Uso de citometría de flujo para el recuento rápido y

preciso de cepas de Leptospira patógenas vivas

La enumeración de Leptospira , el agente causante de la leptospirosis, es ardua
principalmente debido a su lenta tasa de crecimiento. Aún faltan herramientas
rápidas y confiables para numerar las leptospiras. El estándar actual para
los cultivos de Leptospira es el recuento de la cámara de Petroff-Hausser bajo
microscopía de campo oscuro, pero este método sigue siendo lento, requiere
operadores bien entrenados y carece de reproducibilidad. Aquí presentamos el
desarrollo de una técnica de citometría de flujo para contar
leptospiras. Demostramos que tras la adición de tintes fluorescentes, necesarios
para discriminar la población bacteriana de los desechos, varias Leptospira vivaslas
cepas podrían enumerarse en diferentes estados fisiológicos. Los títulos de
citometría de flujo estaban altamente correlacionados con los recuentos con
cámaras de Petroff-Hausser (R 2 > 0,99). Ventajas de la citometría de flujo se
encuentran en su rapidez, su reproducibilidad significativamente más alta que el
método de Petroff-Hausser y su gama de linealidad amplia, de 10 4 a
10 8 leptospiras / ml. Por lo tanto, la citometría de flujo es una herramienta rápida,
reproducible y sensible que representa una tecnología prometedora para
reemplazar las técnicas actuales de enumeración de Leptospira en cultivo. También
pudimos enumerar Leptospira en orina y sangre infectadas artificialmente con un
límite de sensibilidad de 10 5 leptospiras / ml y 10 6 leptospiras / ml,
respectivamente, demostrando la viabilidad de utilizar la citometría de flujo como
herramienta de primera línea para el diagnóstico o estudios de diseminación
bacteriana.

Introducción
La leptospirosis es una zoonosis emergente en todo el mundo que afecta a más
de 1 millón de seres humanos por año con aproximadamente 60.000 muertes
(Costa et al., 2015). La enfermedad es causada por la espiroqueta Leptospira , una
bacteria en forma de espiral que suele medir entre 6 y 20 μm de longitud y 0,1 μm
de diámetro con extremos ganchudos distintos (Cameron, 2015). Aún faltan
herramientas para manipular este organismo. En particular, su enumeración rápida
y confiable sigue representando un desafío técnico. Los métodos clásicos como el
recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) no son adecuados para las
pruebas de rutina considerando la tasa de crecimiento lento de las leptospiras. El
tiempo de duplicación de las especies patógenas varía de 6 ha 18 h (Cameron,
2015). 1 a 2 Se requieren semanas de incubación para alcanzar la fase estacionaria
temprana en cultivos líquidos y> 4 semanas para obtener colonias en placas de
agar (Picardeau, 2015). El método estándar actual para enumerar Leptospira en
cultivos es el recuento de bacterias móviles en una cámara de Petroff-Hausser bajo
microscopía de campo oscuro. Debido a la alta movilidad de Leptospira dentro o
entre campos del microscopio, este método sigue siendo lento, requiere un operador
bien capacitado y carece de reproducibilidad (Murray et al., 2010). Se han realizado
esfuerzos para desarrollar otras técnicas de enumeración. La determinación de la
densidad óptica es rápida pero no cuantifica la
viabilidad. Además, Leptospiramuestran propiedades de absorbancia baja
(Schreier et al., 2009) y, como consecuencia, se requieren al menos 10 7 a
10 8 bacterias / ml para una DO detectable con un máximo de 1 para cultivos en
fase estacionaria. Por tanto, esta técnica tiene una sensibilidad y precisión
limitadas. Otros métodos como la medición de la resistencia eléctrica con un
contador Coulter (Humberd et al., 2005) o la PCR cuantitativa en tiempo real basada
en la cuantificación del ADN (Lambert et al., 2012, Lourdault et al., 2009) también
se utilizaron en Leptospira pero no permita discriminar leptospiras vivas de
muertas. Los enfoques de bioluminiscencia han sido desarrollados en 1986 por
Nervig y sus colaboradores utilizando un ensayo de ATP, que requiere mucha mano
de obra y es válido solo en el rango limitado de 4 × 10 8a 8 × 10 9 leptospiras /
ml (Nervig et al., 1986). Más recientemente, Murray y sus colegas modificaron cepas
Manilae y Patoc insertando el casete luxCDABE en sus genomas, lo que resultó en
un método de conteo eficiente pero restringido a cepas modificadas genéticamente
(Murray et al., 2010). Por lo tanto, todavía falta un método rápido y sensible para la
enumeración de leptospiras vivas.
En los últimos años, la citometría de flujo (FCM) se ha utilizado cada vez más en
diversos campos de la microbiología como la medicina (Karo et al., 2008, Kempf et
al., 2005, Saito et al., 2005, Schmidt et al., 2006, Shrestha et al., 2011, Shrestha et
al., 2012), estudios ambientales (Casamayor et al., 2007, De Roy et al., 2012,
Füchslin et al., 2010, Taguri et al., 2011) y la industria alimentaria. (Comas-Riu y
Rius, 2009, Gunasekera et al., 2000). En 2003, el FCM se aplicó a las leptospiras
como una herramienta de diagnóstico serológico para cuantificar la agregación de
bacterias en contacto con sueros de pacientes, pero no para caracterizar y contar
estas bacterias a nivel de una sola célula (Yitzhaki et al., 2004). El FCM también se
utilizó para enumerar de manera eficiente las espiroquetas Borrelia
burgdorferi (Bakker et al., 2007) y Treponema denticola(Orth et al., 2010). Aquí,
describimos un método de citometría de flujo rápido, reproducible y sensible para
enumerar Leptospira viva en cultivo. También demostramos la viabilidad de utilizar
la citometría de flujo como herramienta de primera línea para el diagnóstico o
estudios de diseminación bacteriana.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Las cepas bacterianas y las condiciones de cultivo
Leptospira interrogans serogrupos Australis, Canicola e Icterohaemorrhagiae se
cultivaron en medio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) a 29 ° C y
80 rpm. Se siguió la cinética de crecimiento de la cepa Australis después de la
inoculación de 1 ml de un cultivo de fase media logarítmica en 50 ml de medio
EMJH fresco y se enumeró durante 9 días usando métodos de citometría de flujo y
Petroff-Hausser (ver más abajo). Las cepas de Canicola e Icterohaemorrhagiae se
enumeraron en 3 puntos correspondientes al inicio de la fase logarítmica, la fase
logarítmica media y la fase estacionaria. Cuando fue necesario, las bacterias se
diluyeron en solución salina (Gibco). Los cultivos muertos se obtuvieron
calentando a 70 ° C durante 10 min. Se obtuvo una mezcla de bacterias frescas y
muertas mezclando 500 µl del cultivo fresco con 500 µl del cultivo muerto. Para el
análisis de leptospiras en muestras biológicas, se recogieron muestras de sangre
y orina estériles de tres perros sanos (Merial, Francia). Las muestras de sangre se
almacenaron en tubos recubiertos de heparina. Se añadieron 50 µl de leptospiras
puras o diluidas del serogrupo Australis por triplicado en 450 µl de orina o sangre.
Cuando se indicó, estas preparaciones de sangre y orina infectadas artificialmente
se diluyeron en solución salina.
2.2. Enumeración de Leptospira usando la cámara de recuento de Petroff-Hausser
Se enumeraron las leptospiras móviles vivas en una cámara de recuento de
Petroff-Hausser bajo un microscopio de campo oscuro con un objetivo × 40
(Eclipse Ni, Nikon). Se realizaron diluciones apropiadas en solución salina por
triplicado. Cada suspensión se cargó en una cámara de recuento y cada cámara
fue analizada por 2 operadores. Las enumeraciones se realizaron inmediatamente
después de la preparación de los portaobjetos para evitar la adhesión o el
movimiento de las bacterias a los bordes de los portaobjetos. Los recuentos
MANUSCRITOS ACEPTADOS MANUSCRITOS ACEPTADOS 6 se realizaron
sobre los 5 cuadrados grandes en la diagonal de la cámara, que contenían 16
cuadrados pequeños cada uno.
2.3. Tinción de Leptospira
Las suspensiones de Leptospires se tiñeron con dos tintes del kit de viabilidad
bacteriana LIVE / DEAD® BacLight ™ (L7012, Life Technologies) añadidos a una
dilución de 1: 1000 cada uno: SYTO® 9, un colorante de ácido nucleico verde
fluorescente que tiñe todas las células y yoduro de propidio (PI), un colorante de
ácido nucleico rojo fluorescente de alta afinidad que tiñe solo las células con
membranas alteradas. Las longitudes de onda máximas de excitación y emisión son
respectivamente de 485 nm y 498 nm para SYTO® 9, y de 535 nm y 617 nm para
PI. Las leptospiras se agitaron en vórtex poco después de la adición de los tintes,
se incubaron durante 3 minutos en la oscuridad y se agitaron en vórtex una segunda
vez justo antes del análisis por citometría de flujo.
2.4. Análisis de Leptospira usando citometría de flujo
Los análisis se realizaron en el BD Accuri ™ C6 (BD Biosciences). Este citómetro
de flujo de sobremesa y listo para usar está compuesto por un láser azul que emite
a 488 nm, un detector de dispersión directa (FSC) a 0 °, un detector de dispersión
lateral (SSC) a 90 °, un detector de fluorescencia verde a 533 ± 15 nm y una roja>
670 nm. No se requieren ajustes de voltaje. Un cálculo automático permite la
determinación del recuento absoluto de eventos por microlitro. Los ajustes se
ajustaron como sigue: velocidad de análisis a 14 µl / min; ejecuciones limitadas en
tiempo (35 s para ensayos de viabilidad y 90 s para estudios de linealidad en EMJH,
orina y sangre), o en número de eventos (20.000 para viabilidad y correlación con
estudios de Petroff-Hausser). Los datos se adquirieron a través del software BD
Accuri ™ C6 y se recopilaron en 2 gráficos en escalas logarítmicas: SSC versus
FSC, o canal de fluorescencia roja (renombrado PI para mayor claridad,
correspondiente a fluorescencia roja) versus canal de fluorescencia verde
(renombrado SYTO® 9 para mayor claridad, correspondiente a la fluorescencia
verde). Los umbrales de adquisición se aplicaron en el parámetro FSC (1,000,
unidades arbitrarias) o en el parámetro de canal de fluorescencia verde
MANUSCRITO ACEPTADO MANUSCRITO ACEPTADO 7 (2,000 o 12,000,
unidades arbitrarias) como se indica. Las puertas que contienen leptospiras se
dibujaron en parcelas FSC / SSC y SYTO® 9 / PI. Para los análisis de orina, la
visualización en las gráficas SYTO® 9 / PI se restringió a los eventos pertenecientes
a la puerta dibujada en la gráfica FSC / SSC. Para los análisis de sangre, la
adquisición se restringió a los eventos pertenecientes a esta puerta FSC / SSC.
2.5. Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statgraphics Centurion
XV, versión 15.2.14 (Statpoint Technologies, VA, EE. UU.). Todas las pruebas se
realizaron con un riesgo α estándar del 5%. La correlación de FCM con el método
de Petroff-Hausser y la linealidad de las enumeraciones en EMJH, orina y sangre
se analizaron mediante regresiones lineales. El rango de linealidad se determinó
primero usando una prueba de falta de ajuste (se requirió una falta de ajuste no
significativa). La proporcionalidad del método y las correlaciones entre los métodos
se validaron si: (i) el valor 1 se incluyó en el intervalo de confianza del 95% para la
pendiente y (ii) la intersección no fue significativamente diferente de cero. La
precisión de las técnicas FCM y Petroff-Hausser se evaluó mediante un análisis
multifactorial de varianzas (MANOVA). Las varianzas de precisión de ambas
técnicas se calcularon como la suma del operador y los componentes de varianza
de repetibilidad. Las variaciones de las dos técnicas se compararon entre sí
mediante una prueba F.

3. RESULTADOS
3.1. Viabilidad de la detección de Leptospira por citometría de flujo
Para determinar la posibilidad de distinguir las leptospiras de las señales de fondo
con el citómetro de flujo BD Accuri ™ C6, comparamos el gráfico de puntos de un
cultivo denso diluido a 1: 1.000 con los de las muestras de control que contienen
solución salina o EMJH. Observamos una densa población de eventos con bajos
parámetros de FSC y SSC en los controles, correspondiente a la señal de fondo
causada por las partículas del medio y el ruido electrónico (Fig. 1A). Para el cultivo
bacteriano, el FSC fue idéntico a los controles, mientras que el SSC fue solo un
poco más alto (Fig. 1B), lo que indica que las leptospiras no se pueden separar de
manera eficiente del fondo en los parámetros FSC / SSC. Para discriminar la
población de leptospiras de los desechos, utilizamos tintes del kit de viabilidad
bacteriana LIVE / DEAD® BacLight ™. Primero, para asegurarnos de que las
leptospiras no fueran autofluorescentes, observamos el diagrama de puntos SYTO®
9 / PI de las leptospiras no teñidas. No se detectó fluorescencia significativa (Fig.
2A). Luego, los análisis de EMJH y solución salina tras la adición de SYTO® 9 y PI
confirmaron que los colorantes no generaban una señal de fondo fluorescente (el
gráfico de puntos es idéntico a la Fig. 2A, no se muestran los datos). Después de la
tinción, las leptospiras se pudieron separar del fondo en la parte derecha del gráfico
SYTO® 9 / PI. Sin embargo, la población bacteriana permaneció en minoría (0,4%
de todos los eventos registrados) debido al gran número de eventos de fondo (Fig.
2B). Por lo tanto, aplicamos un umbral de adquisición en 2000 en el canal de
fluorescencia verde, lo que permite registrar solo eventos fluorescentes. Como
resultado, la mayoría de los eventos de fondo no se registraron, mejorando así la
detección de Leptospira (Fig. 2C).
3.2. Detección de Leptospira viva y evaluación de la viabilidad del cultivo.
Para evaluar la posibilidad de discriminar las leptospiras vivas de las muertas,
realizamos un análisis comparativo de cultivos frescos y muertos por calor.
Observamos que las células vivas emitían un alto nivel de fluorescencia verde y un
bajo nivel de fluorescencia roja, mientras que las células muertas emitían mayor
fluorescencia roja y menores niveles de fluorescencia verde (Fig. 3A y B). Esta
emisión verde reducida se explica por la competencia de los dos tintes por la unión
al ADN a favor del PI en comparación con SYTO® 9 (Stocks, 2004). Estos dos
diagramas de puntos distintos permitieron dibujar una puerta "Viva" que contiene
sólo leptospiras vivas (en verde en la Fig. 3). Cuando se mezclaron bacterias frescas
y muertas en una proporción de 1: 1, el gráfico de puntos resultante apareció como
una combinación del 50% de las obtenidas con cultivos puros vivos o muertos por
calor puros (Fig. 3C). Se registraron 2,156 ± 12 eventos en la puerta "Live" para el
cultivo fresco, 1 ± 1 eventos para el cultivo muerto y 1,168 ± 14 para el cultivo mixto,
lo que confirma la relevancia de la puerta definida. Además, analizamos un cultivo
en fase estacionaria tardía de dos semanas de edad que contenía leptospiras
viables y muertas, como se observó mediante microscopía de campo oscuro (no se
muestra). Como era de esperar, los eventos se detectaron tanto dentro como fuera
de la puerta "Live", creando un perfil en forma de herradura (Fig. 3D). La alta
densidad de puntos fuera de la puerta "Live" (44%) indica una menor viabilidad en
comparación con un cultivo en fase logarítmica. Tomados en conjunto, estos
resultados muestran que los análisis de citometría de flujo de bacterias teñidas
permiten identificar de manera efectiva poblaciones de leptospiras vivas y muertas
y medir de un vistazo la viabilidad de un cultivo.
3.3. Correlación entre la citometría de flujo y los métodos de recuento de Petroff-
Hausser
 Para evaluar la posibilidad de enumerar con precisión las leptospiras por citometría
de flujo, realizamos recuentos de un solo cultivo en diferentes puntos de tiempo,
tanto por citometría de flujo considerando el número de eventos en la puerta "Live",
y Petroff-Hausser enumerando las bacterias móviles correspondientes a Células
vivas. Cada medida fue repetida 3 veces por 2 operadores. Se obtuvieron resultados
de enumeración similares para todas las medidas con ambos métodos (Fig. 4). El
análisis estadístico indicó un alto grado de correlación entre FCM y títulos de Petroff-
Hausser (R²> 0,99). La pendiente de la regresión lineal entre las medidas de las dos
técnicas fue estadísticamente equivalente a 1 y la intersección a 0 (Tabla 1). Estas
medidas se realizaron en una cepa perteneciente al serogrupo Australis.
Realizamos un análisis similar en cepas de otros dos serogrupos,
Icterohaemorrhagiae y Canicola. Los coeficientes de correlación estuvieron por
encima de 0,99, las pendientes de regresión lineal fueron estadísticamente
equivalentes a 1 y las intersecciones a 0 (Tabla 1), lo que respalda aún más una
equivalencia entre los dos métodos para todos los serogrupos analizados. Por lo
tanto, la técnica de citometría de flujo que hemos desarrollado enumera con
precisión Leptospira.
3.4. Reproducibilidad de la citometría de flujo en comparación con el método de
conteo de Petroff-Hausser Analizamos los dos componentes de la varianza en los
datos de enumeración obtenidos en el párrafo anterior: la varianza dentro del grupo
llamada varianza de repetibilidad, correspondiente a la variabilidad de la técnica en
sí, y la varianza entre grupos , correspondiente al efecto operador. Para cada cepa
y ambos métodos, los resultados indicaron que el efecto del operador no fue
significativo ya que la varianza del operador fue equivalente a 0. Para la
repetibilidad, la varianza de FCM fue 5 veces menor que la de Petroff-Hausser (P
<0,001), lo que demuestra que la citometría de flujo es significativamente más
repetible que Petroff-Hausser (Tabla 2).
3.5. Rango de linealidad y sensibilidad de enumeración por citometría de flujo
Para evaluar el rango de linealidad y la sensibilidad del método de enumeración por
citometría de flujo, se utilizó un cultivo denso de 3 x 109 leptospiras / ml para
preparar diluciones independientes de 10 veces en serie de 10-1 a 10-6 por
triplicado. Como se muestra en la gráfica que presenta títulos teóricos versus
medidos, el citómetro de flujo apareció lineal entre 3 a 30,000 leptospiras en 1 µl,
correspondiente a las diluciones 10-2 y 10-6, y se saturó para la dilución 10-1 (Fig.5)
. Sin embargo, un análisis estadístico de los títulos obtenidos con diluciones de 10-
2 a 10-6 reveló que la pendiente de la regresión lineal era diferente de 1 (0,975,
intervalo de confianza del 95% de [0,953; 0,998]) y la intersección diferente de 0
(0.087, levemente diferente de 0, P = 0.01), lo que significa que los valores no son
proporcionales en este rango. Al considerar los títulos de las diluciones 10-2 a 10-
5, la pendiente se volvió equivalente a 1 (0.095 [0.981; 1.009], el valor 1 pertenece
a este intervalo de confianza del 95%) y la intersección a 0 (no significativamente
diferente de 0, P> 0,05). En conjunto, estos resultados estadísticos muestran que
FCM enumera linealmente tan solo 30 leptospiras y hasta 30 000 leptospiras en 1
µl, correspondientes a títulos de 3 × 104 a 3 × 10 7 leptospiras / ml.
3.6. Enumeración de Leptospira viva en muestras biológicas
Para evaluar la posibilidad de detectar leptospiras en fluidos biológicos mediante
citometría de flujo, analizamos la orina y la sangre de perros sanos tras la adición
de tinciones LIVE / DEAD® con o sin adición de Leptospira fresca. La señal de fondo
era alta e impedía la diferenciación de la población bacteriana. Para eliminar los
eventos de fondo, aumentamos el umbral a 12.000 en el canal verde por un lado y
determinamos una "puerta de Leptospira" según el diagrama de puntos FSC / SSC
de un cultivo fresco de Leptospira en EMJH (Fig. 6A) en el otra mano. Además,
evaluamos el efecto de las diluciones de la muestra a 1:10 o 1: 100 en solución
salina sobre la calidad de detección. En orina, las diluciones de las muestras a 1:10
combinadas con la restricción de visualización a los eventos pertenecientes a la
“puerta de Leptospira” permitieron una clara identificación de las leptospiras en el
gráfico SYTO® 9 / PI (Fig. 6B). En sangre, la proporción de leptospiras frente a las
señales de fondo era todavía demasiado baja para ser detectada por el citómetro
con los parámetros definidos para la orina. Por lo tanto, diluimos las muestras a 1:
100 y aplicamos una restricción de adquisición para registrar exclusivamente los
eventos incluidos en la “puerta de Leptospira” definida anteriormente. Por tanto, fue
posible distinguir de manera eficiente la población de leptospiras (Fig. 6C). En
conjunto, estos resultados muestran que al optimizar la configuración, es posible
identificar claramente la población de leptospiras en orina y sangre mediante
citometría de flujo. Para enumerar las leptospiras en estos fluidos biológicos,
definimos una puerta "Live_Bio" que contiene solo leptospiras vivas en función del
perfil en forma de herradura característico observable obtenido al aplicar los ajustes
optimizados (Fig. 6B y C). Contamos diluciones seriadas de 10 veces del cultivo
enriquecido en orina y sangre considerando el número de eventos en la puerta
“Live_Bio” (Fig. 7). Esta puerta es más estrecha que la "Live" descrita anteriormente
(Fig. 3) para evitar contar los eventos de fondo. Para el recuento de orina de 20 a
20.000 leptospiras correspondientes a diluciones de 100 a 10-3, la pendiente de la
regresión lineal fue equivalente a 1 (0,998 [0,977; 1,019]) y la intersección a 0 (0,01,
P> 0,05). Considerando la dilución 1:10, el rango de linealidad del recuento de
leptospiras en orina es de 2 × 105 leptospiras / ml a 2 × 108 leptospiras / ml. En
sangre, para el recuento de 20 a 2000 leptospiras correspondientes a diluciones de
100 a 10-2, la pendiente de la regresión lineal fue equivalente a 1 (0,973 [0,945;
1,002]) y la intersección a 0 (0,03, P> 0,05 ). Considerando la dilución 1: 100, el
rango de linealidad del recuento de leptospiras en sangre es de 2 × 106 leptospiras
/ ml a 2 × 108 leptospiras / ml.

4. DISCUSIÓN
 La creciente incidencia mundial de leptospirosis plantea la necesidad de
comprender mejor la fisiología de Leptospira y los mecanismos de virulencia, pero
aún faltan herramientas analíticas para trabajar fácilmente con estas bacterias
atípicas, en particular buenas técnicas de enumeración. En este artículo,
describimos un nuevo método de citometría de flujo para satisfacer la necesidad de
medios rápidos y confiables para enumerar las leptospiras en cultivo y reemplazar
el método de conteo estándar de Petroff-Hausser, que requiere mucha mano de
obra. La citometría de flujo se desarrolló por primera vez para estudiar células
grandes como los eritrocitos (Robinson y Roederer, 2015). Recientemente, los
constructores comercializaron dispositivos de nueva generación capaces de
detectar eventos más pequeños como bacterias y algunos virus (Steen, 2004). Sin
embargo, mostramos que las leptospiras son difíciles de detectar ya que apenas se
distinguen de los ruidos de fondo en los parámetros clásicos de FSC y SSC. Estos
datos son similares a los obtenidos por otros con las espiroquetas T. denticola y B.
burgdorferi (Bakker et al., 2007; Orth et al., 2010) pero no con bacterias más
grandes como Escherichia coli (Gatza et al., 2012). ), probablemente debido a la
delgadez celular de las espiroquetas. Por tanto, es necesaria la adición de tintes
para mejorar la señal sobre las relaciones de fondo. Aquí, empleamos el kit de
viabilidad LIVE / DEAD® BacLight ™ como se describe para T. denticola (Orth et
al., 2010). Las leptospira teñidas muestran un perfil en forma de herradura en el
diagrama de puntos SYTO® 9 / PI, con la parte inferior derecha correspondiente a
las células vivas mientras que la zona superior izquierda contiene las que están
muriendo. Dentro de la región correspondiente a las células vivas, se pueden
observar dos poblaciones vecinas. Presumimos que el más fluorescente
corresponde a dividir las células que contienen 2 veces más ADN y, en
consecuencia, emiten niveles más altos de fluorescencia. Demostramos que la
enumeración de Leptospira cultivada por citometría de flujo es estadísticamente
equivalente a la enumeración por Petroff-Hausser para diferentes cepas y en
diferentes estados fisiológicos. Todas las cepas estudiadas tenían una morfología
típica de aproximadamente 10 µm de largo y extremos característicos en forma de
gancho y espiral. Se obtuvieron gráficos de puntos idénticos en una cepa con una
morfología atípica de aproximadamente 17 µm de largo y extremidades rectas
(datos no mostrados), lo que indica que el tamaño y la forma de las células no
afectan la detección de citometría de flujo en el rango probado. FCM ofrece varias
ventajas sobre Petroff-Hausser. La comodidad del operador se mejora al evitar
largas observaciones de bacterias móviles bajo microscopía de campo oscuro. Es
notablemente más rápido, con solo 5 minutos necesarios para un análisis completo,
y reduce la exposición de los operadores a cepas patógenas. Nuestros datos indican
que FCM también es significativamente más reproducible que Petroff-Hausser, con
una varianza de repetibilidad 5 veces menor. Otra ventaja de la citometría de flujo
es su alta sensibilidad. Nuestros resultados revelaron que FCM enumera lineal y
proporcionalmente de 30 a 30.000 bacterias en 1 µl, lo que corresponde a cultivos
concentrados a 104 leptospiras / ml a 107 leptospiras / ml. Observamos un sesgo
en las medidas para títulos tan bajos como 103 leptospiras / ml, lo que lleva a una
ligera sobreestimación de los títulos. Esta sobreestimación puede ser aceptable
para la mayoría de las aplicaciones, aunque la linealidad no está validada en este
rango. El rango de linealidad de 4 log y la alta sensibilidad representan una mejora
en comparación con las técnicas descritas anteriormente. La linealidad de Petroff-
Hausser se puede estimar como el recuento de 1 a 50 leptospiras en cada cuadrado
del portaobjetos, correspondiente a un rango de 106 a 6 × 107 leptospiras / ml.
Para fines de diagnóstico o estudios de diseminación bacteriana, es necesario
determinar la presencia de Leptospira en muestras biológicas. Las bacterias son
detectables en los primeros días después de la exposición en sangre y de 10 a 14
días después del inicio de los síntomas en la orina, con una carga bacteriana que
varía de 102 a 106 leptospiras / ml (Picardeau et al., 2014). La técnica de referencia
para la cuantificación de Leptospira en fluidos biológicos es la PCR cuantitativa en
tiempo real, una técnica con una sensibilidad de unas pocas células por mililitro
(Merien et al., 2005; Lourdault et al., 2009; Picardeau et al., 2014). Sin embargo,
requiere varias horas de análisis. Dada la rapidez de la FCM, evaluamos la
posibilidad de aplicar esta herramienta a la detección y cuantificación de Leptospira
en orina y sangre infectadas artificialmente. Estos fluidos generan altas señales de
fondo debido a su compleja composición. El aumento del umbral de adquisición, la
restricción de eventos en exhibición o adquisición y diluciones de muestras
permitieron una detección eficiente de la bacteria. Pudimos enumerar con precisión
las leptospiras en orina y sangre con una sensibilidad de 105 leptospiras / ml y 106
leptospiras / ml, respectivamente. Al igual que en EMJH, el citómetro de flujo
sobrestimó ligeramente los recuentos de títulos tan bajos como 104 leptospiras / ml
en orina y 105 leptospiras / ml en sangre, pero estas sobrestimaciones siguen
siendo aceptables. La sensibilidad inferior en sangre probablemente se debe a la
presencia de glóbulos rojos grandes que crean un ruido de fondo importante. Por lo
tanto, la citometría de flujo es adecuada para la detección de Leptospira en fluidos
biológicos con altos títulos infecciosos. Sin embargo, puede dar lugar a resultados
falsos negativos si hay menos de 105 o 104 bacterias presentes en la sangre u
orina, respectivamente. En consecuencia, la FCM podría utilizarse como una
herramienta rápida de primera línea para el diagnóstico o los estudios de infección,
pero debería completarse con análisis cuantitativos de PCR en tiempo real en caso
de resultados negativos. Pueden considerarse varias otras aplicaciones del análisis
de leptospiras mediante citometría de flujo. En el contexto de los diagnósticos
serológicos mediante la técnica de microaglutinación (MAT), se demostró que la
FCM podría reemplazar las observaciones microscópicas para evaluar el nivel de
aglutinación (Yitzhaki et al., 2004). Es probable que la aglutinación de cepas de
Leptospira por sueros de referencia sea observada de manera similar por FCM en
experimentos de serogrupo. Además, la detección basada en anticuerpos
fluorescentes sería de gran interés para estudiar la localización o expresión de
proteínas y evaluar el impacto de las condiciones de estrés o manipulaciones
genéticas. Se han descrito ejemplos de detección inmunitaria mediante citometría
de flujo para varias especies bacterianas (Müller y Nebe-von-Caron, 2010).

Para L. interrogans, se ha informado de un protocolo que describe la tinción con un

anticuerpo monoclonal fluorescente dirigido contra el lipopolisacárido bacteriano
(Ronot et al., 2006), lo que demuestra la viabilidad de este enfoque. Los desarrollos
futuros deberían incluir la optimización de la configuración para la aplicación a las
proteínas objetivo. Cabe mencionar que abordar estos problemas requiere cierta
experiencia en citometría de flujo. En conclusión, la citometría de flujo enumera
eficazmente Leptospira en cultivo y muestra más rapidez, sensibilidad y menos
variaciones que el método de recuento estándar de Petroff-Hausser. También
permite la cuantificación de Leptospira en orina o sangre altamente infectadas y
ofrece una amplia gama de posibilidades para estudiar y comprender más a fondo
estas bacterias atípicas.

FIGURAS

FIG 1 Detección de Leptospira por citometría de flujo. Gráficos de puntos FSC / SSC
de (A) EMJH y (B) un cultivo de leptospiras. Se aplicó un umbral bajo a 1000 en el
parámetro FSC. El diagrama de puntos del agua fisiológica era idéntico al EMJH
(datos no mostrados). {
FIG 2 Mejora de la detección de Leptospira mediante tinción fluorescente y umbral
de fluorescencia. Gráficos de puntos SYTO® 9 / PI de leptospiras diluidos a 1: 1,000
de (A) muestras sin tinción LIVE / DEAD® con un umbral fijado en 1,000 en FSC;
(B) muestras con tinción LIVE / DEAD® con un umbral fijado en 1000 en FSC; (C)
muestras con tinción LIVE / DEAD® con un umbral fijado en 2000 en el canal de
fluorescencia verde. La línea roja colocada en 2000 en el eje SYTO® 9 representa
la máxima intensidad fluorescente de la señal de fondo

FIG 3 Evaluación de la viabilidad de Leptospira por citometría de flujo. Gráficos de

puntos SYTO® 9 / PI de un cultivo fresco teñido (A), (B) cultivo muerto por calor, (C)
mezcla de cultivos al 50% frescos y 50% muertos y (D) cultivo antiguo en fase
logarítmica tardía, diluido a 1: 1.000.
FIG 4 Correlación entre la citometría de flujo y las técnicas de enumeración de
Petroff-Hausser. Se enumeró un cultivo durante 9 días. Cada valor del gráfico
corresponde al promedio de las 6 medidas (por triplicado por 2 operadores),
utilizando la cámara de recuento de Petroff-Hausser y la citometría de flujo. Las
barras de errores representan la desviación estándar en las 6 medidas.

FIG 5 Intervalo de linealidad del citómetro de flujo para el recuento de Leptospira

viva en cultivo. Los títulos de FCM obtenidos mediante el análisis de un cultivo de
diluciones seriadas de 10 veces se correlacionaron con los títulos teóricos. Las
diluciones se indican sobre los puntos. La línea punteada y = x representa el título
esperado para una linealidad perfecta. Las barras de errores corresponden a la
desviación estándar en tres medidas.

FIG 6 Detección de Leptospira viva en orina y sangre mediante citometría de flujo.

(A) Leptospiras en EMJH en la parcela FSC / SSC con un umbral fijado en 12.000
en el canal de fluorescencia verde. La puerta azul "Leptospires" contiene la
población de leptospiras. (B) Mezclas de leptospiras y orina diluidas a 1:10 en agua
en un diagrama de puntos SYTO® 9 / PI con un umbral de 12.000 en el canal de
fluorescencia verde restringido en la visualización a los eventos pertenecientes a la
puerta "Leptospiras". (C) Mezclas de leptospiras y sangre diluidas a 1: 100 en agua
en un diagrama de puntos SYTO® 9 / PI con un umbral de 12.000 en el canal de
fluorescencia verde restringido en la adquisición de los eventos pertenecientes a la
puerta "Leptospiras". La puerta verde "Live_Bio" contiene la población de
leptospiras vivientes.

FIG 7 Intervalo de linealidad del citómetro de flujo para el recuento de Leptospira

viva en orina y sangre. Se añadieron diluciones seriadas de 10 veces de un cultivo
de Leptospira en orina o sangre y se analizaron mediante FCM. Los títulos
resultantes se correlacionaron con los títulos teóricos. La línea punteada y = x
representa el título esperado para una linealidad perfecta. Las barras de errores
corresponden a la desviación estándar en tres medidas