Manual de Laboratorio Bioquímica II

Práctica Nº 8
Extracción de ADN y electroforesis en geles de agarosa
El trabajo se realizará de forma personal.

Mesa 1

Integrante: Jhonathan Félix Tarazona Salazar

I. INTRODUCCIÓN

Toda la información genética contenida en cada célula (genoma), reside en la larga macromolécula enrollada de
DNA. El mensaje que lleva la información se expresa o procesa de dos maneras básicas: por duplicación exacta del
DNA para que pueda ser transferido a la célula hija durante la división celular, y por expresión almacenada,
fabricando primero RNA y luego las proteínas, herramientas moleculares que realizan las funciones de la célula. En
esta forma indirecta, el DNA ejerce sus efectos fundamentales, al controlar las miles de reacciones químicas que
ocurren en una célula.

El lenguaje para almacenar la información en el DNA consiste en un alfabeto de cuatro letras: A, T, G y C. El formato
para almacenarla es una secuencia lineal de los nucleótidos en DNA que varía en tamaño y secuencia con cada
especie. Por ejemplo, el genoma humano completo tiene aprox 1.8 m de longitud y contiene un número estimado de
3 mil millones de pares de nucleótidos. Una molécula de DNA de E. coli mide cerca de 2 µm de largo y contiene
alrededor de 4 millones de pares de nucleótidos.

Ahora bien, ¿Por qué se eligió al DNA para la función más importante en la célula?, se ha encontrado que la
molécula de DNA es particularmente estable en condiciones tanto intra como extracelulares. Los enlaces covalentes
que unen a cada subunidad de nucleótido son químicamente estables y no son susceptibles de experimentar ruptura
hidrolítica en el medio acuoso de la célula. Esto establece una forma segura y duradera de almacenamiento de la
información genética, que no debe alterarse ni dañarse de generación en generación.

Los bioquímicos descubrieron que el DNA se puede extraer de especímenes de museo y muestras arqueológicas de
varios millones de años. Se han detectado y analizado muestras de DNA de pieles de animales de museo (de 140
años), de una momia egipcia (de 5000 años), de un cerebro humano de 8000 años, de una planta de 45 000 años,
de huesos de un dinosaurio de 65 millones de años y de un escarabajo conservado en ámbar de 120 millones de
años. Las moléculas de DNA aislado de muestras antiguas son de menor tamaño y tienen modificaciones químicas

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por los procesos de la oxidación natural. No obstante, con el empleo de la técnica denominada reacción en cadena
de la polimerasa, es posible reconstruir fielmente el DNA y amplificar la producción de moléculas idénticas.

Por tanto, la extracción y purificación de ADN de alta calidad es un prerrequisito para su uso en técnicas de biología
molecular como PCR, fingerprinting, clonaje, secuenciación, digestión con enzimas de restricción, etc. Es
conveniente obtener una buena cantidad de ADN cuando la muestra lo permite y que éste se encuentre lo más
limpio y puro posible, libre de contaminantes como proteínas básicas, ARN, carbohidratos, etc., que pueden
bloquear la acción del tratamiento al que someteremos a dicho ADN. Por ejemplo, las proteínas básicas pueden
inhibir la entrada de ADN en el gel de electroforesis.

Existen una variedad de métodos para aislar el ADN de la célula, a continuación se presentan los pasos generales
para la obtención de ADN:

● Lisis de la membrana celular. La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana
celular y nuclear, para lo cual la muestra se trata primero con un buffer de extracción, que contiene
generalmente Tris - HCl, EDTA y SDS (tratamiento químico) y proteinasa K (digestión enzimática). En este
método, la proteinasa K y el detergente (SDS) contenido en el tampón de extracción provocan la lisis de la
membrana. Una vez que se han roto las membranas de la célula, se purifica el ADN.
● Extracción y purificación. La extracción se efectúa con los disolventes orgánicos con el fin de eliminar los
contaminantes del ADN. La combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico se utiliza con el objetivo
de desnaturalizar y eliminar las proteínas. 
● Precipitación. Para concentrar el ADN suele realizarse la precipitación utilizando alcohol absoluto o
isopropanol y acetato de sodio, en estas condiciones el detergente que es más soluble en alcohol que en
agua, puede eliminarse, mientras que los ácidos nucleicos precipitan.
● Lavado. Generalmente se realiza con etanol al 70% para eliminar posibles inhibidores de la PCR.
● Disolución del ADN. Se suele utilizar buffer TE (Tris 10 mM-EDTA 1mM) o agua grado PCR (libre de
nucleasas).

II. OBJETIVOS

● Simular la manipulación de los insumos y los reactivos que se utilizan convencionalmente para la extracción de
ADN.
● Evaluar la calidad del ADN extraído mediante espectrofotometría.
● Brindar una visión general de la electroforesis de los ácidos nucleicos.
● Caracterizar los ácidos nucleicos usando electroforesis en geles de agarosa.

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III. MATERIALES:

● Vídeo extracción de ADN método fenol/cloroformo https://www.youtube.com/watch?v=yuvQOVYmWZg

● Vídeo extracción de ADN (https://www.youtube.com/watch?v=58ByqAmlF7o)

● Vídeo cuantificación de ADN (https://www.youtube.com/watch?v=GEjGjCtEWcA)

● Tutorial de electroforesis de ADN en geles de agarosa (https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/)

● Video electroforesis de ADN en geles de agarosa (https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38)

● Artículos científicos

IV. PARTE PROCEDIMENTAL

1. Condiciones del área de trabajo para la extracción de ácidos nucleicos

2. Condiciones de la muestra biológica. Fuentes de ADN para la investigación en el área toxicológica

3. Protocolo de extracción de ADN

Se simulará la utilización del método fenol/cloroformo

Lisis celular:
Se puede trabajar a partir de tejido celular o células en cultivo, dependiendo de la cantidad se
adicionará un volumen determinado de reactivos. Considerando 20-80 mg de tejido (animal o
vegetal) o 105-108 células (células en cultivo, glóbulos blancos a partir de sangre total).
A cada muestra se agregará 600 μl del tampón de lisis (KCl 50mM; Tris-HCl pH 8,3 50mM; MgCl 2
50mM; NP-40 Sigma 0,45%; Tween 20 0,4%, proteinasa K 0,1 μg/μl). Incubar la mezcla de
reacción durante 1 h a 56ºC en agitación constante.
Extracción y purificación:

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Transcurrido el tiempo, adicionar 1 volumen de fenol y agitar por inversión durante 5 min;
centrifugar 5 min a 7000 g, en un tubo nuevo tomar la fase acuosa (Aprox 550 mL).
Agregar 1 volumen de la mezcla fenol/cloroformo (1:1) y agitar por inversión durante 5 min y agitar
por inversión durante 5 min; centrifugar 5 min a 7000 g, en un tuvo nuevo, tomar la fase acuosa
(Aprox 500 mL).
Añadir 1 volumen de cloroformo y agitar por inversión durante 5 min; centrifugar 5 min a 7000 g, en
un tubo nuevo, tomar la fase acuosa (Aprox 450 mL).

Precipitación
A la última fase acuosa recuperada se adicionará 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M y 1
volumen de isopropanol; la mezcla se agita suavemente y se mantiene a -20ºC durante 30 min,
centrifugar a 7000 g durante 5 min y desecharar el sobrenadante.
Lavado
El pellet obtenido será lavado con 1 mL de etanol 70%, se centrifuga a 7000 g durante 5 min, se
desecha el sobrenadante. Las muestras se seca a temperatura ambiente para eliminar las trazas
de etanol.

Elución del ADN purificado

Finalmente el pellet recuperado y libre de etanol se disuelve con 30 μl de tampón TE (Tris 10 mM-
EDTA 1mM) o agua grado PCR (libre de nucleasas). La pureza y la concentración del ADN se
determinará por espectroscopia a 260 y 280 ηm.

Elaborar un flujograma e indicar en cada paso dónde se encuentra el ADN

4. Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

Una vez extraído el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es mediante la
cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la cantidad de ácidos nucleicos totales,
proteínas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente, etc.

Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de radiación a 260 nm.
Este pico de absorción se debe a la presencia de las bases púricas y pirimídicas. El ADN bicatenario

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presenta una absorción menor que el monocatenario, debido a que el emparejamiento de las bases (por
enlaces de puentes de hidrógeno) reduce la absorción de la luz ultravioleta. Esta particularidad es
aprovechable en la cuantificación de ADN; una buena proporción se encuentra en el rango de 1,7 a 1.9, sin
embargo, así como encontramos ADN en la muestra, también se encuentran contaminantes tales como
proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso positivo. Es decir, la absorbancia a 260nm no es
específica para ADN.

5. Evaluación de la integridad de la muestra de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa

La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas, esta separación tiene lugar
debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la
influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Debido a su carga
eléctrica negativa, los ácidos nucleicos pueden migrar a través de una matriz cuando un campo eléctrico es
aplicado sobre ella, separándose en base a la diferencia de sus pesos moleculares. La naturaleza del
enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condicionarán la carga de un ácido nucleico.

La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente son horizontales y

requiere de dos elementos indispensables:

La fase móvil. Es el medio amortiguado (Buffer) que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia
los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. TAE o TBE

Solución TAE 50X (Solución stock)

Tris 242 g
Ácido acético 57.1 mL
EDTA 0.5 M 100 mL
Ajustar a pH 8
Solución TBE 10X (Solución stock)
Tris 108 g
Ácido bórico 55 g
EDTA 0.5 M 40 mL
Ajustar a pH 8

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La fase estacionaria o soporte. Es un polímero de naturaleza gelatinosa con un tamaño de poro

homogéneo que se haya sumergido y embebido en la fase móvil, por lo general se utiliza agarosa, un
polímero lineal, extraído de un alga marina.

Los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido hasta que se consigue una solución
transparente y límpida. Posteriormente la solución se coloca en un molde y se deja solidificar. Una vez que
esto sucede, la agarosa forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración misma de
la agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN, cargado negativamente a pH
neutro, migra hacia el ánodo. No obstante, existen una serie de factores que afectan o modifican la tasa de
migración del ADN en geles de agarosa:

1. Tamaño de la molécula de ADN: Las moléculas lineales de ADN doble cadena, migran a través de
la matriz del gel a tasas que son inversamente proporcionales al log10 del número de pares de bases
que contienen. Las moléculas más grandes migran mucho más lentamente debido a que sufren una
gran fricción y resistencia en el avance ya que se arrastran a través de los poros del gel durante la
corrida menos eficientemente que las moléculas pequeñas.

2. Concentración de la Agarosa: Un fragmento lineal de ADN de un tamaño dado migra a diferentes

tasas a través de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa.

En la Tabla 1 se presenta la relación entre la concentración de agarosa y la resolución de los

fragmentos de ADN que se puede visualizar.

Tabla 1: Rango de separación en geles conteniendo diferentes concentraciones de agarosa.

Porcentaje de agarosa en gel Resolución del tamaño de ADN en kb

(p/v)
0.3 5-60
0.6 1 a 20
0.7 0.8 a 10
0.9 0.5 a 7
1.2 0.4 a 6
1.5 0.2 a 3
2.0 0.1 a 2

3. Voltaje aplicado: A bajo voltaje, la tasa de migración de fragmentos lineales de ADN es proporcional al
voltaje aplicado.

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4. Composición del Buffer de corrida: La movilidad electroforética del ADN es afectada por la composición
y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (p.e. si se omitiera el buffer de corrida
por error) la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra, si lo hace, muy lentamente. En buffers con
elevada fuerza iónica (p.e. si por error se utiliza el buffer de corrida al 10X) la conductividad eléctrica es
muy eficiente generándose calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. El
buffer más utilizado generalmente es TAE aunque su capacidad de buffer es un tanto baja y en
electroforesis prolongadas tiende a agotarse durante la corrida (el ánodo se vuelve alcalino y el cátodo
ácido). El TBE, aunque un poco más caro, posee una capacidad de buffer significativamente mayor. El
buffer comúnmente utilizado para electroforesis de ADN de simple cadena desnaturalizado es el TAE 1X.

Visualización del ADN en gel de agarosa. La tinción con bromuro de etidio, es el método más empleado de
visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y es considerado como el agente que se intercala entre
las bases nitrogenadas presentando fluorescencia cuando se incide radiación ultravioleta.

Procedimiento para la electroforesis de muestras de ADN en geles de agarosa

1. Preparar el gel de agarosa al 1%, pesar agarosa suficiente para 30 ml de buffer TAE 1X.
2. Fundir la agarosa en un horno microondas.
3. Dejar enfriar por 6 min agitando suavemente con movimientos circulares.
4. Colocar la agarosa en el molde para electroforesis horizontal con un peine de 8 pozos.
5. Una vez que gelifique retirar el peine y colocar el molde en la cámara de electroforesis horizontal y agregar
buffer TAE 1X hasta cubrir el gel.
6. Colocar 4 µL del ADN muestra y 1 µL del buffer de carga (Loading de carga 6X 0.25% azul de bromofenol
0.25% xylen cyanol FF 30% de glicerol en agua)
7. Correr el gel a 80 V constante del polo negativo al polo positivo por 30 minutos.
8. Luego de este tiempo teñir el gel con una solución de bromuro de etidio.
9. Visualizar el gel en un transiluminador.
10. Fotodocumentar y describir lo que se observa.

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RESULTADOS PARA EL INFORME

Desea realizar una prueba de PCR para determinar un polimorfismo asociado a la respuesta a un
determinado tóxico en 4 pacientes, para lo cual extrae sangre utilizando el método fenol/cloroformo.
El ADN de cada paciente fue disuelto en 25 ul del tampón TE. Ha diluido 5 µL del ADN purificado en un
volumen de 1000 µL de agua destilada libre de nucleasas. A continuación ha medido la absorbancia de la
muestra diluida a 260 y 280 ŋM y ha obtenido las siguientes lecturas. Considere que una solución de ADN a
una concentración de 50 ug/mL tiene una absorbancia a 260 ŋM igual a 1.0.
1 2 3 4
Abs 260 nM 0.435 0.63 0.545 0.767
7
Abs 280 nM 0.195 0.45 0.289 0.536
8
Concentración de ADN en
ug/ul
Ratio
Rendimiento en ug
Rendimiento en ug de
ADN/mL de sangre

Para la electroforesis en geles de agarosa tomó 4 ul de cada muestra que mezcló con 1 ul del tampón de
carga.

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