aminocidos o de otros ligados a la red, atraen con especial energa a determinadas partculas, a la vez que otras son rechazadas. Las molculas dipolares de agua se concentran sobre los grupos hidrfilos, orientndose como lo haran pequeos imanes, para formar la capa acuosa con su carga correspondiente. Por el contrario, las molculas de agua son rechazadas por los grupos hidrfobos o lipfilos, a cuyo alrededor se disponen los
(*) Brill p r o p o n e m i s q u e un acoplamionlo fie dipolos, u n enlace e n t r o oxgeno y nitrgeno por p u e n t e de liitlrgeno, liiptesis tamijicn admitifla por A. Frey-Wyssling, pero a la q u e basta o p o n e r el lieclio ce la existencia de propiedades n i c d n i c a s tan b u e n a s como en las poliainidas de a m i n a prirviaria (cu las q u e por no poseer cadenas laterales, s o l a m e n t e e n t r a n en j u e g o en la estructura s u p e r m o l e c u l a r los g r u p o s amida), en las de a m i n a secundaria, como por ejemplo las derivadas de la piperaciua

.CHjCHjv -C-N( )N-CII ^CH^-CH/ I I O O

q u e por carecer de h i d r g e n o sobre Alomo de n i t r g e n o , no pueden crear el puente propuesto.

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lipoides y cuerpos de propiedades anlogas, probablemente orientndose de modo a dirigir hacia el grupo la porcin de su molcula ms fuertemente lipfila. As en los lmites entre alvolos de una y otra tendencia las molculas y micelas complejas se orientarn formando una capa, que dirige hacia el lado hidrfilo los grupos cidos, oxhidrlicos, aldehdicos u otros de estas propiedades que pueda contener; y hacia el alvolo lipfilo se dispondrn los radicales alqulicos y fenlicos, de propiedades hidrfobas. As nos explicamos la disposicin y modo de formacin d las membranas tonoplsmicas de tan notables propiedades de semipermeabilidad selectiva. Las molculas albuminoideas en suspensin en el jugo pueden disponerse en pelculas de esta naturaleza, orientndose de forma que sus cadenas laterales estn en sentidos opuestos segn sean hidrfilas o lipfilas. Los cationes tienden a dirigirse a los grupos cidos de las ramas laterales libres de la red, y los aniones hacia los bsicos. Su desplazamiento est influido por el espesor de la respectiva envoltura acuosa (que es distinta, segn la naturaleza del ion), por la viscosidad del jugo, variable de un punto a otro, y por las perturbaciones que, en su marcha, producen los repetidos choques del movimiento browniano. Ellos, adems, tendrn que atravesar aquellas pelculas o finas capas, formadas como hemos dicho antes. En el jugo protoplsmico de los hongos, la expresada heterogeneidad en la distribucin de iones y partculas determina valores de tensin superficial distintos de un punto a otro. Esto dar lugar a la formacin de capas de separacin, membranas de gran fragilidad, de naturaleza distinta a las antes mencionadas; pero que dividirn los alvolos ya dichos en otros ms pequeos y ms inestables, en continua variacin, siguiendo las modificaciones fsico-qumicas del punto considerado. El protoplasma tiene, a la vez que la estructura fibrilar y reticular debida al enlace de las grandes cadenas protenicas, otra alveolar determinada por las membranas de orientacin .molecular; y estos alvolos divididos en otros ms pequeos con aspecto de finsima espuma que se deshace y rehace continuamente, son los producidos por la tensin superficial. El valor de la presin osmtica depende nicamente del nmero de partculas (sean iones, molculas, micelas), que la solucin o pseudosolucin contiene. Como en el jugo protoplsmico, aquel nmero vara de un punto a otro y de un momento a otro, igualmente variar la presin osmtica. Una circulacin hdrica y otra inica existir por esta causa a travs de los alvolos y en sentidos diversos segn los momentos. Esta circulacin al determinar variaciones en la concentracin de sus-

METABOLISMO HWROCARBONADO

DEL ASPERGILLUS

OCHfACEUSn

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tancias disueltas, ocasiona cambios, en los grados de imbibicin, absorcin y adsorcin de las cadenas principales y de sus ramas, con las consiguientes variaciones de pH y condiciones fsico-qumicas en general. Se deduce, por la constitucin de la red protoplsmico y del jugo que la baa, que no puede existir un pH idntico en todos los puntos de este jugo, ni el pH tendr un valor constante para cada punto o cada alvolo. Por lo tanto, todas las propiedades de las cadenas albuminoideas que dependen del pH del medio dispersante varan de una zona a otra, aun dentro de la misma cadena, de un momento a otro de la dimensin tiempo y de una temperatura a otra, en lo que considerablemente influye la agitacin browniana. Variando el pH en los pequeos espacios alveolares, una cadena albuminoidea est sometida a valores distintos a lo largo de su eje principal. En alguna de sus zonas puede hallarse en su punto isoelctrico, el de mxima solubilidad. En otras, un pH separado de la zona neutra puede determinar su ruptura o fragmentacin y fijar grupos terminales en los extremos resultantes. As, una cadena podr dividirse en dos; pero tambin podr descomponerse, para ser despus completamente desasimilada. En sta, como en cualquier otra condicin fsica o qumica, se mantiene en la sustancia viva una continua actividad dinmica. En el jugo hay sustancias qumicas que funcionan como amortiguadores, tendiendo a corregir las variaciones bruscas; ellas no impiden el cambio, sino que lo amortiguan, actuando como freno. Por adsorcin, la cadena retiene un cierto nmero de iones de determinada naturaleza. Pero aquellos cambios en el valor del pH determinan consiguientes variaciones en esta adsorcin selectiva, dando lugar a que unos iones sean reemplazados por otros. Iniciado el cambio en un punto, el fenmeno influir sobre el punto siguiente, ste determinar la variacin del sucesivo y, de esta manera, pueden establecerse corrientes inicas a lo largo de las cadenas o de fascculos de cadenas. Los iones que se desplacen pueden ser grandes micelas o iones coloidales que arrastren tras si sus envolturas acuosas y las sustancias que retienen. Si las condiciones determinantes del desplazamiento persisten, afectan a la vez a varias cadenas, y si se continan en un determinado sentido, se producir una corriente citoplsmica y hasta una verdadera circulacin intracelular. Aunque en razn a las condiciones de heterogeneidad que hemos descrito no hay reposo posible dentro del protoplasma viviente de los hongos, las corrientes citoplasmticas visibles al microscopio, tan ostensibles en algunos casos, slo podrn establecerse cuando sean muchas las cadenas afectadas y todas ellas en el mismo sentido.

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En el protoplasma los grupos laterales fijan compuestos fosforados de diversos tipos y, entre ellos, fosfolpidos. De estos, algunos actan como protectores; otros como filtros selectivos, que dejan llegar al grupo determinadas sustancias y rechazan otras; o bien son enzimticos y funcionan como fermentos en la sntesis de sustancias orgnicas determinadas. La extraordinaria sensibilidad a los estmulos deriva de tan gran inestabilidad y heterogeneidad. Pero se precisa una ordenacin adecuada de las cadenas y de sus grupos funcionales en un orden y sentido prefijados. Los estmulos mecnicos, fsicos o qumicos provocan determinados cambios en la posicin y distribucin de iones que, propagndose a lo largo de las cadenas protenicas o de las fascculos de cadenas, despiertan actos o reacciones, a veces muy intensas y en regiones amplias y muy distantes del lugar estimulado. La modificacin determinada por los estmulos puede traducirse en deslizamientos de los iones a lo largo de las cadenas o de sus ramas, segn hemos explicado. Pero tambin puede consistir en movimientos ondulatorios, rtmicos de los iones, sin verdadero desplazamiento. Todo lo dicho nos induce a admitir que en el protoplasma en toda clula de los hongos la coordinacin funcional entre sus distintas partes u orgnulos ser mantenida, principalmente, por corrientes oscilatorias inicas en las cadenas de protenas, como igualmente la coordinacin externa, con las condiciones, siempre variables, del medio. Se ha comprobado la necesidad de la presencia de los iones K, Na y Ca en proporcin equilibrada. Separadamente son txicos; pero no reunidos en la relacin orgnica porque su efecto es antagnico. Antagnico es tambin su papel en la regulacin de la permeabilidad de las membranas; el Na"*" es el que ms hace aumentar esta permeabilidad; el Ca^+ la disminuye.

EL

NCLEO

El ncleo no puede ser considerado como un simple orgnulo protoplsmico, sino como un conjunto o reunin de orgnulos diversos que integran un sistema relativamente voluminoso y claramente delimitado. Las protenas existentes en el ncleo se caracterizan por su gran complicacin estructural. Sin embargo, los polipptidos que resultan en sus degradaciones son de estructura poco complicada. Por hidrlisis de estos polipptidos se obtiene una gran cantidad de aminocidos bsicos (arginina, lisina, histidina). Adems de los polipptidos existen en los ncleos los cidos nucleicos, tambin de estructura catenaria. Los cidos

METAROU&MO

HIDROCAfBONADO DEL ASPERGILLVS OCIIIUCEUS

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nucleicos se encuentran unidos a. las protenas formando los nucleo-"^^-^Na^ proteidos. El cido nucleico est compuesto de grupos qumicos de tres tipos principales: a) grupos de cido fosfrico. b) grupo de hidrato de carbono, pentosa (algunas veces hexosas). c) y las bases purnicas y pirimidnicas. El cido nucleico, como las protenas, con las cuales est asociado, tiene la notable capacidad de formar cadenas largas. E n ciertos estados una forma de cido nucleico puede ser identificado en el nuclolo y en algunos casos en el citoplasma. U n nucletido importante es el cido adenlico, que, por hidrlisis, da cido fosfrico, ribosa y adenina. T a m b i n tienen m u c h a importancia los cofermentos de W a r b u r g y Euler, que se componen de dos o tres molculas de cido fosfrico, dos de ribosa, una de adenina y una de nicotinamida. Los mononucletidos se encuentran esterificados entre s, formando los polinucletidos. As, el cido zimonucleico, que aislado de la levadura, est formado de cuatro mononucletidos. Este cido no existe solamente en el ncleo, tambin en el citoplasma. Los polinucletidos de los ncleos celulares se diferencian de los del citoplasma porque una parte de sus nucletidos no dan ribosa por hidrlisis, sino que su pentosa es la desoxirribosa o timinosa. Esta desoxipentosa es qumicamente anloga a la ribosa, estando sustituido el grupo O H del segundo tomo de sta por un tomo de H . Esta pequea variacin en la estructura qumica hace a los polinucletidos del ncleo m u c h o ms sensibles a la hidrlisis que los del citoplasma. Los polinucletidos nucleares tienen una tendencia mayor que los del citoplasma a polimerizarse, originando cadenas muy largas de estructura m u y uniforme. L a consistencia fsica del ncleo en conjunto depende como es obvio, de la consistencia y proporcin relativa de sus diversos componentes: membrana, cariolinfa y cromonemas. E n un campo elctrico los ncleos libres o clulas m u y ricas en material nuclear, tienden a dirigirse al nodo, demostrando que llevan una carga negativa mientras que el citoplasma o clulas con poca cromatina tienden a dirigirse en sentido contrario. E n el ncleo, la cromatina es la que lleva la carga negativa, siendo positivas la cariolinfa y c o m n m e n t e los nuclolos. Las nucleoprotenas que forman parte de la constitucin del ncleo, entran en l en proporcin mayor que en el citoplasma. Son especficamente distintas de las que intervienen en la red citoplsmica; y tambin las

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condiciones fsico-qumicas del jugo nuclear difieren de las del citoplsmico. El ncleo posee una sustancia vida por los colores bsicos. Es poco atacada por las enzimas proteolticas, siendo difcil su dispersin por autolisis; pero se reconoce una diastasa, la nucleasa, que la dispersa fcilmente. En el seno del ncleo se halla el nuclolo (o nuclolos). En su constitucin entran principalmente una protena que no se tie con la hematoxilina frrica y un ster sulfrico de un polisacrido, que es coloreable. El nuclolo es basidfilo. Est constituido por nucleoprotenas, pero sin cido nucleico libre.

Papel de los cido nucleicos Se ha credo que los cidos nucleicos son las sustancias de las que depende la herencia, pero su constitucin qumica es relativamente uniforme, faltndole la variabilidad y la diversidad que la Gentica exige. Por ello, los cidos nucleicos slo desempean un papel de carcter protector en la divisin nuclear. Anlogamente, los grupos fosfricos de los cidos nucleicos podran proteger, unindose con ellos, a algunas configuraciones atmicas lbiles de la cadena proteica, impidiendo as su destruccin durante el proceso de reparticin de los cromosomas. Loustau considera que el cido nucleico acta como protector de las cadenas laterales, atrado y retenido con mayor o menor energa, segn las condiciones del momento. Por ello pueden conservar su constitucin particular a travs de las vicisitudes por las que pasan aquellos orgnulos cromticos durante los procesos de la reproduccin. La proteccin ser ms o menos eficaz segn sean las especiales propiedades qumicas de cada grupo funcional de la rama. El rgano productor de muchos fermentos es el ncleo. A sus elementos constituyentes o nucleolosomas se les supone los formadores de las enzimas que realizan el primer encadenamiento de aminocidos. Estas primeras cadenas o pptidos son despus moduladas por la accin enzimtica de los genes, dotndolas de cadenas laterales. Las molculas albuminoides que atraviesan la membrana nuclear constituyen las micelas albuminoideas que son modificadas por los fermentos microsmicos y transformadas en protenas citoplsmicas.

METABOLISMO IIIDROCARBONADO DEL ASPEfGILLUS OCHfACES

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LOS

CROMOSOMAS

Los cromosomas estn formados por cadenas de las protenas nucleares especiales, con estructura inframicroscpica, semejante a la que hemos descrito para el citoplasma; pero ms densa. Los enlaces o puentes de esta red protenica cromosmica son distintos de los citoplsmicos y sus cadenas laterales predominantemente bsicas. El material que forma los cromonemas, que son constituyentes importantes de los cromosomas, es principalmente una nucleoprotena, form a d a por protena y cido nucleico. Este material, m u y coloreable, ha sido llamado nuclena, o ms c o m n m e n t e cromatina. Las protenas que la forman son relativamente simples. Los cidos nucleicos y las protenas absorben los rayos ultravioletas con desigual intensidad. Aplicando esta tcnica al estudio de los cromosomas se h a demostrado que el funcionalismo de los cromosomas se debe, desde un punto de vista qumico a las interacciones entre los polipptidos del retculo y los cidos nucleicos. Las cadenas laterales de los polipptidos son el substrato de los genes, siendo el gene una configuracin atmica especifica existente en las cadenas laterales. L a participacin longitudinal de los cromosomas en la mitosis, formndose dos cromosomas iguales, sera la separacin de dos cadenas paralelas e iguales de polipptidos. El intercambio de genes sera qumicamente la separacin de u n grupo atmico de una cadena lateral, que pasara a combinarse con otra cadeia lateral de otro polipptido. Los estudios de absorcin de rayos ultravioletas conducen a la conclusin de que las bandas cromosmicas estn compuestas de uno o ms discos de granulos cromosmicos que se extienden a travs del cuerpo cilindrico del cromosoma. Estos granulos se denominan crommeros, aunque su variacin en tamao y nmero, aun en una banda dada, indica que aqu este trmino no designa unidades del mismo rango. E l cromosoma consta de im gran nmero de cromonemas que se han multiplicado mientras el ncleo creca sin que ninguna mitosis los separara; sus crommeros quedan estrechamente asociados o unidos lateralmente como discos. L a estructura ms fina de los cromosomas es actualmente un tema m u y discutido, aunque se est de acuerdo en que las bandas transversales son aspectos naturales que tienen la utilidad citogentica. U n hecho de la ms grande importancia es que las bandas forman u n patrn que es constante para un cromosoma dado. D e particular importancia es la naturaleza qumica de los filamentos cromticos y de los cromosomas, de los cuales aquellos son los principa-

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ANGIL

OfTUiVO

MAIITINBZ

les constituyente, ya que principalmente, de su composicin depende el propio poder del ncleo, determinando el curso del desarrollo y los fenmenos de la herencia. Cuando tiene lugar la reproduccin, los cromosomas son transmiti. dos a la generacin siguiente a travs de las esporas. Su composicin fsico-qumica es tal, que ellos tienen efectos especficos y profundos sobre el curso del desarrollo y, por lo tanto, sobre los caracteres de los hongos. Como una consecuencia de todo esto, juegan u n papel principal en la herencia. Cada cromosoma debe ser considerado como un individuo persistente que se reproduce slo por divisin y en este sentido mantiene su individualidad a travs de los sucesivos ciclos nuclear y vital. E n cada ciclo nuclear pasa a travs de una serie de alteraciones, los que pueden oscurecer su continuidad, aunque no quitarle validez. N o h a y comprobaciij de que las masas individualizadas de matriz persistan, pero todas las pruebas obtenidas indican que el cromonema persiste con su diferenciacin longitudinal caracterstica en estructura y funcin. Los cromonemas en el estadio metablico estn relativamente libres de la matriz envolvente y ms expuestos a los otros materiales nucleares, lo que indica que los cromosomas ejercen sus efectos sobre las actividades de las clulas principalmente en este momento. Los diversos materiales nucleares o unidades elementales necesarios para la vida del organismo, son llevados casi en todas partes en varios cromosomas ms bien que en uno solo o en gran nmero. Este pequeo grupo o genomo, se considera como un sistema organizado de miembros interdependientes, y no como una coleccin simple de materiales. La cariolinfa consta principalmente de protenas no tan polimerizadas como las de los cromosomas. El gene h a n sido generalmente considerado como un cuerpo pequeo con un grado considerable de indenendencia estructural y fisiolgica, quiz el ltimo miembro de las series organismo-clula-ncleo-cromosoma-crommero-gene, siendo el mismo gene una sola molcula de' protena o pequeos grupos de molculas. E l concepto de gene se emplea principalmente como el de un instrumento til en la investigacin biolgica y bioqumica. Esta situacin es comparable a aquella que se planteaba en fsica y qumica sobre el concepto de tomo, empleado durante tanto tiempo con xito, aunque se conoca respecto a su naturaleza m u c h o menos que en la actualidad. La esperanza de que nuestro conocimiento del gene se haga ms ntima es alentada por las investigaciones de los aspectos bioqumicos de la accin gnica. Wist h a estudiado en los ascomicetos, cmo variaciones en las condi-

MTTAfOLlSMO HIDROCltlSONADO DEL ASPERGILLUS OCHRCEUS

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clones nucleares hacen posible relacionar reacciones qumicas particulares con ciertos genes. As establece la asociacin de la citogentica con la bioqumica. Admitimos que los genes son condiciones constitucionales localizadas en los cromosomas que pueden ser tratadas como unidades en la investigacin gentica y bioqumica. Las cadenas de polipptidos que soportan los genes no pueden estar expuestas al arrastre por las corrientes intraprotoplasmticas. Ellas son las que guardan los caracteres constantes y caractersticos de la especie y estn localizadas en un punto determinado y protegidas contra la intensa actividad quniica que reina en el protoplasma. La misin del ncleo es la de preservar estas cadenas, pues la estructura del ncleo es anloga a la del protoplasma, pero el retculo nuclear es una red ms complicada y de mallas ms pequeas que la del citoplasma, por lo que es ms compacta y menos disgregable. Si se separa una cadena de la molcula, desaparecen las acciones que ella ejercera y se modifican adems las cadenas laterales vecinas. As se explica la dependencia mutua entre genes prximos. Dos genes sern independientes uno de otro cuando las cadenas laterales en que asientan estn localizadas en partes muy distantes de la cadena central del polipptido que les sirve de soporte. Los genes ocupan en los cromosomas una posicin constante, que ha podido ser determinada con toda precisin. Alineados en fila a todo lo largo de ellos, se han podido precisar hasta las distancias relativas que separan a unos de otros de cuantos contienen cada cromosoma. La sntesis de metabolitos esenciales est controlada por-los genes, siendo heredada cada deficiencia sinttica como si estuviera asociada a la mutacin de un gene determinado. Cada reaccin particular est controlada por un solo gene. La alteracin o destruccin permanente de un gene da lugar a un cambio bioqumico. Un cambio en .la posicin de las cadenas laterales correspondera a un desplazamiento de los genes y un cambio en la configuracin de una cadena lateral producira una mutacin. Con el nombre de mutacin se conoce una variacin brusca que se transmite por herencia.

Orgnulos del citoplasma

Los orgnulos que forman el condrioma de los hongos son las mitocondrias, condriomitos y condriocontos, abundantemente esparcidos por

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NGEL ORTUNO MARTNEZ

todo el citoplasma. Sus protenas difieren de las del citoplasma. En el jugo que impregna la red protenica se ha reconocido la presencia de fosfolpidos y de hidratos de carbono. Los componentes del condrioma desempean funciones de sntesis y asimilacin. Los agentes activos de su trabajo qumico son los fermentos que elaboran o que retienen por adsorcin en las ramas laterales de su red protenica. Los dictiosomas forman el aparato de Golgi. Son como pequeas vacuolas de contenido denso y constituido por lipoides. Se consideran como los elementos citoplsmicos elaboradores de grasas y lipoides. Los grupos lipfilos predominan en las ramas laterales de sus cadenas prtenicas dispuestos en capa perifrica en direccin centrpeta y conteniendo los fermentos sintetizadores de las sustancias lipoideas que constituyen estos orgnulos. Los microsomas son los ms pequeos orgnulos citoplsmicos (miden desde 600 U.A. hasta 60-200 milimicras), compuestos principalmente de ribosohucleoprotenas o fosfolpidos. Constituyen los centros de localizacin y formacin de las enzimas elaboradoras de las cadenas albuminoideas. De la misma m.anera que los genes, los m.icrosomas pueden experimentar una mutacin espontnea o inducida por agentes mulantes fsicos o qumicos.

METABOLISMO HIDfOCARBONADO DEL ASPEfGTLLUS OCHRACEUS

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BIBLIOGRAFA CONSULTADA

ANDERSON : Bacteriological Ci'iewSrj/.. E d i n b u r g h , Livingstone, 1946. ANSON, E D S A L y Coi-.: Advances in Protein Chemistry. New Y o r k y London, Lewis Co. 1944. B A K E R : Golgi Bodies. Nature 155 - 118 - (1945). B E L L I N G : Genes and chromomeres in jlowering plants. Nature I2I-831-(1928). BENEDICENTI : La vita come Fenmeno Chimico-fsico. Milano, Bocea, 1943. BLADERGROENJ W . : Chimie Physique Medcale. Bale, 1943. BoSE, S. R . : The questn of Golg bodies in the hgher Fung. Ann. of Botany 45-303(1931). Function of Plant Vacuoles. Nature 154 - 488 - (1944). B O W E N : On the nature of mthophndra. Nature 134-201 - (1924). Studes on the structure of plant Protoplasma. Science, 1926 y 1927. COSSAIGNE: Origine et evolution du vacuoma chez quelques Champignons. Rev. gen. Botanique, 43 - 140 - (1931). DANIBILLI, J . F . : Cell phisiology and pharmacology. New York, 1950. DARLINGTON: Heredity, Development and Infection. Nature 154-164-(1944). Paracrinkle Virus and Inheritance. Nature 154 - 489 - (1944). FoSTER, J . W . : Chemical Activities of Fung. N e w York, 1949. F R E Y - W Y S S L I N G , A . : Submicroscops Morfology of Protoplasma and its derivatves. New York,\ 1948. LousTAU GMEZ, J . : Estructura de la Materia Viva. Publicaciones de la Universidad de Murcia, 1948. Estudios sobre el Nuclolo en Clulas Vegetales. Publicaciones de la Universidad de Murcia, 1943. Clave determinativa del gnero Pencllum. Publicaciones de la Universidad d e Murcia, 1950. NEGRONI, P . : Morfologa y Biologa de los hongos. Tcnica mcolgica. Buenos Aires, 1938. PoRTERj J . R . : Bacterial Chemistry and Physiology. New York, 1947. R A P E R , K . B . y THOM, C . ; A Manual of the Penicillia. Baltimore, 1949. RocASOLANO, G . : Tratado de Bioqumica. Zaragoza, 1928. R u i z , S.: Bioqumica de los Elementos. I n s t i t u t o Santiago R a m n y Cajal. C. S. I. C , 1946. SHARP, L . W . : Fundamentos de Citologa. Buenos Aires, 1947.
SKINNER, C . E . , EMMONS, C . W . , T S U C H I Y A , H . M . : Molas, Yeasts and Act-

nomycetes. New York, 1947. TANNEB, F . W . : Bacteriology. New York, 1948. WAKSMAN, S . A . y STARKEY, R . L . : The soil and the microbe. New York, 1950. WOLE, F . A. y WoLF, F . T . : The Fung. New York, London, 1947. W O R K , T H . S . y W O R K , E . : Quimioterapia. Aguilar, Madrid.

METABOLISMO

IIWROCARBONAD

DEL

UASPERGILLS ocHriACEUS

II

EL

SUBSTRATO

Es indiscutible la influencia de los agentes qumicos, fsicos y qumico-fsicos sobre las actividades" biolgicas de los seres vivos, que particularizaremos, limitndonos al objeto de nuestros estudios: Los- hongos en general y concretamente a la especie Aspergillus ochraceus. Esta influencia no se manifiesta nicamente en la actividad bioqumica de la especie, sino tambin en los caracteres morfolgicos, siendo nuestro objeto comprobarlas en variadas condiciones de medio. Creemos que el camino ms seguro para penetrar en el difcil problema que estos seres nos presentan, es el estudio experimental de la accin de los elementos componentes del sistema viviente del hongo, considerndolos como compleja agrupacin heterognea cuyas propiedades estn ntimamente ligadas con sus caractersticas fsico-qumicas productoras del equilibrio dinmico, en el cual la materia que lo constituye no deja de transformarse liberando energa,, estimulada por la accin de agentes qumicos. Las transformaciones materiales de los hongos son fenmenos bioqumicos, correlativos a procesos vitales, dentro, pues, de las reacciones catalticas. Es evidente la necesidad de incorporar sales minerales en los substratos que sirvan de alimento a los hongos para atender a las necesidades del desarrollo y crecimiento, y tambin para reemplazar las que normalmente eliminan, pues son componentes celulares indispensables. Ya hemos indicado que las materias salinas se encuentran en el citoplasma celular de los hongos formando disoluciones ionizadas en mayor

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NGEL OfTO MAIITINEZ

O menor grado y originando preferentemente la presin osmtica por la que muchos fenmenos vitales se realizan en estos organismos; sus iones, con la carga elctrica que por su valencia les corresponde, disponen de una gran cantidad de energa, y se combinan entre s o intervienen en otras reacciones bioqumicas. La accin de las sales es funcin de la valencia de ion, o sea, de su carga elctrica, que es el factor que acta modificando la estabilidad del sistema vivo de los hongos; tambin debe tomarse en consideracin el volumen del ion. La accin fisiolgica de las sales la interpretamos como consecuencia de la influencia de sus iones sobre los coloides citoplsmicos. En los fenmenos de imbibicin, en la adsorcin por las protenas, tan importante para el sostenimiento de la cantidad normal de agua, los iones actan eficazmente: Entre stos se establece un antagonismo que parece definido por la valencia, y entre los de la misma valencia, por su nmero atmico (realmente, su volumen atmico o inico). Este antagonismo existe definidamente entre los iones alcalinos (monovalentes), y los alcalinotrreos (divalentes); aquellos actan porque facilitan la imbibicin, aumentando la permeabilidad de la membrana celular, mientras que los alcalinos-trreos ejercen una accin curtiente sobre sta, y por consiguiente, la permeabilidad disminuye. Los iones divalentes regulan las acciones de los monovalentes. Thom (1) considera como elementos imprescindibles para el norinal desarrollo de los hongos, los cuales entran en su composicin, los siguientes : O, H, C, N, P, S, Na, K, Mg, Cl, Fe Uno de los motivos de estudio, y para nosotros de mayor inters, es el de las propiedades que dependen de la naturaleza qumica de las sustancias que se forman en el sistema de estos organismos o macrocomponentes y las que se producen como consecuencia del mayor o menor grado de dispersin de los oligoelementos. Enfocando el problema qumicamente, los hongos como tales organismos vivos, aparecen, con frase de Santos Ruiz, como un tipo de oligarqua en la cual una multitud inmensa compuesta de tomos plsticos seria gobernada por una minora de tomos catalticos (2). El complejo orgnico de los hongos retiene por adsorcin o qumicamente infinitamente pequeos qumicos en estado atmico o inico o formando parte de rrolculas complejas (enzimas respiratorias, la anhidrasa carbnica, cido flico, etc.). Foster enumera las enzimas que contienen iones metlicos o que son activadas por los mismos; entre ellas no se encuentran ambas enzimas pectnicas..

METABOLISMO HIDROCARBONADO DEL ASPERGILLUS OCHIUCEUS

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La importancia de los oligoelemntos es tal, que con fundamento se dice que sin su presencia no sera posible la vida. Por ello la necesidad de hacer resaltar la importancia de los infinitamente pequeos qumicos. Estos no son materiales de construccin, pero multitud de trabajos realizados en el campo de la Bioqumica (*), han puesto en claro, que estas sustancias, aunque en concentraciones pequesimas, obran como catalizadores principalmente de reacciones esenciales a la nutricin, y, por consecuencia, desempean en estos organismos un papel biolgico de primer orden. Se ha generalizado el estudio de los efectos comparativos de las fitohormonas y los reguladores de crecimiento sobre vegetales superiores, investigndose centenares de productos de constitucin muy diversa y con poca o ninguna semejanza con las hormonas_ uegete/es propiamente dichas, pero que sin embargo, poseen actividad fitohormonal, en ocasiones, intenssima. En este trabajo intentamos dilucidar si los agentes qumicos, comprendiendo entre stos las sales inorgnicas, compuestos orgnicos catalogados como reguladores de crecimiento y otros no catalogados como tales, participan en el metabolismo de los glcidos por los hongos, activndolo o retardndolo. Por nuestras experiencias, podemos decir que el papel que desempean en la fisiologa de los hongos los agentes qumicos es mltiple, siendo una de sus caractersticas fundamentales el producir efectos muy sensibles cuando son aplicados convenientemente. Tanto inters concedemos a las orientaciones expuestas, que llegamos a suponer que probablemente, cuantas reacciones se producen como consecuencia del metabolismo de los hongos, podrn ser modificadas por agentes que en algunos casos se conocen y que en otros permanecen todava desconocidos. Nos hemos apoyado en este criterio para excitar o inhibir el mecanismo de la catlisis bioqumica de los hongos variando la velocidad de sus correspondientes reacciones, cultivados aquellos sobre substratos hidrocarbonados. Sealamos a este respecto que nos hemos visto oblieados a determinar a priori dosis convenientes, ya que se trata de productos que actan biolgicamente y por tanto, rebasando un cierto lmite, no slo no favorecen, sino que imposibilitan el desarrollo del microorganismo. Los Macrocomponentes o Macroelementos ejercen su accin sobre el hongo en una forma masiva, ya que se comportan como constituyentes
() Experiencias de R.mlin, BucViiier, Tryllat, Mallevre, y otros investigadores. Bertrond, Pawlow, .Tacoby, Bredig, Tlcnry, Bcrry,

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OfTVO

MARTNEZ

de alimentacin. Estos son adems del C, H y O, aportados por el compuesto orgnico del substrato, en nuestro caso un hidrato de carbono, N, P, S, K, Na, Mg y Cl, que son suministrados al hongo en forma inica simple o compuesta. Nosotros hemos elegido como fuentes de dichos elementos los que componen el substrato tipo Czapek que consideramos para nuestras experiencias el ms conveniente por su sencillez, modificado nicamente, en algunos casos el hidrato de carbono, pectina, en lugar de sacarosa. Los Microcomponentes o Microelementos, tambin llamados Oligoelementos, tienen una funcin marcadamente minoritaria de tipo cataltico, entre ellos se han estudiado, por diversos autores, el Fe, Co, Mo, Zn y Mn. Nosotros nos hemos limitado exclusivamente al estudio de la influencia del Mo apoyndonos en los trabajos de Steinberg (3), Jensen y Spencer (4) y Mulder (5), que. se ocupan de la accin de dicho elemento sobre el metabolismo nitrogenado de plantas superiores y hongos, entre stos el Aspergillus niger, aunque no sobre el Aspergillus ochraceus, en medios con nitratos como nica fuente de nitrgeno, encontrando que dicho elemento es esencial para la activacin de una enzima nitratoreductasa. Las concentraciones mximas, en molibdato sdico utilizadas por el ltimo, es de 0,02 mgrs. por 100 c. c. de cultivo, no llegndose a estudiar los efectos de concentraciones superiores. En estrecha relacin con este grupo, consideramos a las ya mencionadas sustancias reguladoras de crecimiento o Fitohormonas, y a las que como el naftaleno y otros hidrocarburos aromticos, si bien no se encuentran catalogados como tales, observamos, sin embargo, que "presentan en dosis mnimas, una marcada influencia- sobre el desarrollo del hongo. En otras se ha reconocido una actividad mutante o simplemente productora de variaciones. De este grupo complejo de sustancias orgnicas hemos elegido algunos representantes de cada tipo, con objeto de observar las diferencias de comportamiento de los mismos y poder en trabajos posteriores extendernos a otros compuestos qumicamente relacionados con ellos o de comportamiento anlogo sobre otros organismos. As, dentro del grupo de las fitohormonas artificiales hemos elegido el cido 2.-4-dicloro-fenoxi-actico (abreviadamente 2-4-D) cuya actividad como regulador de crecimiento en plantas superiores es sobradamente conocida; La influencia de estas substancias sobre organismos vegetales inferiores ha sido estudiada poco ampliamente y con resultados contradictorios.

METAOUSMO

HWfOCfBONADO

DEL

ASPIHiGILLS

0CIII1ACES

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As, Stevenson y Mitchell (6) encuentran que a concentraciones hasta del 0,08 % retarda el crecimiento de ciertas bacterias, pero no influye sobre la actividad metablica y el desarrollo d e ' hongos de los gneros Fusarium y Penicillium y Lewis y H a m m e r (7) tampoco observan inhibicin sobre dichos hongos a concentraciones del 0,1 %. Por el contrario Guiscafre-Arrillaga (8), Richards (9) y M a n i (10), s observan disminucin en la velocidad de crecimiento para algunos hongos filamentosos : . Penicillium digitatum y P. notatum, Fusarium dianthi, Rhizopus oryzae y Aspergillus niger, presentndose a concentraciones superiores al 1 por mil variadas deformaciones en el micelio. Del grupo de sustancias en cierta relaccin qumica con los reguladores de crecimiento seleccionamos el naftaleno. Este hidrocarburo constituye el ncleo de importantes fitohormonas sintticas como los cidos a-naftil-actico y a-naftoxi-actico y sus derivados en el carboxilo. Solamente ha sido investigada por Bolcato (11) la influencia de dicho hidrocarburo en el metabolismo de cepas del gnero Aspergillus sin especificar. Creemos que se trata del A. niger, ya que se estudia la produccin de cido ctrico. Actuando tanto en medio areo, como en el cidtivo observa inhibicin en la esporulacin y una disminucin en la relacin cido ctrico producido-sacarosa consumida. Otra sustancia estudiada es el acenafteno, compuesto en el que se h a reconocido actividad m u t a n t e sobre organismos, por ei'emplo en las larvas del Bombyx mori que produce cambios en color, anormalidades morfolgicas y puede llegar a inhibir por completo la emergencia de dichas larvas, como observaron Havas y Kahal (12). A r k (13) h a observado variaciones permanentes sobre algunas bacterias y por Gavadan y Brevvion (14) alteraciones en el mecanismo fotosinttico junto a inhibicin de la carioquinesis en la Helodea. M u r t h y (15) y colaboradores, por u n a parte, y Bauch (16) por otra, observan tambin mutaciones y cambios de crecimiento sobre levaduras, formndose nuevas razas con mayores clulas y mantenindose la variacin en generaciones posteriores. Finalm e n t e Ivanov y Makrinova (17) encuentran que la uresencia de acenafteno inhibe la velocidad de crecimiento del Aspereillus nieer, intensificndose la acidez del medio de cultivo, as como el rendimiento en cido ctrico respecto de cultivos testigos, si bien el perodo de desarrollo es mayor, en el primer caso. E l hidrato de doral y el etil-uretano, sustancias tambin seleccionadas en nuestro trabajo, lo h a n sido por su reconocida actividad mitoclstica. Sobre hongos no parecen haber sido utilizadas. Finalmente nos hemos ocupado del efecto de la p-henceno-sulfonamida, apoyados en la referencia de u n trabajo de T h o m a s y Chevais reco-

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gida por Work y Work (18) en la, que se indica la posibilidad de una mo-, dificacin en plantas superiores y en la Drosophila, pero sin confirmacin posterior. Los resultados obtenidos por nosotros, detallados y discutidos en la parte experimental de este trabajo nos confirman la capacidad de todas, estas sustancias para producir variaciones que se manifiestan, no solamente sobre la morfologa y capacidad reproductiva de la especie que estudiamos, sino tambin, coino es lgico, sobre su actividad metablica en el caso de substratos hidrocarbonados en general, y en particular pectnicos.

BIBLIOGRAFA

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18)

RAPEH, K . B . y THOM : A Manual of PenicilUa, p. 64. B a l t i m o r e , 1949. SANTOS R U I Z : Bioqumica de los elementos, p . 18. Monografas de Ciencias Modernas. C. S. I. C , 1946. STEINBEBG, R . A . : J. Agr. Research. 55 - 891 - (1937), citado en FOSTER, J . V.: Chemical activities of Fungi. Academic. Press. New York, 1949, p. 276. JENSEN, l i . L. y S P E N C E B , D . : Proc. Linnean Soc. N. S. Wales 72 - 1 y 73 - (1947), citado en Foster. MuLDER, E. G. : Rev. Pla and Soil I - 94 - (1948). . STEVENSON, E . C . y MITCHELL, J . W . : Science 101 - 642 - (1945). L E W I S , R . W . y HAMMEH, Cn. L. : Michigan Agr. Expt. Sta. Quart. Bull. 29-112-(1946) en C. A. ( 1 9 4 7 ) - 1 7 9 5 . GUISCAFRE-ARRILLAGA, J . : Plant Disease Reptr. 32 - 248 - (1948), en C. A. (1948) - 5601. RICHARDS, R . R . : Botan. Gaz. 110 - 523 - (1949), en C. A. (1949) - 6704. MAN, P . y STRASZEWSKA, Z . : Compt. rend. soc. biol. J - 313 - (1950). BoLCATo, V. : Enzymologia 12 - 356 - (1948). HAVAS, L . J . y KAHAN, J . : Nature 161 - 570 - (1948). ARK, P . A . : J. Bact. 51 - 699 - (1949), en WORK y WORK. Quimioterapia. T r a d . V. Villar. Aguilar, Madrid, p. 289. GAVANDA, P . y BREBION, G . : Mm. services chim tat. 32 - 410 - (1945), en C. A. (1948)5087. MuRTHi, SuBBAMiAN y KRISHNA : Proc. ndiam Acad. Sci. 30 B - 1 8 5 - (1949), en C. A. (1951) - 8083. BAUcn, R. : Wochschr. Braun. 59 - 1 y 9 - (1941), en C. Al. ( 1 9 4 2 ) - 6 5 7 3 . IvANOv, N. N. y MAKRINOVA, N . A. : Doklady Akad. Nauk. S. S. S. R. 30 - 356 - (1941), en C. A. (1941)-8004. TiioMAS, 11. W . y CREVAIS, S . S . : Compt. rend. soc. biol. Itf? - 1 8 5 - (1943), en W O R K , obra citada, p . 280.

METABOLISMO HWRO.CARBONADO

DEL ASPEfGILLS OCtlfACEUS

555

III

PARTE

EXPERIMENTAL

CARACTERIZACIN DE LA ACTIVIDAD PECTINASICA Y PECTASICA DEL ASPERGILLUS OCHRACEUS EN COMPARACIN CON LA DEL PENICILLIUM CHRYSOGENUM

Como hemos indicado en la iniciacin de este trabajo, nos propusimos estudiar el comportamiento de dos especies micolgicas pertenecientes a los gneros Aspergillus y Penicillium sobre un substrato pectnico. En el trabajo de Waksman y Alien, a partir de Aspergillus niger y de dos especies de los gneros Penicillium y Fusarium, que no llegaron a caracterizar, dedujeron que existe una diferencia marcada de actividad en el comportamiento del Aspergillus, por una parte, y de los Penicillium y Fusarium por otra. Respecto del primero caracterizaron una intensa actividad vital desde la iniciacin del cultivo, manifestada por el rpido consumo del cido galacturnico liberado por hidrlisis de la cadena poligalacturnica que constituye la pectina; con relacin a los dos hongos utilizados encuentran una hidrlisis muy activa en los das iniciales del desarrollo del cultivo, manifestada por un fuerte aumento en el poder reductor del medio ligadas simultneamente a una menor actividad y desarrollo miceliar. A partir de dicho momento, alrededor de los siete das, se inicia una etapa en la que los cidos sencillos producidos anteriormente son consumidos con rapidez, intensificndose el desarrollo del micelio. Los citados investigadores se ocupan exclusivamente de la actividad pectinsica de los hongos (desdoblamiento hidroltico de la cadena pectnica en molculas de cidos galacturnico), sin tomar en consideracin

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la posible accin pectsica (saponificacin de los grupos carbometoxilados, con aparicin de carboxilos libres y puesta en libertad de alcohol metlico). Por nuestra parte, despus de aislar y caracterizar las especies de hongos indicados, hemos intentado comprobar si los comportamientos frente al substrato pectnico presentaban una marcha paralela a la indicada por Waksman., Al mismo tiempo intentamos llegar a la diferenciacin por caminos analticos de las dos actividades: Pectinsica y Pectsica. Para eUo hemos utilizado como criterios: 1." Actividad pectinsica o poligalacturonsica. a) Variacin en el poder reductor del medio de cultivo como consecuencia de la liberacin de grupos aldehidos de los eslabones de cido galacturnico bloqueados en la pectina inicial en enlaces glucosdicos. b) Variacin de la viscosidad de la disolucin ligada a la longitud d cadenas de las macromolculas lineales de pectina. 2 Actividad pectsica o pectinestearsica. a) Variacin en el contenido de metoxilos de porciones de pectina reprecipitada de l disolucin sometida a la actividad del hongo. b) Variacin de la acidez actual de la disolucin, la que en principio debera aumentar como consecuencia de la liberacin de grupos carboxlicos, inicialmente esterificados.
Tcnica y resultados

Cultivos sobre la disolucin pectinica

Aislamos tras una serie de cultivos en medio Czapek-agar y consiguiente seleccin, dos especies perfectamente definidas: Aspergillus ochraceus y Penicillium chrysogenum. Sobre disoluciones aspticas de pectina a concentracin del 2 % y a las que se han aadido como sustancias nutritivas inorgnicas las sales de la composicin Czapek, realizamos las siembras de las especies indicadas, incubndose a la temperatura de 25 C. 2 Poder reductor

Hemos determinado la variacin en funciones aldehidos liberadas durante la actividad pectinsica del hongo, utilizando el reactivo Benedict. Las determinaciones han sido realizadas independientemente en las zonas superior e inferior del medio de cultivo; como preveamos ,' encontramos un contenido siempre mayor en reductores en la segunda, ya que siendo homognea la accin de la enzima, no lo ser el consumo de

METABOLISMO mDfOCRlONADO

DEL ASI'EfGnJMS OCHFIACEUS

las sencillas molculas liberadas por parte del hongo colocado exclusivamente en la superficie del medio. Referimos los reductores, como hacen W a k s m a n n y Alien, a glucosa, pero tambin inclumos los resultados calculados en galactosa, ms prxima en su poder reductor al cido galacturnico. 3 Viscosidad

H e m o s determinado la viscosidad especfica de la disolucin a lo largo del perodo de cultivo, utilizando un viscosmetro Ostwald y a la temperatura de 25. 4." ndice de metoxilo .

H e m o s determinado a lo largo del perodo de experiencia el ndice de metoxilo de muestras de.pectina separadas de la disolucin, precipitndolas con etanol y siendo desecadas en vaco a 5 0 - 6 0 grados centgrados. 5. Acidez actual de la disolucin

Hemos seguido la variacin en l p H de la disolucin hasta valor prcticamente constante, por determinaciones potenciomtricas con electrodo de calomelanos a la temperatura de 24 grados centgrados. 6. Residuo

E n todos los cultivos estudiados va apareciendo, simultneamente, a la demolicin del substrato, u n sedimento pardo oscuro, que .llega a alcanzar el 5,77 % en el caso del Argergillus ochraceus y el 3,9 % en el Penicillium chrysogenum de la pectina inicial. Analizados estos residuos encontramos los siguientes resultados:
ndice de metoxilo Aspergillus Penicillium 1,6 % 0,77 % Lignina 44,8 % 39,1 % Reductores . calculados en galacturnic 13,1 % 11,2 %

A u n sin llegar a establecer un criterio exacto sobre la naturaleza del mismo, podemos adelantar nuestra opinin de que s trata de un complejo lignina-cido poligalacturnico, m u y resistente a la hidrlisis.

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TABLAS

Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis de la pectina por la accin enzimtica del Aspergillus ochraceus Factor Benedict: 5 ce. = 0,01J grs de glucosa
Das Lquido substrato gastado para 5 ce. de Benedict Cantidad de reductores, grs por litro en gl ucosa Cantidad de reductores, grs por litro en galactosa

Siembra: 5 9 13 17 21 29 Siembra: 5 9 13 17 21 29 2,2 2,1 2 2,7 3,8 4,3 ec. ec. ce. ce. ec. ce. 2,6 2,4 2,15 3,4 4,1 5,2 ce. ct. ce. ce. ce. ce.

Zona superficial 4,23 4,58 5,11 3,23 2,68 2,11 Zona inferior 5 5,23 5,5 4,07 2,89 2,55 _ 5,98 6,25 6,58 4,87 3,45 3,05 5,06 5,47 6,11 3,86 3,20 2,52

METABOLISMO HIDROCAfBONADO DEL ASPERGILLVS OCHRACEUSx

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Lvi

Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis ,d]e k pectina por la accin enzimtica del Penicillium chrysogeifeim))
F a c t o r B e n e d i c t : 5 ce. = 0,011 grs de glucosa Lquido substrato gastado para 5 ce de Benedict 2,9 2,7 2,1 2,45 3,10 4,20 2,3 2,2 2 2,3 2;6 3,4 ce. ce. ce. ce. ce. ce. Zona inferior ce. ce. ce. ce. ce. ce. 4,78 5 5,5 4,78 4,23 3,23 5,71 5,98 . 6,58 5,71 5,06 3,86 Cantidad de reductores, grs por litro en glucosa 3,79 4,07 5,23 4,48 3,54 2,61 Reductores, grs por litro en galactosa 4,53 4,87 6,25 5,36 4,23 3,12

Das Siembra: 5 9 13 17 21 29 Siembra: 5 9 13 17 21 29

Zona superficial

Viscosidad. Substrato del Aspergillus ochraceus

Das Inicial 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tiempo de cada del lquido substrato 18,8 12,5 12,5 10,2 10,2 10,2 10,2 8,3 8,1 8,1 8,1 Viscosidad relativa 2,685714 1,785714 1,785714 1,457142 1,457142 1,457142 1,457142 1,185714 1,157142 1,157142 1,157142 Viscosidad especfica 1,685714 0,785714 0,785714 0,457142 0,457142 0,457142 0,457142 0,185714 0,157142 0,157142 0,157142

Tiempo de cada del a g u a : 7 "

558

ANGI-.L OUTUO MARTNEZ.

Viscosidad. Substrato de P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m
Da Tiempo de cada del lquido substrato 18,8 12,5 11,3 9,2 8 8 8 8 7,8 7,8 7,6 Viscosidad relativa 2,685714 1,785714 1,614285 1,314285 1,142857 1,142857 1,142857 1,142857 1,114285 1,114285 1,085714 Viscosidad especfica 1,685714 0,78.5714 0,614285 0,314285 0,142857 0,142857 0,142857 0,142857 0,114285 0,114285 0,085714

Ihicial .3.
--
4

5 6 7 8 9 10 11 12

Tiempo de cacla del a g u a : 7 ')i

ndice de itietoxilo de las muestras tomadas del substrato pectnico lquido correspondiente al Aspergillus ochraceus, precipitadas con etanol y' desecadas al 50 - 60
Das Cantidad de pectina empleada en cada valoracin, 0,0354 0,0228 0,0311 0,0336 0,0302 0,0318 0,0262 grs gr grs grs grs grs grs Tiosulfato gastado 0,05 N. Factor=l,0264 5,4 2,6 3,3 3,4 2,9 1,4 . 2,1 ce. ce. oc. ce. ce. ce. ce. Indico de metoxilo en tanto por ciento 4,03900 3.01977 2,80989 2,67963 2,54203 1,16583 2,08474 de O C H ,

Inicial 3 4 5 6 7 Sedimento Sedimento lavado y desecado'

0,0698 grs

4,6 ce.

1,60190

METABOLISMO IlIDnOCAimONADO

DEL ASPEnCILLUS OCHRACEUSn

559

ndice de metoxilo de las muestras tomadas del substrato pectnico lquido correspondiente al ((Penicillium chrysogenum precipitadas con etanol y desecadas a 50 - 60
Das Cantidad de pectina empleada en la valoracin 0,0354 0,0224 0,0308 0,0296 0,0321 0,0311 0,0502 grs grs grs grs grs grs grs Tiosulfato gastado 0,05 N. Factor=l,0264 5,4 2,4 3,1 2.5 1,8 1,1 1,5 ce ce. ce. ce. ce. ce. ce. ndice de metoxilo en tanto poi ciento 4,03900 2,83726 2,66530 2,23658 1,48492 0,93663 0,78172 de OCH3

Inicial 3 4 5 6 7 Sedimento Sedimento lavado y desecado

0,0404 grs

1,2 ce.

0,77171

Determinaciones potenciomtricas del pH con electrodo de calomelanos efectuadas en el substrato del Aspergillus ochraceus a la temperatura de 24
Das Inicial 3 4 . 5 6 7 8 9 10 11 12 Milivoltios 189 146 98 78 66 59 54 54 45 44 44 pH 4,50 5,23 6,05 6,38 6,59 6,72 6,80 6,80 6,94 6,96 6,96

560

NGEL OliTUNO MARTNEZ

Determinaciones potenciomtricas del pH con electrodo de calomelanos efectuadas en el substrato del Penicillium chrysogenum a la temperatura de 24 C.
Das Inicial 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Milivoltios 189 186 182 110 70 66 70 66 50 43 35 pH 4,50 4,55 4,61 5,84 6,52 6,59 . 6,52 6,59 6,86 6,99 7,11

Discusin de los resultados y conclusiones

De la comparacin entre los valores obtenidos para el contenido en reductores de los lquidos de cultivo, se deduce una rpida demolicin de las cadenas poligalacturnicas, que en los dos hongos estudiados alcanza el mximo en los mismos' perodos de desarrollo, alrededor de los trece das; en ellos se llega a un contenido en reductores muy prximo al correspondiente a la hidrlisis completa. A partir de este momento, que parece corresponder con el de la actividad reproductora, se inicia una disminucin que marcha paralelamente en los dos hongos estudiados, consecuencia de la intensificacin en la actividad vital del hongo y de la carencia de pectinas sin desdoblar. Este resultado no coincide con el Waksman, sobre todo en lo que respecta al cultivo del Aspergillus ochrceus. La cifra de reductores no permite llegar, por otra parte, a una conclusin definitiva sobre la actividad pectinsica, ya que los valores obtenidos se encuentran perturbados por la metabolizacin de las molculas sencillas liberadas en el ciclo vital del hongo. Por el contrario, las medidas de viscosidad permiten deducir comparativamente la diferencia entre las actividades pectinsicas de los hongos estudiados, ya que las molculas de cido gal acturnico o las constituidas por un pequeo nmero de eslabones del mismo no influyen prcticamene en la viscosidad de la disolucin. Encontramos as, que si bien

METABSM

HlbRCRONAD DEL AS'PEliGILLUS CHRCES

561

en los perodos iniciales del desarrollo ambas especies de hongos (tres das), se comportan anlogamente a partir de dicho momento es muy superior la disminucin de la viscosidad en el substrato del Penicillium chrysogenum, llegndose a un valor casi idntico al del agua en el momento en que tambin se obtiene la mxima cifra de reductores. La actividad pectsica, deducida de las variaciones de los ndices de metoxilo, no parece ser muy distinta en los hongos estudiados, si acaso un poco mayor en el Penicillium. Por otra parte, nos encontramos que se llega a un ndice de metoxilo muy pequeo ms rpidamente que a la hidrlisis prcticamente completa, lo que lleva a considerar superior la accin pectsica" a la pectinsica en las especies estudiadas. Por ltimo, de las determinaciones del pH a lo largo del cultivo, no podemos sacar ninguna conclusin, ya que en contra de lo esperado, se ha producido un aumento de basicidad del medio, sin que el pH haya disminuido en ningn momento, como correspondera a la liberacin de carboxilos por la saponificacin de los grupos COO.CH3 . Esta anomala creemos que es explicahle como consecuencia de la elaboracin mucho ms intensa de productos residuales de carcter bsico en el metabolismo del hongo. La utilizacin de este criterio para apreciar la actividad pectsica no es vlida con organismos in vivo.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS PECTINASAS AISLADAS DE LOS HONGOS ASPERGILLUS OCHRACEUS Y PENICILLILIM CHRYSOGENUM

Para conseguir un criterio ms concreto y correcto sobre las actividades pectinsicas de los hongos citados nos ha parecido esencial obtener las enzimas correspondientes segregadas por ellos y determinar su accin sobre la pectina. De esta manera la accin interferente del metabolismo del organismo queda eliminada, as como la posible formacin de otras sustancias, como penicilina, cido glucnico, manita y los pigmentos ocracina y crisogenina, por uno u otro hongo. Por otra parte, en la accin directa del hongo actan simultneamente la pectinasa y la pectasa, por ello parece indicado el aislamiento d dichas enzimas y el estudio de sus actividades por separado.
Tcnicas y resultados

1. Pectina. Como consecuencia del trabajo de Jensen y Mac Donell (1), en el-que establecen la necesidad de la accin simultnea de las pectasa y pectinasa, para que esta ltima acte sobre la pectina, ya que.

56

NGEL ORTUO MARTNEZ

observan que no se produce hidrlisis de los enlaces glucosdicos entre los eslabones de cido galacturnico si se encuentran total o intensamente esterificados en el carboxilo, hemos elegido una pectina de bajo metoxilo, que por ello podr responder a la actividad pectinsica, permitindonos comprobar simultneamente la exclusin de la accin estearasa por eliminacin de la pectasa. 2." Obtencin de la enzima. Aisladas las dos especies perfectamente definidas: Aspergillus ochraceus y Penicillium chrysogenum, sembramos sobre disoluciones aspticas de pectina a concentracin del 2 % y a la que aadimos cido tartrico al uno por mil y sales inorgnicas, principalmente nitrato amnico como generador de nitrgeno. A pesar de que Waksman y Alien consideran preferible el cultivo sobre substrato slido humedecido con lquido nutritivo, al realizado directamente sobre este ltimo, no encontramos ningn inconveniente en el segundo caso siempre que aadamos inicialmente al lquido un uno por mil de cido tartrico, condiciones en las que observamos un claro aumento en el rendimiento de enzima. Procuramos gran superficie para facilitar mayor rea de las colonias y poca profundidad del lquido substrato, consiguiendo de esta manera una rpida hidrlisis total de la pectina, la clarificacin del lquido y evitando cultivo prolongado (entre el quinto y el sexto da), ya que la actividad de la enzima disminuye, as como el rendimiento, despus de un ulterior crecimiento del hongo. Aislamos la enzima siguiendo en principio la tcnica de Waksman y Alien, para lo cual, al final del perodo de incubacin, los lquidos substratos se filtraron. Del filtrado se precipit la enzima con ~dos volmenes de alcohol de 95 %. La enzima precipitada se lav con acetona y se sec al vaco sobre cido sulfrico, pero el material obtenido siguiendo dicho procedimiento presenta un color intenso, posiblemente consecuencia de la retencin de pigmentos, se redisolvi en agua y precipit con alcohol cuatro veces hasta conseguir un polvo totalmente decolorado. Para observar la influencia de la concentracin de enzima utilizamos disoluciones de igual concentracin en pectina (2 %), frente a las pectinasas de ambos orgenes al 0,075 % y 0,125 %. Las disoluciones se mantuvieron a 40 C. y peridicamente determinamos los criterios antes dichos. En el transcurso de este trabajo hemos utilizado tres pectinas diferentes (tipo tcnico manzana), con caractersticas qumicas particulares, que resumimos a continuacin:

METABOLISMO HIDROCAlUiONADO DEL ASPERGILLUS OCHRACEUS

563

Pectin

n. I 11,3% 4,04 % 3,75 % 31,40% 0,686

Cenizas ndice de metoxilo Reductores iniciales Reductores por hidrlisis prolongada (en glucosa). Viscosidad especfica al 2 % Pectina n. 2

Cenizas ndice de metoxilo Reductores iniciales Reductores por hidrlisis prolongada (en glucosa) . Viscosidad especfica al 2 % Pectina n." 3

15,9 % 2,6 % 27,56 % 80,77 % 0,433

Cenizas ndice de metoxilo Reductores iniciales Reductores por hidrlisis prolongada (en glucosa) . Viscosidad especfica al 2 %

13,07 % 3,14 % 8,44% 59,08 % 5,977

12 Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis de la pectina por la accin enzimtica de la pectinasa del Aspergillus ochraceus Concentracin de enzima: 0,075 % TT 0 12 24 36 48
60

Disolucin pectinaenzima gastada para 10 ce. Benedict = ,0,034 grs de glucosa 5 , 7 3 , 8 3,4
3,15

% de reductores expresados en glucosa

0,596 0,894

1
'1,079 1,096 1,133 1,172 1,172 1,172

72 84 96

3 , 1 3 2 , 9 2 , 9 2,9

564

NGEL OfTUO MAfTlNE2 13

Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis de la pectina por la accin enzimtica de la pecdnasa del Penicillium chrysogenun Concentracin de enzima: 0,075 % TT Disolucin pectinaenzima gastada para 10 ce. Benedict = 0,034 grs de glucosa 0 , 1 2 24 36 48 60 72 84 96 108 120 5 , 7 4 , 8 4 , 3 3 , 9 3 , 7
3,65

% de reductores expresados en glucosa

0,596 0,708 0,790 0,871 0,918 0,931 0,944

3 , 6 3 , 4 3 , 2 3 3

1
1,062 1,133 1,138

. 14 Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis de la pectina por la accin enzimtica de la pectinasa del Aspergillus ochraceus Concentracin de enzima: 0,125 % TT__ Disolucin pectinaenzima gastada para 10 ce. Benedict = 0,034 grs de glucosa
5,7 .

% de reductores expresados en glucosa

0,596 '

0 12 24 36 48 60

3 , 4 3 3 3 3

1
1,133 1,133 1,133 1,133

METABOLISMO HIDROCAfBONADO DEL <<ASl'i;fGILLUS OCHfACEVS 15 Valoraciones de reductores a consecuencia de la hidrlisis de la pectina por la accin enzimtica de la pectinasa del Penicillium chrysogenum Concentracin de enzima: 0,125 % TT Disolucin pectinaenzima gastada para 10 ce. Benedict = 0,034 grs de glucosa
5,7 4,4 3,7 3,3 3 3 3

% de reductores' expresados en glucosa

0,596 0,772 0,918 1,030 1,133 1,1-33 1,133

0 12 24 36 48 60 72

16 Viscosidad. Pectinasa del Aspergillus ochraceus Concentracin de enzima: 0,075 %

Horas 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Tiempo de calda pectina - enzima 7,8" 6,2" 5,3" 5,1" 5" 4,9" 4,7" 4,5" 4,5" 4,5" Viscosidad relativa 1,733 1,377 1,177 1,133 1,111 1,088 1,044 1 1 1 Viscosidad especfica 0,733 0,377 0,177 0,133 0,111 0,088 0,044 0 0 0

Tiemp o d e <3ada del agua = 4,6"

566

NGEL

OJiTUfiO

MARTNEZ

17 Viscosidad. Pectinasa del Penicillium chrysogenum Concentracin de enzima: 0,075 % Horas O 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Tiempo de caida pecna - enzima 7,8" 6,3" 5,7" 5,6" 5,2" 5,1" 5" 4,8" 4,7" 4,6" 4,5"
Viscosidad relativa 1,733 1,400 1,266 1,244 1.155 1,133 1,111 1,066 1,044 1,022 1 Viscosidad especfica 0,733 0,400 0,266 0,244 0,155 0,133 0,111 0,066 0,044 0,022 0

Tiempo de cada del agua = 4,5"

18 Viscosidad. Pectinasa del Aspergillus ochraceus Concentracin de enzima: 0,125 %

Horas 0 12 24 36 48 60 Tiempo de caida pectina - e n z i m a 7,8" 5,8" 5" 4,5" 4,5" 4,5" Viscosidad relativa 1,733 1,288 1,111 1 1 1 Viscosidad especfica 0,733 0,288 0,111 0 0 0

Tiempo de ca da del a g u a : 4,5"

METABOLISMO HWROCAfBONADO DEL uASPEfGILLUS OCIWACEUS

567

19

'

Viscosidad. Pectinasa del Penicillium chrysogenum)) Concentracin de enzima 0,125 % Mnrac ""''"' O 12 24 36 60 72 84 Tlempo de calda pectina - enzima . 7,8" 6,2 5,4" 5" 4,5" 4,5" 4,5"
Viscosidad relativa 1,733 1,377 1,200 1,111 1 1 1 Viscosidad especfica 0,733 0,377 0,200 0,111 . 0 0 0

Tiempo de cada del agua: 4,5"

20
p H de la disolucin pectina-enzima. Pectinasa del Aspergillus ochraceus Concentracin de enzima: 0,075 %
Horas 0 12 24 48 60 72 84 96 Milivoltios de la disolucin pectina-enzima 219 218 216 215 214 211 211 211 pH 3,78 3,75 3,72 3,70 3,68 3,61 3,61 3,61

568

NGEL ORTUO MARTNEZ

21 pH de la disolucin pectina-enzima Pectinasa del Penicillium chrysogenum

Concentracin de enzima: 0,075 % Horas 0 12 24 36 48 60 72. 84 96 108 120 Milivoltios de la disolucin pectina- enzima 219 218 217 216 215 215 214 214 213 211 211 pH 3,78 3,75 3,73 3,72 3,70 3,70 3,68 3,68 3,65 3,61 3,61

22 pH de la disolucin pectina-enzima. Pectinasa del Aspergillus ochraceus

Concentracin de enzima: 0,125 % Horas 0 .' 12 24 36 48 60 72 Milivoltios de la disolucin pectina-enzima 231 229 227 226 . 223 218 218 pH 4,10 3,96 3,92 3,90 3,85 3,75 3,75

23

pH de la disolucin pectina-enzima Pectinasa del Penicillium chrysogenum

Concentracin de enzima: 0,125 % Horas 0 12 24 36 48 60 72 . Milivoltios de la disolucin . pectina-enzima 321 230 229 227 225 221 221 pH 4,1 4 3,96 3,92 3,89 3,81 3,81

METABOLISMO HlDUCAliBONADO DEL ASPEtOILLUS OCHRACEUS onclusiones

V^5>69-,A ^^-i_^

'^ ' -^

Se observa una clara diferencia cuantitativa en la actividad de ambos preparados pectinsicos, mayor en el procedente del Aspergillus ochraceus que en el del Penicillium. chrysogenum. Este resultado es opuesto al obtenido por nosotros con cultivos directos de los mismos hongos. Al comparar las actividades del hongo y enzima respectivo, resulta extraordinariamente superior la de la segunda, lo que nos lleva a pensar en una perturbacin (inhibicin) de la accin de la enzima, consecuencia de la actividad metablica del organismo. Tambin debemos deducir de dicho resultado que si bien el Penicillium chrysogenum elabora una mayor proporcin de enzima que el Aspergillus ochraceus, la de ste parece ser de mayor actividad. A pesar de seguir las iiTStrucciones de Waksman y Alien en el aislamiento y purificacin de la pectinasa, sta no parece quedar totalmente purificada de pectasa, aunque la proporcin que contedr debe ser relativamente pequea, como se deduce de las variaciones tambin pequeas, pero definidas del pH de la disolucin. Por ello, parece indicado un estudio.ms detallado de la tcnica de purificacin, as como el intento de la cristalizacin y estudio qumico de la enzima, hasta ahora segn nuestras noticias, no conseguido.

57

NGEL onrr/.ivo

MARTNEZ

INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS MINERALES PECTINICO DEL

SOBRE EL

METABOLISMO

ASPERGILLUS OCHRACEUS

Para estudiar la influencia de las sales inorgnicas componentes del medio nutritivo sobre el metabolismo del Aspergillus ochraceus desarrollado en presencia de pectinas, hemos partido del substrato tipo Czapek de composicin m i n e r a l : . Nitrato sdico ' . 3 grs/litro Fosfato potsico Sulfato magnsico 0,5 Cloruro potsico 0,5 t o m a n d o como fuente hidrocarbonada en lugar de sacarosa, pectina a la concentracin de 20 gramos por litro. Adems hemos aadido 0,5 grsi de cido tartrico para conseguir un p H ms adecuado a la accin pectinsica que el ms alto del Czapek normal. Sembramos sobre porciones de 30 c e . de este substrato y en condiciones totalmente aspticas u n a suspensin de esporas de nuestras cepas de 10 das de incubacin, teniendo la precaucin de sembrar aproximadamente el mismo nmero de esporas en cada cpsula. D e ellas elegimos al final del perodo de genninacin las 10 de aspecto ms uniforme. Las cpsulas se mantuvieron durante el ciclo analtico a la. temperatura de 25 C. Caractersticas de las cpsulas . . . . . . Petri 7 1,8 38,5 69 cm cm cm^ c. c.

Dimqtro de la cpsula Altura Superficie Volumen

Determinamos previamente viscosidad y reductores en el substrato, repitiendo estas determinaciones cada 24 horas sobre el lquido contenido en cada u n a de dos de las cpsulas, para lo cual decantamos por aspiracin el lquido y lavamos el micelio con agua destilada que nos completa el volumen inicial de 30 c. c , compensando el agua retenida en el micelio.

METABOLISMO lIWROCARliONADO DEL. ASPERGILLUS OCHACES

571

U n a vez obtenido los valores correspondientes al substrato tipo, procedimos de manera idntica en varias series, prescindiendo ordenadam e n t e de cada una de las sales de dicho substrato. Simultnea e independientemente a las determinaciones del contenido en reductores y de la viscosidad, hemos apreciado el desarrollo del hongo por el mtodo micromtrico, midiendo la velocidad en el desarrollo del tubo germinativo del hongo estudiado. Hemos efectuado estas medidas en cultivos sobre porta excavado con los mismos substratos que los realizados en cpsula Petri. Para ello hemos tomado porta-objetos con una sola excavacin, bien limpios y esterilizados, pasndolos sobre, la llama del mechero repetidas veces; los dejamos enfriar con la excavacin hacia abajo, apoyando uno de los extremos sobre una varilla. E n t r e tanto tomamos con pinzas, por u n o de sus ngulos, cubre-objetos bien limpios y conservados en alcohol, flamendolos con las debidas precauciones para evitar su rotura o deformacin. Depositamos una gota del lquido substrato en el centro de la cara inferior del cubre, sirvindonos para ello, bien de una pipeta Pasteur, esterilizada, afilada en un extremo y doblada en ngulo agudo m u y abierto, prximo al ngulo recto, en el punto de la porcin gruesa con la afilada, bien de una varilla doblada y esterilizada. Hemos procurado que la gota para cada cultivo fuese de magnitud mediana, ni tan pequea que pueda fcilmente evaporarse, ni tan grande que llegue a tocar los bordes de la excavacin. T o m a m o s con hilo de platino asptico una pequea porcin de esporas. Sembramos las esporas aisladas, evitando que entren en contacto, lo que dificultara la tarea de nuestras observaciones. Depositamos el material en la gota pendiente, empleando siempre las precauciones de asepsia habituales. U n t a n d o previamente los bordes del cubre-objetos con vaselina esterilizada, lo depositamos sobre el porta excavado de tal forma que la gota pendiente quede en el centro de la cavidad. Para adherirlo mediante la vaselina presionamos suavemente sobre la cara superior del cubre-objetos. Siempre hemos hecho varias preparaciones con el mismo material por los fracasos que pudiesen ocurrir, sea por desecacin o por extensin de la gota. Las preparaciones las colocamos en cmara h m e d a . H e m o s seguido peridicamente el desarrollo progresivo, rnidiendo microscpicamente con objetivo seco y ocular micromtrico. Damos el valor medio (media aritmtica), en mieras, de las longitudes de los tubos germinativos (unos cien), medidos en cada observacin.

572

NGEL ORTUO MARTNEZ

24

SUBSTRATO

TIPO

MTODO Horas 24 48 72

MICROMETRICO Mieras 261,28 1,339,52 2,156,48

REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 g r s glucosa 7,1 4,7 4,9 7,7 7,1 ce. c,c. c,c. c.c. c.e.

Horas 0 41 65 89 113

Cantidad reductores grs % de glucosa , 0,138 0,209 0,201 0,128 0,138

VISCOSIDAD Tiempo cada substrato 24" 7" 5,5'^ 4,9" 4,8" Viscosidad relativa 5 1,4 1,14 1,02 1 Viscosidad especfica 4 0,4 0,14 0,02 0,00

Horas 0 41 65 89 113

METABOLISMO HIDROCAHBONADO DEL ASPERGILLUS OC.HfACEUS

573

25 SUBSTRATO SIN NITRATO SDICO

MTODO MICROMETRICO Horas

24 48 72 96 REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glucosa 7,1 6,4 6,8 6 5,2 5,3 5,8 ce. c.c. c.c. c.c. c.c. c.c. c.c.

Mieras
79,85 196,88 378,52 513,96

Horas 0 24 41 65 89 113 137

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,157 0,146 0,171 0,206 0,200 0,179

VISCOSIDAD Tiempo eada substrato 24" 18" 17,6 13,8 8,4 9,6 Viscosidad relativa 5 3,7 3,6 2,7 1,7 2 Viscosidad espeflea 4 2,7 2,7 1,7 0,7 1

Horas 0 4165 89 113 137

574

NGEL

OnrUflO

MARTNEZ

26 SUBSTRATO SIN FOSFATO POTSICO

MTODO Horas 24 48 96

MICROMETRICO Mieras 276 682,64 1748,00

REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glueosa 7,1 7,2 6,2 5,1 4,6 4,6 ce. c.c. c.c. c.c. c.c. c.c.

Horas 0 24 65 . 89 113 137

Cantidad reductores grs % de glueosa 0,138 0,126 0,190 0,315 0,412 0,412

VISCOSIDAD Tiempo cada substrato 24" 13" 5,8" 5,4" Viscosidad relativa 5 2,7 1,2 1,2 Viscosidad especfica 4 1,7 0,2 0,1 ,

Horas 0 65 89 113

MliTAHOLISMO HIDnOCAliBONADO DHL ASPlillGILLUS OCHItACEUS

575

27

SUBSTRATO SIN SULFATO

MAGNSICO

MTODO MICROMETRICO Horas

24 48 72 96 REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glucosa 7,1 6,9 6,1 7,4 7,4 7,6 8,6 ce. c.e. ce. ce. c.e. ce. ce.

Mieras
224,48 750,72 1426,00 1667,04

Horas 0 24 41 65 89 113 137

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,150 0,211 0,122 0,122 0,113 0,074

VISCOSIDAD Horas 0 65 89 113 Tiempo cada substrato 24" 7,2" 6" 5,8" Viscosidad relativa 6 1,5 1,2 1,2 Viscosidad especfica 4 0,5 0,2 0,2

576

NGEL ORTUNO MARTNEZ

28

SUBSTRATO SIN CLORURO POTSICO

MTODO Horas 24 48 72 120

MICROMETRICO Mieras 103,04 504,16 519,44 1332,16

REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glueosa 7,1 7,1 7,1 6,9 7,8 8,4 ce. c.c. c.c. c.c. c.c. c.c.

Horas 0 24 48 72 96 120

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,138 0,138 0,151 0,122 0,031

'

VISCOSIDAD Horas 0 72 96 120 Tiempo cada substrato 24" 12" 6" 5,3" Viscosidad relativa 5 2',5 1,2 1,1 Viscosidad especfica 4 1,5 0,2 0,1

Vo> " ' ^ V"

METABOLISMO HIDfOCARBONADO DEL uASPERGlLLS OCIIUCEOSn

^^vl^"^

Discusin de los resultados y conclusiones

D e la comparacin del comportamiento frente a los tres criterios se deduce: 1. Intensa disminucin del metabolismo de la pectina en ausencia de nitrato sdico, retardndose no slo el desarrollo del hongo, sino tambin la accin pectinsica que no llega a ser completa, quedando, por lo tanto, substrato sin metabolizar. 2. La ausencia del fosfato slo influye en la actividad pectinsica desde el punto de vista cualitativo (velocidad del proceso), pero, por el contrario, y como es de prever al recordar la intervencin del ion P 0 4 ' ~ en el metabolismo de los monosacridos, el cido galacturnico que queda libre es metabolizado, muy lentamente y con gran dificultad. 3. La ausencia del cloruro potsico determina una hidrlisis ms lenta de la molcula pectnica ligada con utilizacin simultnea de las molculas sencillas puestas en libertad; y a partir del m o m e n t o de plena esporulacin, el hongo compensa la ausencia de dicho ion con un metabolismo prcticamente ntegro del substrato carbonado. 4. T a m b i n en ausencia de sulfato magnsico se observa una utilizacin ms rpida de las sencillas molculas de cido galacturnico liberadas. Respecto del desarrollo del hongo, la influencia inhibidora es menor que en el caso de la ausencia de los otros componentes del substrato tipo.

578

ANGIiL ORTVfiO

MARTNEZ

INFLUENCIA DEL MOLIBDENO COMO OLIGOELEMENTO Y DE SUBSTANCIAS. DE CARCTER FITOHORMONAL SOBRE EL METABOLISMO P E C T N I C O DEL

ASPERGILLUS OCHRACEUS

La influencia del molibdeno la hemos observado adicionndolo en forma de molibdato sdico a concentraciones de 0,05, 0,01, 0,00125 gramos por litro al medio tipo Czapek anteriormente indicado. Los criterios utilizados han sido los mismos que los sealados al estudiar los macrocomponentes del substrato. Respecto de los reguladores de crecimiento hemos estudiado, por las razones a que nos referimos en la parte terica, el efecto del cido 2-4-dicloro-fenoxiactico (2-4-D), acenafteno y naftaleno. Para ello, teniendo en cuenta que la presencia de estas substancias en el medio de cultivo pueden venir alteradas por su metabolizacin,- principalmente de carcter oxidativo por el organismo, nos ha parecido preferible hacer actuar sobre el hongo vapores de los compuestos orgnicos mencionados. Para ello hemos realizado las experiencias colocando en la parte superior interna de la cpsula Petri unos miligramos de la sustancia correspondiente adheridas por medio de unas gotas de vaselina asptica. El substrato ha sido el tipo Czapek y como criterios se han utilizado los mismos que en el caso del molibdeno. Adems hemos observado en el caso del acenafteno aberraciones en los aparatos conidiales del hongo. El 2-4-D utilizado fu obtenido por nosotros al no disponer de producto comercial. Su preparacin, realizada en colaboracin con J. Sandoval, comprendi las siguientes fases. 1. Preparacin del 2-4 diclorofenol y separacin de los ismeros que le acoinpaan. 2. Condensacin del anterior con el bromoacetato de etilo. 3. Saponificacin del ster formado. 4. obtencin del cido diclorofenoxiactico. 1. Preparacin del 2 - 4 diclorofenol. Se parti de 100 gramos de fenol cristalizado que se disolvieron en 300 c. c. de actico glacial. A esta disolucin actica calentada en bao mara se le pas corriente de cloro hasta que su aumento en peso fu de 65 gramos. En total la.cantidad de cloro pasada fu inferior a la tericamente necesaria para formar el derivado diclorado, hacindose as para evitar la formacin del tricl-

METABOLISMO lUBfOCAfBONADO DEL uASI'EfGILLUS OCIIRACEVS

579

rado ms difcil de separar que el monoclorado que poda formarse en este caso. Se obtuvieron 100 gramos de producto clorado consistente en 2-4 diclorofenol, cuyo rendimiento fu de un 60 %. Este producto se separa por destilacin fraccionada del actico, recogindose los 100 gramos en la fraccin que destil entre los 205-215 C. para separar el 2-4 diclorofenol de una pequea parte de orto y para clorofenoles. 2. Condensacin del 2-4 diclorofenol con el hfomoacetato de etilo. Para obtener el ster mixto objeto de nuestro trabajo se nos ofrecan varios caminos: a) Condensar el derivado clorado con cido monocloroactico, producto ms corriente; pero ste tena el inconveniente de que el cido monocloroactico descompona el fenolato formado previamente y la condensacin no se efectuaba. b) Emplear el monocloroacetato sdico como condensante, pero entonces se tropezaba con la dificultad de la insolubilidad de ste en disolvente orgnico, medio en que deba efectuarse la condensacin. c) El camino seguido por nosotros fu emplear un ster del cido monocloro o monobromoactico que evitara los dos inconvenientes arriba citados. Prctica. Se aadieron 20 gramos de 2-4 clorofenol a una disolucin de alcoholato sdico (3 gramos de sodio en 35 c. c. de etanol absoluto), agitando hasta que todo haba reaccionado formndose el fenolato correspondiente. Agregamos seguidamente 20 gramos de bromoacetato de etilo. H u b o entonces reaccin algo violenta, que comprobamos por el aumento de temperatura de la mezcla. Calentamos seguidamente a reflujo en bao mara durante tres cuarto de hora. Comprobamos el final de la reaccin por haber desaparecido la reaccin alcalina que posea el lquido antes de calentar. A l dejar enfriar se solidific toda la masa. Evaporamos el exceso de alcohol al bao mara. El slido blanco residual se extrajo con ter, obtenindose por evaporacin de ste un lquido incoloro de t. b. 200-220 C. 3. Saponificacin del ster. El lquido incoloro obtenido tena una reaccin algo acida, quiz por haberse hidrolizado en parte debido al calentamiento en ambiente h m e d o . Por ello optamos por saponificarle todo para transformarlo en la sal sdica y de aqu obtener el cido libre. Para ello tratamos el lquido por una disolucin de 7 gramos de hidrxido sdico en 40 c. c. de agua a ebullicin con reflujo durante una hora.

580

NGEL ORTUO MAfTINEZ

El producto resultante lo aadimos a 100 c e . de agua, disolvindose completamente. 4. Obtencin propia del cido 2-4 diclorofenoxiactico. La disolucin anterior contena la sal sdica del cido disuelta. Para obtener el cido libre aadimos cido sulfrico 2N hasta reaccin francamente acida. Se separ entonces en la parte inferior un lquido oleoso de color levemente amarillento. Por decantacin separamos este lquido que por enfriamiento posterior se solidific en parte. Filtramos a la trompa los cristales del producto. El nico dato que poseamos de dicho cido era su temp. de fusin encontrada en las tablas del catlogo de la casa americana Eastman Kodak Company, que era t. f. = 131 - 136 C. El obtenido por nosotros fu de t. f. = 133 C. Como obtuvimos 15 gramos de producto el rendimiento fu del 51 % del terico; El acenafteno de origen Poulenc y el naftaleno comercial resublimado por nosotros fueron los empleados en las experiencias.

METABOLISMO HIDfOCAItONADO DEL ASPEliGILLUS OCIIfACES

581

29 SUBSTRATO TIPO Y MOLIBDATO SDICO 0,01/1000

MTODO Horas 24 48 72

MICROMETRICO Mieras . 60,52 835,36 1644,96

REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glucosa 7,1 8 7,1 8,1 10,0 11,5 ce. c.c. c.c. c.c. c.c. c.c.

Horas 0 41 65 89 113 137

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,110 0,138 0,106 0,005 0,000

VISCOSIDAD Horas 0 65 89 113 137 Tiempo cada substrato 24" 12,6" 7,4" 5,6" 4,8" Viscosidad relativa 5 2,6 1,5 1,1 1 Viscosidad especfica 4 1,6 0,5 0,1 0

582

ANGliL OHTNO MABTINEZ

30 SUBSTRATO TIPO Y MOLIBDATO AMNICO 0,05/1000

MTODO MICROMETRICO Horas 24 48 72 96 REDUCTORES' Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glucosa 7,1 5,9 6,3 5,3 6,8 7,8 ce. c.c. c.c. c.c. 0.0. 0.0. Mieras 92,88 1026,72 1749,84 2254,00

Horas 0 24 41 65 89 113

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,175 0,161 0,200 0,146 0,122

VISCOSIDAD Horas 0 41 65 89 113 137 Tiempo cada substrato 24" 13,6" 6,7" 5,8" 5,1" 4,8" Viscosidad relativa 5 2,8 1,4 1,2 1,06 1 Viscosidad especfica 4 1,8 0,4 0,2 0,06 0,00

METABOLISMO HIDROCAUHONADO DHL ASPEfGILLUS OCHliACEUSn

583

31

SUBSTRATO

TIPO Y MOLIBDATO

SDICO 0,00125/1000

MTODO MICROMETRICO Horas

24 48 72

Mieras
327,52 901,52 1751,00 -^- R E D U C T O R E S Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 grs glucosa 7,1 7,8 7,8 6,8 8,7 10,4
CO.

Horas . 0 24 41 65 89 113

Cant idad reductores grs % de glucosa 0,138 0,112 0,112 0,1590,092 0,002

"' ',

ce. c.c. c.c. c.c. c.c.

VISCOSIDAD Horas 0 41 65 89 113 137 Tiempo cada substrato 24" 20" 8" 6,2" 5,3" 5,3"

Viscosidad relativa 5 4,1 1,6 1,29 1,1 1,1

- .

Viscosidad especftca 4 3.1 0,6 0,29. 0,1 0,1 . -

584

NGEL ORTUO MARTNEZ

32

SUBSTRATO TIPO Y 2-4-D

MTODO MICROMETRICO Horas 48 72 96 REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 g r s glucosa 7,1 6,8 7,1 8,4 11,0 ce. c.c. c.c. c.c. c.c. Mieras 26,00 34,00 34,00

Horas 0 48 72 96 120

Cantidad reductores g r s % de glucosa 0,138 0,154 0,138 0,031 0,001

VISCOSIDAD Horas 0 48 72 96 120 Tiempo cada substrato 24" 17" 6" 4,8" 4,8" Viscosidad relativa 5 3,54 1,2 1,00 1,00 Viscosidad especfica 4 2,54 0,2 0,00 0,000

METABOLISMO tlDROCARBONAD DEL ASPERGILLUS OClIfACEUSi>

585

33

SUBSTRATO TIPO Y

NAFTALENO

MTODO MICROMETRICO Horas 48 72 96 REDUCTOBES Lquido substrato gastado. Benedict 5 ce=0,00985 g r s glueosa
7,1 0.0.

Mieras 37,7 97,5 160,1

Horas 0 48 72 96 120

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,222 0,416 0,222 0,025

5j8 4,5 5,8 8,5

c.o. ce. ce. c.o.

VISCOSIDAD Horas 0 24 48 72 96 120 Tiempo cada substrato 24" 24" 7,6" 6" 4,8" 4,8" Viscosidad relativa 6 5 1,58 1,1 1 1 Viscosidad especfica 4 4 0,58 . 0,1 0,00 0,00

586

NGEL OfTUNO MTINEZ

34

SUBSTRATO TIPO Y

ACENAFTENO

MTODO MICROMETRICO Horas 48 72 96 REDUCTORES Lquido substrato gastado. Benedict 5. cc=0,00985 g r s glucosa 7,1 6,1 5 5,5 6 12,5 ce. ce. ce. ce ce. ce. Mieras 217,6 988,0 1595,6

Horas 0 48 72 96 120 148

Cantidad reductores grs % de glucosa 0,138 0,197 0,319 0,252 0,205 0,000

VISCOSIDAD Tiempo cada substrato 24" 7,6" 4,8" 4,8" 4,8" Viscosidad relativa 5 1,58 1 1 1 Viscosidad especfica 4 0,58 0,00 0,00 0,00

Horas 0 48 72 96 120

METABOLISMO HIDTlOCAliliONADO DEL ASPERGILLUS OCIIFIACEUS^ Discusin de los resultados

h- I: \67(^

/.

De los resultados obtenidos se deduce que en presencia de molibdato sdico a la concentracin media utilizada es mximo el efecto acelerante en la etapa germinativa, as como el metabolismo de los eslabones de cido urnico que son consumidos tan pronto han sido liberados de la macromolcula pectnica y posteriormente para las tres concentraciones empleadas, un retardo en el crecimiento v accin pectinsica. Tambin pbr los resultados observamos una intensa accin inhibidora por parte del 2-4-D y naftaleno, sobre la formacin del micelio, la cual, es dificultada, intensificndose claramente sobre la esporulacin; esta accin obliga a un metabolismo ms intenso, que determina, a su vez, una rpida degradacin del substrato pectnico, con aparicin de elevada proporcin de fragmentos reductores que se acumulan en el medio y slo ms lenta, pero totalmente, son metabolizados a posteriori. Esta accin, que creemos abre buenas perspectivas en el camino de eliminacin de pectinas en jugos vegetales, es sobre todo destacable en el caso del acenafteno. El acenafteno influye aumentando claramente la hidrlisis de la peetina, y determinando un retardo en' su metabolismo sin que el desarrollo del micelio se afecte tan intensamente como por los otros dos compuestos estudiados.

588 *

NGEL ORTO MAI1TINEZ

INFLUENCIA DE AGENTES MUTANTE SOBRE EL METABOLISMO HIDROCARBONADO Y MORFOLOGA DEL ASPERGILLUS OCHRACEUS

Con objeto de mejorar nuestro conocimiento sobre el Asperglus ochraceus hemos investigado la influencia que ejercen soore este hongo tres sustancias de estructura tan distinta como el et-uretano, hidrato de doral, p-aminobencenosulfonaniida. Pero buscando ponerlos en condiciones fisiolgicas convenientes, hemos utilizado el medio de cultivo tipo Czapek y como fuente hidrocarbonada el hidrato de carbono que nos ha parecido ms adecuado para un control de la actividad enzimtica del hongo, la sacarosa, ya que es fcil de controlar, tanto el proceso de inversin como el consumo de las hexosas resultantes. Primeramente, siguiendo la marcha indicada en las experiencias anteriormente citadas se prepararon una serie de cultivos sobre substratos tipo Czapek y sobre el mismo se adicionaron cantidades determinadas y crecientes de cada uno de los tres agentes que estudiamos. A lo largo del desarrollo determinamos: a) Reductores actuales. h) Reductores totales, por inversin acida de la sacarosa residual. La diferencia entre estos dos valores nos d la proporcin de disacrido an no metabolizado. c) Produccin de ocracina por absorcin en fotocolormetro Etco, utilizando los filtros azul, naranja y rojo, aunque en los resultados que exponemos nos limitamos, por razones de brevedad, a los obtenidos con el filtro azul. d) pH del medio a lo largo del ciclo experimental. ) Peso de las colonias desecadas a 100-105 C. hasta peso constante. Independientemente se ha realizado un estudio microgrfico del Asperglus ochraceus en cada una de las experiencias efectuadas que describimos en la parte correspondiente de este trabajo. Se aument la concentracin en cada agente mutante hasta que observamos inhibicin completa en la germinacin (dosis letal). Entonces preparamos nuevos cultivos sobre substratos tipo, y a las 24 horas, una vez iniciada la germinacin adicionamos agente mutante a dicha dosis y superiores, continuando con las determinaciones anteriormente indicadas. Para diferenciar la actividad invertsica del metabolismo del monosacrido, hemos realizado otra serie de experiencias sobre glucosa.

METABOLISMO HIDItOCAliBONADO DHL ASPEfGlLLS OCHIUCEUSn

589

35 SUBSTRATO NORMAL (Czapek)

REDUCTOEES PRESENTES Benedict: 5 c e . = 0,013 gramos de glucosa

Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido isubstrato 7o de reductores en glucosa ' '

2 ce. ' 1 2 3 )) 5,1 10 14 19 20 21,7 B B 23 24,4 25,8 B 27,2 28,6 B 30 REDUCTORES TOTALES Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 B 0,6 1,5 )) 2,9 0,1 /o reductores en glucosa 3,2500 grs 2,6000 B 2,1666 B 0,8666 0,4482 B 0,2549 B

0,6500 grs 1,3000 0,6500 0,4333 0,2549 B 0,1300 B 0,0928 B 0,0684 B 0,0650 B 0,0599 B 0,0565 B 0,0532 r> 0,0503 B 0,0477 B 0,0454 B 0,0433 B

Das Inicial 1 2 3 4 5

/u de sacarosa presente 3,0875 grs 1,8525 B 0,8232 B 0,20577 B 0,0141 0,0000 B

500

NGEL 0/TC/A'O

MABTmiiZ

36 SUBSTRATO CON ETIL - URETANO

REDUCTORES PRESENTES Benedict: 5 ce. 0,013 grs de glucosa
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato /o de reductores . en glucosa

0,1 %

2 '(3.e. 1 1,4 2,8 4,6 9,7 13,8 18,4 19,3 B 20,8 21,9 23,5 25,0 26,1 27,0 28,6 REDUCTORES TOTALES

0,6500 1,3000 0,9285 0,4642 0,2826 0,1340 0,0942 0,0706 0,0673 0,0625 0,0593 0,0553 0,0520 0,0498 0,0481 0,0454

grs .) . .

Das" Inicial 1 2 3 4

Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 0,6 1,8 2,8

/o reductores en glucosa 3,2500 2,6000 2,1666 0,7222 0,4642 grs ))

7o de sacarosa presente 3,0875 1,8525 0,8232 0,1959 0,0000 grs B

METABOLISMO HWfOCAfHONADO DEL nASPEKGILLVS OCHfACEUSo

591

37

SUBSTRATO CON ETIL-URETANO

REDUCTORES PRESENTES

0,5 %

Benedict: 5 c. c. = 0,013 gramos de glucosa

Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato 7o de reductores en glucosa

1,9 1,1 1,5 2,1 3,2 7,5 11,6 14,8 16,0 17,2 18,6 19,8 21,0 22,6 23,5 24,6

ce.

'

0,6842 1,1818 0,8666 0,6190 0,4062 0,1733 0,1120 0,0878 0,0812 0,0755 0,0698 0,0656 0,0619 0,0575 0,0553 0,0528

grs

REDUCTORES TOTALES Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 0,6 1,0 2,1 /o reductores en glucosa 3,2500 grs 2,6000 * 2,1666 1,3000 " 0,6190 /u de sacarosa presente 3,0875 grs 1,8200 0,9355 0,4117 0,0000

Das Inicial 1 2 3 4

.592

ANGUL OliTUNO. MARTNEZ

38

SUBSTRATO CON ETIL-URETANO

REDUCTORES PRESENTES Benedict: 5 ce. = 0,013 grs de glucosa
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato

1 %

/o de reductores en glucosa

1,9 e.c. 1,2 0,8 1,0 1,3 5,3 9 10,3 )) 11,5 12,8 14 15,2 16,4 ~)) 17,6 18,8 19,0 REDUCTORES TOTALES Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 B 0,6 0,6 1,0 "/ reductores en glucosa 3,25 2,60 2,1666 2,1666 1,3000 grs

.0,6842 1,0833 1,6250 1,3000 1,0000 0,2452 0,1444 0,1250 0,1130 0,1015 0,0928 0,0855 0,0792 0,0738 0,0691 0,0684

grs ))

Das Inicial 1 2 3 4

7o de sacarosa presente 3,0875 1,8200 1,0291 0,5145 0,0000 grs

METABOLISMO HIDnOC.AfliONADO DEL ASPEfOILLUS CHRACEUSn

593

39 SUBSTRATO GON ETIL-URETANO

REDUCTORES PRESENTES Benedict: 5 ce. = 0,013 grs de glucosa
% de reductores en glucosa

1,5%

Oas Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Lquido substrato

1,9 2 0,6 0,7 0,9 1 1,2 2,5 3,9 - 5,3 6,7 8,0 9,5 11,0 12,5 14,0

ce. ,, ,, . > . > ))

0,6842 0,6500 2,5000 1,8571 1,4444 1,3000 1,0833 0,5200 0,3333 0,2452 0,1940 0,1625 0,1368 0,1181 0,1040 0,0928

grs B B B B B B B B B

REDUCTORES TOTALES Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 0,5 0,6 % de reductores en glucosa 3,25 2,60 2,60 2,50 grs "/o de sacarosa presente 3,0875 grs 1,8200 B 1,8525 0,0000 B

Das Inicial 1 2 3

594

NGEL ORTUO MARTNEZ

4.0

SUBSTRATO CON ETIL-URETANO

REDUCTORES PRESENTES Benedict: 5 ce. = 0,013 grs de glucosa
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8. 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato

2%

% de reductores en glucosa

2 0,9 0,8 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

ce.

0,6500 1,4444 1,6250 2,1666 1,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 1,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666

grs

REDUCTORES TOTALES Lquido substrato gastado 0,4 c e . 0,5 0,6 0,6 0,6 % de reductores en glucosa 3,25 2,60 2,1666 2,1666 2,1666 grs /o de sacarosa presente 3,0875 1,8525 0,6859 0,5145 0,0000 grs

Das Inicial 1 2 3 4

METABOLISMO HIDROCAFIBONADO

DEL ASPERGILLUS OCHRCEUS

595

41 SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 1 %. CON GLUCOSA

REDUCTORES PRESENTES Benedict: c. c. = 0,013 grs de glucosa Lquido substrato gastado' 0,4 0,4 0,4 0,5 0,6 0,9 1,1 3 1,5 17,5 19 20,0 23,0 24,0 25,0 26,0 26,0 ce.
B

Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16

7u de reductores en glucosa 3,2500 3,2500 3,2500 2,6000 2,1666 1,4444 1,1818 0,4333 0,1733 0,0743 0,0684 0,0650 0,0565 0,0542 0,0520 0,0500 0,0600 grs
B 1)

596

^^^^

NGEL ORTUO MAfTlNEZ

42 POTENCIOMETRIA.
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

. SUBSTRATO
m. V. 291 336 404 404 406 . 406 408 414 422 428 428 429 431 432 434 435 438

NORMAL

(Czapek)
pH 5,48 6,35 7,65 7,65 7,70 7,70 7,74 7,85 8,00 8,10 8,10 8,12 8,18 8,20 8,23 8,25 8,30

43 POTENCIOMETRIA.
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO
m. V. 290 328 360 391 398 404 406 412 428 431 434 435 438 442 443 443 446

CON ETIL - URETANO

pH . 5,48 6,20 6,80 7,40 7,55 7,65 7,70 7,79 8,12 8,18 8,23 8,25 8,32 8,39 8,40 8,40 8,46

0,1 %

METABOLISMO lUDROCABBONADO . DEL ASPERGILLUS OCHRACEUS

597

44 POTENCIOMETRIA.
Das
Inicial 1 2 3 . 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO
m. V.
290 304 324 362 394 406 .411 418 430 432 437 438 440 446 452 453 453

CON ETIL-URETANO
,pH'.
5,48 5,74 6,12 6,85 7,46 7,68 7,80 7,94 8,16 8,20 8,28 8,30 8,34 8,45 8,58 8,60 8,60

0,5%

45 POTENCIOMETRIA.
Das
Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO
m. V.
290 313 340 365 396 407 418 419 432 434 438 442 443 451 451 451 453

CON ETIL-URETANO
pH.
5,48 5,90 6,42 6,90 7,50 7,71 7,94 7,95 8,19 8,24 8,30 8,39 8,40 8,56 8,56 8,56 8,60

1%

598

ANGUL ORTUO MARTNEZ

46 POTENCIOMETRIA
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ir 12 13 14 15 16

SUBSTRATO
m. V. 290 336 340 344 346 348 354 359 360 362 364 370 375 384 386 404 407

CON ETIL-URETANO
pH

1,5%

' .

5,48 . 6,35 6,43 6,50 6,53 6,58 6,69 6,79 6,80 6,85 6,89 7,00 7,10 7,28 7,32 7,64 7,71

47 POTENCIOMETRIA.
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 16

SUBSTRATO
m. V. 290 318 338 352 352 352 360 360 360 360 364 364 364 364 364 364

CON ETIL-URETANO
. pH 5,48 6 6,40 6,65 6,65 6,65 6,80 6,80 6,80 6,80 6,88 6,88 6,88 6,88 6,88 6,88

2%

METBOUSMO HlDIiOCAKBONADO DEL ASVERGILLUS OCHUACEUS

48

POTENCIOMETRIA.
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO CON CON GLUCOSA

m. V. 290 313 340 365 396 407 418 419 432 434 438 442 443 451 451 451 453

ETIL-URETANO %
pH 5,48 5,90 6,42 6,90 7,50 7,71 7,94 7,95 8,19 8,24 8,30 8,39 8,40 8,56 8,56 8,56 8,60

49 FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO NORMAL (Czapek)

Das O 1 2 3 4 5 6 7 8' 9 10 11 12 13 14 15 16 T 100 100 95 93 90 78,5 75 71 67,5 65 62 59 56 54 53 52 51 10. O O 0,22276 0,31517 0,45757 1,05130 1,24939 1,48742 1,70696 1,87087 2,07608 2,29148 2,51812 2,67606 2,75724 2,83997 2,92430

600

NGEL

ORTfiO

MARTNEZ

50

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 0,1 %

Das
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 16

T
100 100 97 95 92 89 86 80 76 70,5 68 68 62 57 52,5 50 48

10. a
O O 0,13228 0,22276 0,36212 0,50610 0,65502 0,96910 1,19186 1,51811 1,67491 1,67491 2,00659 2,44125 2,79841 3,01030 3,18759

51

Das
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 0,5%

T
100 97,5 95 93 72 62 52 42 41,5 41,5 41 39 38,5 37 36 35 34

10. a
O 0,10995 0,22276 0,31517 1,42668 2,07608 2,83997 3,76751 3,81916 3,81916 3,87216 4,08935 4,14539 4,31798 4,43617 4,55932 4,68521

'

MUTABOUSM

HIDfC.AffiNAD DEL uASPERUMS C'HRACEUS .

601

52

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 1%

Das O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 100 97,5 95 93 72 62 52 42 41,5 41,5 41 39 38,5 37 36 35 34 10. O 0,10995 0,22276 0,31517 1,42668 2,07608 2,83997 3,76751 3,81916 3,81916 3,87216 4,08935 4,14539 4,31798 4,43697 4,55932 4,68521

53

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL . SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 1,5%

Das Inicjal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 100 98 97 96 92 89 86 80 73 68 65 62 59 56 52 50 49 10. O 0,08774 0,13228 0,17729 0,36212 0,50610 0,65502 0,96910 1,36677 1,67491 1,87087 2,07608 2,29148 2,51812 2,83997 3,01030 3,09804

G02

NGUL OfTUl^O MARtfNEZ

54

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 2 %

Das
Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 li 12 13 14 15 16

T
100 97,5 95 93 91,5 90 88,5 87 86 85 84 83 ' 81,5 80,5 79 78 76

10. a
. 0 0,10995 0,22276 . 0,31517 0,38579 0,45757 0,53057 0,60481 0,65502 0,70581 0,75721 0,80922 0,88842 0,94204 1,02373 1,07905 1,19186

55 FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 7%. CON GLUCOSA

Dios 0 1 2 3 4. 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 re T 100 97,5 95 93 72 62 52 42 , 41,5 41,5 41 39 38,5 37 36 35 34 10: o 0,10995 0,22276 0,31517 1,42668 2,07608 2,83997 3,76751 3,81916 3,81916 3,87216 4,08935 4,14539 4,31798 4,43617 4,55932 4,68521

METBUSMO mbfcARfNbb buL AsPufiiLLs cHfAaws,, 56 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO Das O 2 3 4 5 6 7 8. 9 10. 11 12. 13 14 15. 16 NORMAL (Czapek) Gramos 0,0517 0,2097 0,3995 0,3694 0,3542 0,3486 0,3236 0,3213 0,3189 0,3171 . 0,3155 0,3139 0,3121 0,3110 0,3093

63

57
Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO Das Inicial 1 2 3 4 5 6 . 7 8 9. 10. It 12 13 14 15 li6' CON ETIL-URETANO Gramos 0,0148 0,0566 0,1794 0,2324 0,3037 0,3184 0,3197 0,3375 0,3539 0,3598 0,3590 0,358a 0,3579 0,3536 0,3496 0,3435; 0,1%

604

ANGliL RTUi^O MAfTINEZ

58 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 0,5 % '
Das1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 . Gramos 0,0396 0,0978 0,1953 0,2159 0,2986 0,3065 0,3078 0,3094 0,3126 0,3146 0,3115 0,3098 0,3087 0,3068 0,3048

59 Peso de las colonias del. Aspergillus ochraceus desecadas peso constante SUBSTRATO CON ETIL-URETANO 1% Das
1 2 3 4 5 6 7 8 9 .10 11 12 13 14 15 16

hasta

Oramos
0,0363 0,0831 0,1334 0,1602 0,2376 0,2891 0,2982 0,2998 0,3013 0,3059 0,3179 0,3112 0,3092 0,3059 0,3015

MBTAliOUS.MO UIDIiOCAtliONADO DEL ^^ASPERGILLIJS OCHRACEVS,^

605

, 6 0 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO
Dias 1 2 3 4 5 6 7 ^ 8 9 10 11 12 13 14 15 16

CON ETL - URETANO

Gramos 0,0094 0,0160 0,0213 0,0286 0,0318 0,0892 0,1020 0,1268 0,1475 0,1668 0,1822 0,1896 0,2019 0,2476 0,2847 0,2988

1,5 %

61 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO Dias
1 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

CON ETIL-URETANO Oramos

0,0397 0,0441 0,0472 0,0486 0,0497 0,0512 0,0517 0,0574 0,0586 0,0589 0,0592 0,0594 0,0597 0,0605

2%

606

NGEL OfTUNO MARTNEZ

62 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON ETIL-URETANO
Pas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

%. CON
Gramos

GLUCOSA

0,0581 0,0742 0,1086 0,1948 0,2146 0,2404 0,2915 0,3089 0,3142 0,3165 0,3116 0,3098 0,3026 0,3011

MlTAliOLlSMO HIDHOCABBONADO DHL ASPERGILLUS OCIBACEUSy>

607

63 SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2%

REDUCTORES

PRESENTES

B e n e d i c t : 5 c e . = 0,013 grs de glucosa Das Inicial 1 2 3 4. 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato 1,7 1,6 1,0 0,8 0,7 0,8 1,3 3,0 3,6 8,5 8,7 9,0 9;6 10,5 11,5 12,5 c.c. 7o de reductores en glucosa grs 0,7647 0,8125 1,3000 1,6250 1,8573 1,6250 1,0000 0,4333 0,3611 0,1529 0,1494 0,1444 0,1354 0,1238 0,1130 0,1040 TOTALES

7o

REDUCTORES Das Inicial 1 2 3 4 5 Lquido substiato gastado 0,4 c. c. 0,4 .) 0,4 ,) 0,5 )) 0,6 )) 0,7 ))

/o reductores en glucosa 3,2500 3,2500 3,2500 2,6000 2,1666 1,8573 grs B

de sacarosa presente 3,0875 grs 2,3610 2,3156 1,2550 0,5145 0,0000

608

NGEL ORTUNO MARTNEZ

64 SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,3 %

REDUCTORES PRESENTES Benedict: 5 o.c. = 0,013 grs de glucosa

Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato ce. .

% de reductores en glucosa 0,7647 1,0000 2,1666. 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 grs ))

1,7 1,3 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

REDUCTORES Das Inicial 1 2 3 4 Lquido substrato gastado 0,4 o.c. 0,4 0,5 0,5 0,5

TOTALES '/o de sacarosa presente 3,0875 grs 2,3610 s 1,5200 0,4180 0,0000

% de reductores en glucosa 3,25 3,25 2,60 2,60 2,60 grs

METABOLISMO HIDROCAfBONADO DEL ASPEJIOILLS OCHfACES,,

65 SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2 %. CON GLUCOSA

REDUCTORES PRESENTES Behedict: 5 c e . = 0,013 grs de glucosa Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato gastado 4,4 0,4 0,4 0,5 0,8 1,4 4,0 5,6 8,5 10,3 11,5 1L5 12,6 13,5 13,6 13,5 13,5 ce. )) . 7 de reductores en glucosa 3,2500 3,2500 3,2500 2,6000 1,6250 0,9286 0,3250 0,2321 0,1529 0,1262 0,1130 0,1130 0,1032 0,0963 0,0963 0,0963 0,0963 grs

610

ANGL fTUNO MAFITINEZ

66 POTENCIOMETRIA SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL

Dios Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 mV. 289 292 308 331 357 378 398 407 414 422 430 438 439 440 442 442 443

0,2 %
pH 5,45 5,50 6,81 6,25 6,74 7,15 7,55 7,72 7,85 8,00 8,15 8,30 8,32 8,35 8,38 8,38 8,40

67
POTENCIOMETRIA SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL '0,3 %
Das Inicial 1 2 3 4 6 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 mV. 290 290 299 344 362 362 362 362 362 362 362 . 3 6 2 362 362 362 362 362 pH 5,48 ' 5,48 5,65 6^50 6,86 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85 6,85

ilETAIlOUSmO

HIDROCARBONADO DEL ASPHHGLLUS OCHfACI!US

611

68 POTENCIOMETRIA SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2%. CON GLUCOSA

Das Inicial 1 2 3
4

mV. 289 292 313 326 375 401 410 417 432 427 436 438 440 440 440 440 442

pH 5,45 5,50 5,90 6,15 7,10 7,60 7,76 7,90 8,20 8,10 8,26 8,30 8,35. 8,35 8,35 8,35 8,38

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

69 FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2 %

Das O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 100 99 98 98 97,5 96 95 94 93 93 92,5 92 92 91,5 91 91 90 10. a O 0,04365 0,08774 0,08774 0,10995 0,17729 0,22276 0,26872 0,31617 0,31517 0,33858 0,36212 0,36212 0,38579 0,40959 0,40959 0,45757

612

NGEL 0/?rC//VO MAfTINF.Z

70

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,3 %

Das
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

T
100 100 100 100 100 99 98 97 97 97 96 96 96 96 96 96 96

10. a
O O O O O 0,04365 0,08774 0,13228 . 0,13228 0,13228 0,17729 0,17729 0,17729 0,17729 0,17729 0,17729 0,17729

7 1 FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2%. CON GLUCOSA
Das
Inicial 1 2 3 .4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

T
100 100 100 98 96 95 90 90 88 87 87 86 85 85 84 84 79

10. a
O O O 0,08774 0,17729 0,22276 0,45757 0,45757 0,55517 0,60481 0,60581 0,65502 0,70581 0,70581 0,75721 0,75721 1,02373

METABOLISMO HIDItOCAHHONADO DEL ASPEfGILLS OClWACEUSn

613

72 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,2% Das Gramos Inicial
1 2 3 4 - 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0,0212 0,0621 0,0682 0,1586 0,2840 0,2102 0,2744 0,2683 0,2626 0,2586 0,2532 0,2498 0,2415 0,2320

73 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante , SUBSTRATO CON HIDRATO DE CLORAL 0,3 %
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Gramos 0,0054 0,0144 0,0175 0,0440 0,0434 0,0440 0,0474 0,0490 0,0495 0,0498 0,0543 0,0590 0,0597 0,0604 0,0627

'

614

NGEL ORTUfiO MARTNEZ

Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON HIDRATO
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9. 10 11 13 14 15 16

DE CLORAL

0,2%. CON
Gramos 0,0428 0,1148 0,1942 0,2646 0,3346 0,3442 0,3524 0,3312 0,2879 0,2537 0,2216 0,2104 0,2034 0,1972

GLUCOSA

"

"o-^o

METABOLISMO HIDROCAniiONADO DEL uASPEfGlLLUS OCUBAC.KUS^

75

SUBSTRATO

CON GLUCOSA
PRESENTES""

REDUCTORES

Benedict: 5 ce. = 0,013 grs de glucosa Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato gastado 0,4 0,4 0,5. 0,8 2,6 4,2 10,2 13,5 14,0 19,0 20,5 24,0 26,0 28,0 29,5 30,0 30,0 ce.
B

% de reductores ' en glucosa 3,2500 grs 3,2500 2,6000 1,6250 0,5000 0,3095 0,1274 0,0963 0,0928 0,0684 0,0634 0,0542 0,0500 . 0,0464 0,0441 0,0433 0,0433

616

NGEL ORTUO MARTNEZ

16 SUBSTRATO CON SULFAMLAMIDA

REDUCTORES

0,05%. CON GLUCOSA

PRESENTES

Benedict: 5 c.c. = 0,013 grs de glucosa Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lquido substrato gastado. 0,4 0,4 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,8 1,1 1,4 1,6 1,8 1,9 2,4 2,6 c.c. % de reductores en glucosa 3,2500 grs 3,2500 2,6000 2,1666 2,1666 2,1666 . 2,1666 2,1666 1,8571 . 1,6250 1,1818 0,9285 0,8125 0,7222 0,6842 0,5416 B 0,5000

METABOLISMO HlDfOCIlliONADO DEL ASPERGILLUS

0C.HRACEUS

617

77

SUBSTRATO

CON SULFANILAMIDA
PRESENTES

0,05%

REDUCTORES

Benedict: 5 ce. = 0,013 grs de glucosa

Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 , 3,0 1,3 1,0 1,0' 0,9 0,8 0,7 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lquido substrato gastado ce. 7 de reductores en glucosa 0,4333 1,0000 1,3000 1,3000 1,4444 1,6250 1,8571 2,1666 2,1666 1,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 2,1666 grs B B BB B B B B

.,

TOTALES

REDUCTORES Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 . Lquido substratc) gastado 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 ce.

/ reductores en glucosa 3,2500 3,2500 3,2500 3,2500 2,6000 2,6000 2,6000 2,6000 2,1666 grs B B

/o de sacarosa presente 3,0875 2,6759 2,1375 1,8525 1,2350 1,0982 0,9262 0,7057 0,0000 grs B B B B

G18

NGEL fTVO MATINEZ

78 POTENCIOMETRIA.
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

CON GLUCOSA
pH 5,48 6,35 7,65 7,65 7,70 7,70 7,74 7,85 8,00 8,10 8,10 8,12 8,18 8,20 8,23' 8,25 8,30

SUBSTRATO
mV. 291 336 404 404 406 406 408 414 422 428 428 429 . 431 432 434 435 438

19 POTENCIOMETRIA.
Das 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO CON SULFANILAMIDA CON GLUCOSA

mV. 284 284 299 329 329 329 347 357 404 404 404 406 406 406 406 406 pH 5,35 5,35 5,65 6,22 6,22 6,22 6,55 6,75 7,65 7,65 7,65 7,70 7,70 7,70 7,70 7,70

0,05%

, '

METAUOLISM HDKOCAHRONADO

DEL ASPEflLLS CIlHACEUSx

619

80 POTENCIOMETRIA.
Das
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 . 11 12 13 14 15 16

SUBSTRATO CON SULFANILAMIDA 0,05%

mV.
284 284 284 301 315 315 345 345 358 375 391 398 398 398 398 406

pH
5,35 5,35 5,35 5,68 5,95. 5,95 6,52 6,52 6,78 7,10 7,40 7,55 7,55 7,55 7,55 7,70

81 FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL CON SUBSTRATO CON GLUCOSA

Das
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

T
100 100 ' 9 5 93 90 78,5 75 71 67,5 65 . 6 2 59 56 54 53 52 -51

10 a
O O 0,22276 0,31517 0,45757 1,05130 1,24939 1,48742 1,70696 1,87087 2,07608 2,29148 2,51812 2,67606 2,75724 2,83997 2,92430

620

ANGUL OllTUO MHTINEZ

82

FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON SULFANILAMIDA 0,05 %. CON GLUCOSA

Das
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

T
100 99 97 92 91,5 91,5 86,5 80,5 87 86 85 84 84 84 84 84

10 a
O 0,04365 0,13228 0,36212 0,38579 0,38579 0,62984 , 0,94204 0,60481 0,65502 . 0,70581 0,76721 0,75721 0,75721 0,75721 0,75721

'

' .

83
FOTOCOLORIMETRIA. FILTRO AZUL SUBSTRATO CON SULFANILAMIDA 0,05 %
Das
Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

T
100 100 98 96 95 94,5 94 94 93 . 93 93 92 92 92 " 9 2 92 92 '

10 a
O O 0,08774 0,17729 0,22276 0,24568 0,26872 0,26872 0,31517 0,31517 0,31517 0,36212 ,0,36212 0,36212 0,36212 0,36212 0,36212

METABOLISMO lUDROCAHBONADO DEL ASPEfGILLUS OC/K/ICEC/S

62:

84 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON GLUCOSA
Das 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15. 16 GrMnoa O O 0,0752 0,1840 0,2862 0,2915 0,3206 0,3451 0,3462 0,3416 0,3408 0,3352 0,3165 0,3142 0,3106 0,3058

Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO CON SULF AIL AMIDA 0,05%. CON GLUCOSA Das 1 2 3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Gramos
O O 0,0150 0,0265 0,0326 0,0369 0,0482 0,0738 0,0897 0,0952 0,1385 0,1974 0,2762 0,2994 0,3132 0,3270

622

NGEL OfTUNO MARTNEZ

86 Peso de las colonias del Aspergillus ochraceus desecadas hasta peso constante SUBSTRATO
Das Inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

CON SULFANILAMIDA
Gramos

0,05 %

0,0128 0,0216 0,0418 0,0402 0,0408 0,0838 0,0884 0,0906 0,0996 0,1017 0,1062 0,1894 0,2735

Discusin de los resultados

Etil-uretano. De los datos resumidos en las tablas anteriores se. deduce fcilmente tm comportamiento muy especfico en el etil-uretano, ya que influye extraordinariamente sobre la metabolizacin de los monosacridos, glucosa y fructuosa, resultantes en la inversin de la sacarosa. Esta accin se manifiesta claramente a concentracin del 1 %; llega a anularse prcticamente al 1,5 % y totalmente al 2 %, a pesar de que en estos dos ltimos casos, el uretano no ha actuado sobre las esporas en germinacin. Por el contrario, esta sustancia no influye sobre la secreccin de invertasa, ni aun a las concentraciones ms altas utilizadas; si acaso apreciamos una pequea activacin, ya que en presencia de uretano en todos los casos se observan la desaparicin de sacarosa al cabo de 4 das frente a los 5 que se precisan en el ensayo control.

MI;TAI30USMO

HIDROCARBONADO

DEL <,/isp/;?G/LLr;s

OCIHACI;US>,

623

Comprobamos la inhibicin del metabolismo de la glucosa en u n cultivo con etil-urelano al 1 % , observndose clara diferencia en las velocidades d e desaparicin frente al control. Respecto del p H d e l medio n o se observa u n a influencia apreciable. La producin de pigmento es afectada claramente por el etil-uretano] aumenta en comparacin con el control hasta la concentracin del agente m u t a n t e al 1 % . Es anloga al control al 1,5 % y menor al 2 % . Estos dos ltimos resultados son consecuencia de la inhibicin del desarrollo miceliano del hongo. E n presencia de glucosa con el 1 % de uretano se comporta anlogamente frente a la produccin de ocracina como en el medio con sacarosa. Hidrato de doral.El h i d r a t o ' d e cloral, aun a las concentraciones menores estudiadas, determina inhibicin intensa o total en el metabolismo de la glucosa y en la inversin de la sacarosa. Esta inhibicin, cuando es completa, se manifiesta, como es lgico, en u n a m u y pequea variacin frente al valor inicial. L a produccin de pigmento queda prcticariiente detenida. Sulfanilamida.Ya a la concentracin mnima estudiada, inhibe el metabolismo de la glucosa y manifiestamente la accin invertasa, as como la produccin de pigmento. N o hemos observado cambios morfolgicos d e inters.

BIBLIOGRAFA
(1) JANSI.V, F.. V. y MAC DOMLL, L, K. : Arch. Biochcin. - 97 - (1945).

METABOLISMO HIDROC.ARBONADO DEL SPERGILLUS OCHRACEUS

625

IV

ESTUDIO MORFOLGICO Y MICROGRAFICO DEL SPERGILLUS OCHRACEUS?.

MORFOLOGA DEL SPERGILLUS OCHRACEUS EN MEDIO CZAPEK-AGAR

COMPARADA CON LA VARIACIN OBTENIDA CUANDO EL MEDIO CONTIENE ETIL-URETANO

Las colonias del.Aspergillus ochraceus cultivadas en medio Czapekagar se extienden suavemente, de ordinario planas y zonadas en algunos casos como pueden verse en las fotografas adjuntas. El fieltro miceliano sumergido es de consistencia coricea, presentando durante el desarrollo un reverso incoloro, amarillo, naranja y finalmente de color prpura claro, Los conidiforos parten del micelio sumergido, son muy abundantes, con cabezas conidiales de color ocrceo que dan a la colonia un aspecto caracterstico. Estas cabezuelas se presentan en forma globosa o escindidas en masa conidiales, cuyo color ocre puede tener diversos grados de intensidad. Cuando lo cultivamos en medio Czapek-agar-etiluretano se presentan las colonias con aspecto flocoso, blancas al principio y con desarrollo lento; pero a medida que crecen, aparecen fragmentaciones radiales, a la vez que el centro se eleva hasta venir a ser umbohado de forma muy caracterstica, terminando el desarrollo con un aspecto totalmente rugoso. Los conidiforos son menos abundantes y por ello muy esparcidos. El color es tambin distinto al ofrecido en su desarrollo normal: primero se presenta rojo violeta y finalmente rojo pardo. El reverso violeta claro a violeta obscuro..

26

AGHL OHTUO MARTNEZ

ESTUDIO MICROGRAFICO COMPARATIVO DEL CULTIVADO EN CZAPEK O SUBSTRATO

ASPERGILLUS Y

OCHRACEUS

TIPO

CZAPEK - ETILURETANO

Coloracin vital.Empleamos para este objeto el Rojo Neutro y el Violeta Dahlia a diluciones 1/1000 para coloraciones entre porta y cubreobjetos y al 1/10.000 y 1/100.000 para inmersin, disueltos los colorantes en agua destilada. Tcnica.Colocamos una gota de Violeta Dahlia y dejamos caer enseguida una gota iTis pequea de la solucin de Rojo Neutro y en ellas suspendemos un poco de material miceliano que disociamos con agujas, cubrimos y sometemos a observacin con distintos aumentos. En el campo inicroscpico observamos la red miceliana. Inmediatamente a lo largo de cada hita aparece una red vacuolar y en el interior de las vacuolas una serie de corpsculos frecuentemente redondeados, animados de vivos movimientos brownianos y coloreados en rojo intenso: son los corpsculos inetacromticos, que luego se inmovilizan y adhieren a la pared vacuolar. Medimos estos corpsculos, los del condrioma, las vacuolas y la anchura de las hifas. Estas observaciones las seguimos durante las fases sucesivas de crecimiento paralelamente de las colonias cultivadas. Cuando a los dos o tres das van apareciendo los conidiforos, esterigmas y conidios, seguimos estas observaciones, midindolos, para comparar despus todas estas medidas con las obtenidas tras el empleo de tcnicas de fijacin. Observaciones por fijacin.De todos los fijadores empleados por nosotros el que mejor nos ha servido en nuestro caso particular ha sido el formol al 20 %. De los colorantes, el Rojo Neutro, Violeta Dahlia, Azul de Metileno, Azur I y II y Eosina, Hemalum de Meyer, etc. Por fijacin y coloracin adecuada, varias series de preparaciones de micelio en das sucesivos nos sirvieron para las medidas que fueron comprobadas con las realizadas por coloracin vital, las cuales resumimos en el cuadro adjunto.

C . n . l l V O S DI', , , \ S P K R G n , I , l S O C I I H A C K I S 1 y 2 (-11 iiicdin l|)o Czapok... 3 y 4 suhsln.li) (-(inlcMiiciHl clilurchiiu)

ASPKIlCll.l.rs

( ) ( ; 1 1 U \ ; ; K I S vu

mclin

..Czuprk.i-A

..ASI>K.IU;il.l.l S OCIIKACI'UiS cu nirdio

.,(;z;i|,ck..-cliliin'linic

..ASI>Kli(;il.l,LS OC.llUACKLS.. n i

medid

M;/M|)('k..-,iy:i

.(ASPKUGIl.l.rs

OCIIUACKIS,.

cu

iiicdio

..(:/i|ick.,-:i-.H-,l iliuclaiio

ASI'Klir.ILI.S OCIIKACKUS (]iilli\()s 011 medio ":z:t|)('k>'-:i;:ir y (!/;i|K'ki'-<'liIinTtmo

ASI>KlU;il.l.i:S OCUUACHLS. Colunias oii medio

CzapclM.-iiHar

' "^1,.
*

Microfolograjas: 1 > 2. Coiiidiloros del A S P E R C I L U S OCIIRACKIS.. (iilli\:iil() en lquido Czapek; 3 y 4. Coiiidiloios del ASPERfilLLUS ClIIlACF.r,^., en CzaiH'k-clilurelano

2
mcrololoyral,,,. AS,.KH(1,.1.1 S ( K M I K A C K r s , . . - ! . en ,,.,li - V .i, v.n iiiodio Cz:v|i(^k-('llliirohnio ,,, ,Va,.k

, -^o

Microfiihifinifiax:

1. 2 . ;i > 4 liil;is (U^l ASI'KHC.II.l.I S ()l :il U \( :Kl S c u l q u i d o ii(;/;t[K'k

ciillivncld

^ #

. ^

^ A

*
/y

Mirrojotografias: 1, Ilifas del ASPF.KC.ILMJS OC.IIUACKHS (nilliiado oii l(|ui(lo Czapck.2, Clulas giganics (claiiiidnsporas \ arlrsporas) del AS1>EUC,ILIA]S OCHRACEUS en (iZapek)) - hidrato de d o r a l

METABOLISMO HWROCRBONADO

DEL ASl'EfGlLLUS OCHfACEOS

627

MEDIDAS Aspergillus ochraceus. Cultivado en: Medio

CONIDIOFOROS :

Czapek 244,8 176 156,4 19,6 16,8 12,6 11,2 9,8 7 7 7 5,6
X X X

Medio 4,2 mieras 4,2 4 2,8 4,9 4,9 9,8' 8,4 7 3,5 2,1 2,8
0

Czapek-etiluretano 102 X 2,7 mieras 74,8 X 2,4 21,7 X 2 47,6 X 3,8 24,4 X 2,7 8,1 X 2 8,1 X 4,7 6,8 X 4 4,2 X 3,4 6,8 X 2,7 5,4 X 2 4 X 1,3

Valores m x . med. mn.

CLULA BASAL

Valores m x . med. )) mn.

VESCULAS :

X X X

))

Valores m x . tned. mn.

ESTERIGMAS PRIMARIOS :

X X X

1)

)1

Valores m x . med. mn. Medio Valores mx. med. )) mn.

CONIDIOS :

X X X

)) )) Medio C '

Czapek 12,6 x 1,96 mieras 9,8 x 2,8 7 X 2,8

zpek-etiluretano aberrantes 20 mieras 19,9 )) 15,6

ESTERIGMAS SECUNDARIOS

13,6 X 3,4 mieras 10,8 X 2,7 )) 5,4 X 2

Valores m x . )) med. )) mn.

HIFA S :

4,2 X 4,2 mieras 3,5 x 3,5 3,3 X 3,3

3.8 X 3,8 mieras 2,9 X 2,9 2,7 X 2,7 Ensanchamientos 6,8 mieras 3,81 mieras 5,4 2,7 1,31 .4,7

Valores m x . med. mn.

4,2 mieras 3,5 1,3

628
VACUOLAS:

NGEL ORTUNO MARTNEZ

Valores mx. med. mn. Valores mx. )) med. med. mn.

5,9 X 3,5 mieras 3,5 X 1,4 .1,4 X 1,4 2 0,9 0,7 0,5 0,3 X2 mieras X 0,9 X 0,7 X 0,5 . X 0,3

5,4 X 3,4 mieras 2,9 X 2,7 1,3 X 1,3 )) 1,5 X 1,5 mieras 1,3 X 1,3 ,)) 1 x 1 0,6 X 0,6 0,4 X 0,4 ))

COSPSCULOS PROTOPLSMICOS:

FORMACIN DE CLULAS GIGANTES (CLAMIDOSPORAS Y ARTROSPORAS), INDUCIDAS POR EL HIDRATO DE CLORAL EN EL <iASPERGILLUS OCHRACEUS)^
CLAMmOSPORAS :

Valores mx. )) med. mn.

ARTROSPORASI

23,1 X 16,3 mieras 17,6 X 14,2 13.6 X 13,6 36.7 34.0 34.1 13,6 X X X X 6,1 9,5 13,6 7,4 )) -

Valores mx.

med. mm.

CORPSCULOS PROTOPLSMICOS:

Valores mx. med. min.

MEMBRANA

5 X 4,3 4 X 3,4 . 0,9 X 0,9 1,3

CONCLUSIONES

Por el estudio morfolgico y mierogreo comparativo del AspergiUus ochraeeus cultivado en medio normal y substratos conteniendo etil-uretano observamos evidentes cambios morfolgicos y estructurales, correspondindose con los bioqumicos ya mencionados, que nos permiten catalogar como una variacin del Aspergillus ochraeeus, sta inducida por dicho agente qumico.

METABOLISMO UIDfOC.ABBONADO DEL ASl'ERGILLUS OCHIUCEUS

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BIBLIOGRAFA CONSULTADA

(1)

BOLLES,

A. y

HENNEGUY,

F.:

Traite

des

mthodes

techniques

de

(2) (3) (4)

(5)

l'anatomie tnicroscopique. Pars, 1902. LouSTAUj J . : Clave determinativa de las especies del gnero Aspergillus. Publicaciones de la Universidad de Murcia, 1951. NEGRONI, P . : Morjologia y Biologia de los hongos. Tcnica micolgica. Buenos Aires, 1938. PujiuLA, J . : Citologa. Barcelona, 1928.
T H O M , C H . y R A P E R , K . : A Manual of the Aspergillus. L o n d o n , 1945.

CONCLUSIONES 1." Hemos realizado un estudio desde diversos puntos de vista sobre el comportamiento del aAsprgillus ochraceus)) cultivado en substratos hidrocarbonados. ' Se han tomado como hidratos de carbono pectina, sacarosa y glucosa. 2." Hemos comprobado la actividad pectinsica y pectsica de dicha especie comparndola con las del aPenicilliutn chrysogenum)) e-n el cual ya se haba reconocido anteriormente por Phaff, encontrando una pequea variacin pectinsica, a favor del aPenicilliuin chrysogenum^^. S." Se han comprobado las actividades de pectinasas segregadas por ambas especies, encontrando ser mucho ms activa la procedente del uAspergillus ochraceusv. Este resultado, en comparacin con el deducido anteriormente, lleva a la conclusin de que si bien el vPenicillium chrysogenumn elabora mayor proporcin de enzimas, la del .Aspergillus ochraceus-)^ es ms activa. 4." Se ha estudiado la influencia de los elementos minerales componentes del substrato tipo Czapek sobre el metabolismo pectnico del ^Aspergillus ochraceus^y, siendo notorio el hecho de que la ausencia del ion fosfato determina una hidrlisis completa de la pectina a cido galacturnico que posteriormente se metaboliza con gran dificultad. 5." As mismo hemos investigado la influencia del molibdeno aportado como molibdato sdico, encontrando una intensificacin del metabolismo, mximo para la concentracin media utilizada de 0,01 gramos por litro.

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6." Se estudia la influencia del cido 2-4-diclorofenoxiactico (2-4-D), naftaleno y acenafteno sobre el metabolismo del <.<.Aspergillu's ochraceus, actuando dichas sustancias en m u y pequeas concentraciones sobre el hongo, mediante una nueva tcnica en fase area en la que se evita la accin perturbadora de los productos en que pueden transformarse aquellas sustancias cuando se encuentran en el medio de cultivo. Se deduce una intensificacin del metabolismo acompaada de una inhibicin en el desarrollo del micelio y en la esporulacin por el 2-4-D y naftaleno, y menos en el caso del acenafteno. 7." Se ha determinado la influencia que estos agentes qumicos tienen sobre el metabolismo hidrocarbonado y morfologa del aAspergillus ochraceus)) a concentraciones variables de etil-uretano, hidrato de doral y sulfanilida, deduciendo u n comportamiento m u y especfico en el primero, ya que provoca cambios extraordinarios en la morfologa del hongo e inhibe el metabolismo de los monosacridos glucosa y fructosa, sin influir en la secrecin de invertasa, si acaso se observa cierta activacin. T a m b i n influye sobre la produccin de pigmento con una dosis ms ptima del 1 %. El hidrato de doral provoca cambios de morfologa, pero inhibe tanto el metabolismo de la glucosa y la inversin de la sacarosa como la produccin de pigmento. Con la sulfanilida slo observamos intensa inhibicin en el metabolisfno y desarrollo del hongo, no confirmndose sobre l la posibilidad de u n a accin variante. 8." Se h a n estudiado los cambios morfolgicos y microgrficos del Aspergillus ochraceus)) frente a los agentes indicados anteriormente y en comparacin con el desarrollo sobre substrato normal Czapek. 9.* Se hace u n estudio de la estructura biofsico-qumica de los hongos.

Est trabajo se ha realizado en los Laboratorios de Biologa y Qumica Orgnica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Murcia bajo la direccin de los Profesores Loustau y Soler. Hago presente mi agradecimiento al Instituto de Farmacologa Espaola (Fundacin Marqus de Urquijo), al Instituto Alonso Barba del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas y a la Agrupacin de Fabricantes de Conservas Vegetales de Murcia por la ayuda que me han prestado a lo largo del desarrollo de este trabajo.