Efectos subletales de Cry 1F Bt Corn y Clothianidin en el desarrollo larval del

gusano negro (Lepidoptera: Noctuidae)

resumen

El gusano negro, Agrotis ípsilon (Lepidoptera: Noctuidae) , es ocasionalmente una plaga del maíz,
zea mays que puede causar graves pérdidas y daños a las plántulas de maíz. La eficacia del
tratamiento con semillas de neonicotinoides clothianidiant dos velocidades disponibles
comercialmente y su interacción con un híbrido de maíz transgénico (maíz bt). Se investigó el
rasgo que expresaba la variedad Bacillus thuringiensis, la toxina insecticida aizawai Cry 1Fa2,
contra las larvas de la lombriz negra. La clotianidina a una tasa de 25 mg de grano 1 en maíz Bt
aumentó la mortalidad de las larvas y redujo las ganancias de peso de las larvas de manera aditiva.
Por el contrario, el peso de las larvas alimentadas con plántulas de maíz no Bt tratadas con
clothianidina a razón de 25 mg de grano 1 aumentó significativamente, lo que sugiere un consumo
excesivo compensatorio, hormesis u hormoligosis. Tanto el maíz Bt solo como la clothianidina a
una tasa de 125 mg de grano 1 aplicado a semillas de maíz sin Bt causaron una mayor mortalidad y
redujeron las ganancias de peso de las larvas. En dos campos, las parcelas plantadas con híbridos
de maíz Bt tuvieron consistentemente las mayores poblaciones de plantas y rendimientos,
independientemente de si fueron tratados con clothianidin a una tasa comercial más baja de 25
mg de grano 1 El uso de maíz Bt solo o en combinación con la tasa baja de clothianidin (25 mg
kernel 1) parece adecuado como un medio para suprimir la lombriz negra en campos de maíz sin
labranza, aunque los tratamientos de rescate pueden ser necesarios bajo infestaciones severas. La
clotianidina sola a una tasa baja de 25 mg de grano 1 no se recomienda para el control de la
lombriz negra hasta que se hayan completado más estudios sobre sus efectos sobre la fisiología de
las larvas y el rendimiento del campo.

El gusano negro, es una plaga importante ocasional del maíz, y se siente atraído por la labranza
cero y otros campos de malezas (Showers et al. 1985), lo que reduce las poblaciones de plantas y
el rendimiento de los cultivos (Schoenbohm y Turpin 1977). El control de la lombriz cutánea a
principios de la temporada es un componente importante del programa de manejo de plagas de
maíz en la región de los Grandes Lagos (Kulliketal. 2005); sin embargo, las infestaciones de
gusanos cortadores son difíciles de predecir, la exploración es lenta y costosa, y el daño a menudo
es extenso antes de ser detectado (Showers 1997). Las plantas se cortan casi siempre en las
primeras etapas de la hoja, en o por debajo del punto de crecimiento (Showers 1997). La
primavera en las partes más al norte de la región de los Grandes Lagos a menudo es fresca y
húmeda, lo que prolonga el tiempo de desarrollo tanto para las larvas de gusano negro como para
los lechos de semillas de maíz aumenta el potencial de daño de las semillas en los campos sin
labranza (Mulder y Showers 1983). Las tácticas de control que existen en la siembra y que no
requieren exploración, como la resistencia de la planta y el tratamiento de semillas, son, por lo
tanto, opciones muy atractivas para el control del gusano negro. No se ha informado el efecto de
la combinación de tratamientos de semillas de maíz Bt (resistencia del hospedador) y de ropa de
tela sobre la mortalidad, el crecimiento y el desarrollo del gusano negro. Bacillus thuringiensis
(Berliner) es una bacteria del suelo grampositiva que, durante la formación de endosporas,
expresa una protoxina que se activa mediante proteasas en el intestino del insecto después de la
ingestión (de Maagd et al. 2003). La toxina Cry1Fa2, aislada de la subespecie B. thuringiensis
aizawai, ha mostrado cierta actividad contra las larvas de gusano negro en estudios de laboratorio
(de Maagd et al. 2003) y en el campo (BRAD 2001). El maíz Bt es resistente a varias plagas de
lepidópteros, particularmente a las especies primarias de plagas de maíz Ostrinianubilalis (Hubner)
(BRAD2001) y al disuasivo de alimentación de toxicidad moderada para la lombriz negra (Schmidt
et al. 2009). La toxina Cry1F no ha reportado actividad contra otras plagas de maíz comunes en la
primavera en la región de GreatLakes, como el gusano de maíz, Delia platura (Meigen); Escarabajo
del maíz, Chaetocnema pulicaria Melsheimer; o gusanos de alambre (Melanotus spp. LeConte)
(van Frankenhuyzen 2009). En el pasado, el control del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica spp.
LeConte), los gusanos cortadores y otras plagas de la temporada temprana se ha manejado
mediante la aplicación de insecticidas del suelo que son peligrosos tanto para los aplicadores
como para el medio ambiente (Andersch y Schwarz 2003).

La clotianidina, un neonicotinoide con un grupo clorotiazolil-metilo sustituido (Kiriyama y

Nishimura 2002), es un insecticida para el tratamiento de semillas activo contra la mayoría de los
grupos de insectos que se sabe que atacan durante la temporada temprana
(AnderschandSchwarz2003). Clothianidin se aplica en cantidades mucho más pequeñas que los
insecticidas rociados convencionalmente y está en su lugar en la siembra, lo que reduce la
necesidad de exploración. Es altamente sistémico de raíces y se distribuye a través de los tejidos
de las plántulas durante el desarrollo (Andersch y Schwarz2003). Clothianidin, comercializado
como Poncho (Jeschke et al. 2003), se ofrece solo o en combinación con maíz Bt para el control
temprano de varias plagas de maíz.

Clothianidin controla los gusanos de la raíz del maíz y otras plagas secundarias ya sea por contacto
directo o por un modo de acción contra la alimentación (Andersch y Schwartz 2003, Morales-
Rodriguez y Peck2009). Se informa que el gusano negro se controla a una tasa de aplicación de
semilla de 0.25 mg (AI) kernel1 en un grado significativamente mayor que el que se puede lograr
con un tratamiento de rescate con ciflutrina (Andersch y Schwarz 2003). Las plagas tipo A. ipsilon
dejan de alimentarse poco después de ingerir pequeñas cantidades de clothianidina que es
altamente sistémica en las plántulas tratadas (Jeschke et al. 2003). La combinación de dos mezclas
de toxinas con diferentes modos de acción, como el maíz Bt y la clothianidina, puede producir
efectos sinérgicos, aditivos o incluso antagonistas sobre la mortalidad, así como inducir respuestas
subletales en el insecto objetivo o la planta de cultivo involucrada (Salama et al. 1984 , Morales-
Rodríguez y Peck 2009). Las interacciones aditivas, sinérgicas y antagónicas de los subproductos
neonicotinoides, cuando se combinan para el control del gusano blanco, se han informado
anteriormente (Morales-Rodriguez y Peck 2009). Clothianidin controla una amplia gama de
insectos chupadores y masticadores, pero también se ha demostrado que induce una mayor
supervivencia y reproducción de los pulgones verdes del melocotón a dosis bajas [por ejemplo,
Myzuspersicae (Sulzer); Fosteretal. 2003]. Las posibles consecuencias de las interacciones con
plaguicidas han sido poco estudiadas, a pesar de su relevancia para el manejo de plagas en los
sistemas agrícolas. Este estudio se inició para probar si el maíz Bt, combinado con clothianidin a
tasas disponibles comercialmente, tiene un efecto aditivo, sinérgico o antagonista sobre las larvas
de gusanos cortadores negros. El tiempo es una variable fundamental en toxicología (Stebbing
1998) y debido a que se ha demostrado que la mortalidad por exposición a Bt aumenta
significativamente con el aumento del tiempo de exposición (FastandRe´gnie `re1984),
investigamos el efecto de estas dos toxinas, solo y en combinación, durante cuatro períodos de
ensayo de hasta 2 semanas. El rendimiento en el campo puede diferir significativamente de los
resultados de laboratorio; Por lo tanto, probamos la eficacia de las dos toxinas en ensayos de tira
de campo. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del maíz Bt y la clothianidina, tanto
solos como en combinación, sobre el desarrollo y la mortalidad de larvas de gusanos cortadores
negros a lo largo del tiempo, así como el rendimiento en el campo de esta combinación de toxinas.

Materiales y métodos

Fuente de larvas utilizadas en ensayos . Las larvas para bioensayos se criaron en copas
individuales individuales para prevenir el canibalismo (Harrisetal, 1962) en una dieta comercial de
lombriz negra (Black cutworm Diet 9240, Bio-Serv, Frenchtown, NJ). La colonia de la que se
obtuvieron las larvas se mantuvo a 24 ° C con un fotoperíodo de 14.5: 9.5 (L: D) hy 80% de
humedad. Los adultos recibieron un 50% de favor de ponche de fruta Powerade (Coca-Cola Ltd.,
Toronto, ON, Canadá) y una solución de agua, y los huevos se recolectaron cada 2d y se
esterilizaron superficialmente con una solución de formaldehído al 0.1%. Las larvas de gusanos
negros salvajes fueron recolectadas anualmente en los campos de maíz locales y agregadas a la
colonia para mantener la diversidad genética.

Tratamientos De Maíz. El evento transgénico de maíz Bt probado fue Pioneer Hi-Bred 38P04
(evento de transformación TC1507, Plasmid Insert PHI 8999, que expresa el gen Cry1Fa2) junto
con su correspondiente híbrido de isolina Pioneer Hi-Bred38P05 (Pioneer Hi-Bred, Johnson, IA),
aquí después referido como maíz no Bt. Pioneer Hi-Bred trató todos los granos con el fungicida
comercial MAXIM XL 324 FS (fudioxonil metalaxyl-M). The clothianidin (nombre genérico (E) -1- (2-
cloro-1,3-tiazol-5-ilmetil) -3-metil-2nitroguanidina, Poncho 600 g (AI) litro 1, 48.96%, Bayer
CropScience, Calgary, AB, Canadá) se aplicó el tratamiento de semillas a los granos de semillas 2
semanas antes de plantar. La suspensión que contenía insecticida de clothianidin se roció sobre la
semilla cuando cayó en una mezcladora de cemento a gasolina. La mezcla se aplicó en un lote de
una unidad de semilla de maíz a la vez (80,000 granos o 25 kg); cada lote cayó en la mezcladora de
cemento durante 60 s hasta que la cobertura pareció uniforme. La mezcla de la lechada por lote
consistió en Aditivo CTS (16 o 50 ml), colorante para el tratamiento de semillas (5 o 10 ml), agua
(146 o 123 ml) y 33 o 167 ml de clothianidin 600 mg (AI) litro 1 , para el kernel 1 de 25mg
(Poncho250) y 125mg (AI) (Poncho 1250) usan tasas de clothianidin, respectivamente. Todos los
ingredientes de la suspensión fueron proporcionados por Bayer CropScience. Los tratamientos con
clotianidina se denominarán en adelante tasa baja (25 mg [AI] núcleo 1) o tasa alta (125 mg [AI]
núcleo 1).

En total, se probaron cinco combinaciones de tratamiento de estos híbridos y tratamiento de

semillas de clothianidin: 1) maíz no Bt, 2) maíz no Bt más baja tasa de clothianidina, 3) maíz no Bt
más alta tasa de clothianidina, 4) Bt maíz, y 5) maíz Bt más baja tasa de clothianidina.

Protocolo de invernadero para la producción de plántulas de maíz . Los cultivos de semillas

de maíz se cultivaron en celdas individuales de 5 por 5 por 6,2 cm en bandejas de 32 celdas
(INP32WPD ITML Horticultural Products Inc., Brantford, ON, Canadá) con el acondicionador de
suelo Turface (ProÞle Products LLC, BuffaloGrove, IL) como medio de cultivo Los niveles de luz
natural se complementaron con luz de sodio a alta presión y un foto periodo f 14.5: 9.5 (L: D)
condiciones de crecimiento de la primavera htomimica en Ontario. Las semillas se regaron según
sea necesario con una solución de fertilizante de 600 g de tapón de cristal 12-2-14-6Ca-3Mg, 200 g
de Plant Prod 28-14-14 (Plant Products Co. Ltd., Brampton, ON, Canadá ), y 20 g de
Micronutrientes quelados por productos vegetales (PlantProductsCo.Ltd.), lo que dio como
resultado un NÐPÐKratioof16-5-14, inyectado1: 100.

Hoja de bioensayos. Los bioensayos con tejido foliar cultivado como se describió anteriormente
se repitieron en tres fechas separadas con 200 gusanos cortadores negros de tercer estadio recién
moldeados por réplica para evaluar la mortalidad larval y el sobrepeso en el tiempo. El gusano de
la corteza está presente en los campos de maíz antes de plantar, y la edad media de las larvas
aumenta junto con la etapa de la hoja de maíz (Kulliketal.2005). En condiciones óptimas, las larvas
de lombriz negra solo tienen seis instares (Beck1988), pero las larvas criadas en maíz pueden
requerir siete o más estadios, así como una ingesta de alimentos significativamente mayor para
completar el desarrollo (Schmidt y Reese 1988; Santos y Shields 1998). La alimentación de las
hojas en los primeros estadios tiene un impacto mínimo en el rendimiento o rendimiento
posterior de las plántulas de maíz (Showers et al. 1979). Por lo tanto, los métodos de control
deberían ser efectivos contra los estadios cuarto y más viejos, que son más difíciles de controlar
que los estadios tempranos, y mastican los tallos de las plantas jóvenes de maíz. La duración de
este bioensayo, comenzando con el tercer estadio y exponiendo las larvas a Los tratamientos de
hasta 2 semanas aseguran que se pruebe la respuesta de los estadios más antiguos. La respuesta
larval a las cinco combinaciones de tratamiento se evaluó durante cuatro períodos de exposición
diferentes utilizando el tiempo como variable de dosis. Las larvas se pesaron individualmente al
0.1 mg más cercano y se asignaron aleatoriamente en grupos de 40 a las cinco combinaciones de
tratamiento de maíz descritas anteriormente. Los pesos larvales antes del inicio del bioensayo
fueron 229,0 4,1 mg. Grupos de 10 larvas de cada uno de los cinco tratamientos fueron asignados
aleatoriamente a uno de los cuatro períodos de exposición: 84, 168, 252 o 336 h. Las larvas se
colocaron individualmente en recipientes de plástico de 12.5 por 12.5 por 9.5 cm (Ziploc, SC
Johnson and Son, Limited, Brantford, ON, Canadá) en un disco humedecido de 125 mm de papel
No. 4 Whatman Þlter (1004 125, Whatman International Ltd ., Maidstone, Inglaterra) con una
plántula de maíz de cuatro hojas. Luego, una gran cantidad de larvas se encontraron en campos de
cuatro hojas en la etapa de cuatro hojas (Kulik et al. 2005) y el tamaño de las plántulas de cuatro
hojas proporcionó alimento suficiente para las larvas en crecimiento entre los cambios de las
hojas. Las plántulas de maíz se insertaron en un Aqua Pick (Westbrook Greenhouse Systems,
Grimsby, ON, Canadá) lleno con agua desionizada para mantener la turgencia de la planta. Las
plantas fueron reemplazadas con plántulas frescas cada 84 h durante la duración del experimento.
Los contenedores Ziploc se almacenaron en cámaras de crecimiento mantenidas a 24 1 C bajo
luces fuorescentes con un fotoperíodo de 14.5: 9.5 (L: D) h. Todas las larvas se volvieron a pesar al
final del período de exposición asignado. Las larvas muertas o moribundas (que no responden
cuando se pinchan con una aguja pequeña) no se incluyeron en los pesos finales. Al final del
período de exposición asignado, a las larvas supervivientes se les permitió completar el desarrollo
con una dieta artificial y se pesaron nuevamente 24 h después de la pupación para permitir el
endurecimiento de la cutícula.

Ensayos de tira de campo. Los cooperantes de Woodstock, Long plantaron ensayos de franjas de
longitud de campo en granjas. Point y Dunnville, ON, Canadá, a fines de mayo de 2003 y 2004.
Todos los campos tenían antecedentes de infestación por gusanos cortadores en años anteriores.
Las parcelas de campo se mantuvieron con labranza de conservación sin labranza y prácticas
agronómicas estándar para la región, incluidas las aplicaciones de herbicidas y nitrógeno. Los
siguientes cinco tratamientos fueron plantados por los productores utilizando su propio equipo de
plantación y en sus poblaciones de plantas objetivo en franjas que tenían un mínimo de seis filas
de ancho (4.56m) para cada tratamiento: 1) maíz no Btcorn, 2) no Bt más baja tasa de clothianidin,
3) no Btcorn más alta tasa de clothianidin, 4) maíz Bt y 5) maíz Bt más baja tasa de clothianidin. Las
cinco combinaciones de tratamiento descritas anteriormente se replicaron cuatro veces en un
diseño de bloques completos al azar para un total de 20 tiras de 800 m cada una por sitio. Todos
los sitios fueron monitoreados a lo largo de la temporada para detectar daños por insectos y
plantas, con datos recopilados de las dos filas centrales de cada tira de tratamiento solamente. En
la etapa de desarrollo del cultivo de ocho hojas, se registraron las plantas y la distancia entre
plantas individuales en tres transectos de diez metros colocados al azar en las dos filas centrales
de cada tira. Las parcelas se cosecharon utilizando el equipo del agricultor o cooperador respectivo
y el rendimiento de grano se determinó con un carro de pesaje.

Análisis estadístico. Los datos de mortalidad fueron analizados por análisis probit (Finney1971)
con POLO-PC (LeOra Software, Petaluma, CA) utilizando la duración de la exposición (LT) como los
niveles de dosis. Las ganancias de peso larvario (peso final menos el peso inicial) y los pesos de
pupación se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) con SAS Procmixed (SAS versión
9.1, SAS Institute, Cary, NC) como un diseño de bloque completamente al azar con tratamiento y
tiempo de exposición como principal efectos y replicar como un efecto aleatorio. El procedimiento
de medias mínimas cuadradas (diferencia menos significativa [LSD]) (P 0.05) se usó para comparar
las respuestas medias a las cinco combinaciones de tratamiento. La interacción entre el maíz Bt y
la baja tasa de clothianidina se probó con una prueba de ji cuadrado para efectos aditivos versus
sinérgicos (Salama et al. 1984) utilizando como variable de respuesta la proporción de larvas con
ganancia de peso por debajo de la del control alimentado con plántulas de maíz no tratadas. La
respuesta pronosticada (PR) para exposiciones sin elección de 84,168,252 y 336 h,
respectivamente, se calculó de la siguiente manera (Salama et al. 1984): PRExpected = PRCry1F +
PRClothianidin(1 - PRCry1F)

Donde PR esperado es la proporción de la población que se espera que responda a los dos
tratamientos combinados con un aumento de peso por debajo del control, PRCry1F es la
proporción de larvas alimentadas con maíz Bt con un aumento de peso por debajo del control, y
PRClothianidin es la proporción de larvas alimentado con maíz tratado con la baja tasa de
clothianidin que responde con un aumento de peso reducido. Se calculó un valor de 2 para cada
tiempo de exposición por separado: 2 (PRObserved-PRExpected) 2 / PRExpected, donde
PRObserved fue la respuesta observada a la combinación de tratamiento de maíz Bt y tela de baja
tasa, y PRExpected fue la respuesta predicha calculada usando P 0.05 como el nivel de
significancia. El valor esperado se calcula suponiendo que la interacción entre las dos toxinas es
simple y aditiva y no sinérgica. Un valor 2 mayor que el valor de la prueba indica un efecto aditivo
(Salama et al. 1984, Finney1971), donde los valores calculados que exceden el valor 2 indican
sinergia o antagonismo. Las observaciones de ensayo de campo de la planta, las distancias entre
las plantas y el rendimiento fueron analizadas por separado por SASProcMixedANOVA
(SASversion9.1) para un diseño de bloques completamente al azar (Littel et al. 1996). Las parcelas
de campo se analizaron individualmente para cada sitio debido a interacciones significativas entre
ubicaciones y años. Las medias se separaron mediante la prueba de LSD cuando fue apropiado.

Figura 1.

Figura 1. Mortalidad media (porcentaje) de gusanos cortadores negros de tercer estadio (n 600)
alimentados con plántulas de maíz no Bt; plántulas de maíz no Bt tratadas con baja (25 mg [AI]
kernel 1) o alta (125 mg [AI] kernel 1) de clothianidin; o plántulas de maíz Bt solas o tratadas con
baja tasa de clothianidin (25 mg [AI] kernel 1) en un bioensayo sin elección durante 84, 168, 252 o
336 h, respectivamente, y en pupación para todos los grupos de tiempo combinados.

RESULTADOS

La mortalidad larval media en el bioensayo del tejido de la hoja no excedió el 30% en ningún
tratamiento o combinación de duración de exposición al tratamiento y fue mayor para las larvas
expuestas a la alta tasa de clothianidina seguidas de las expuestas al maíz Bt tratado con la baja
tasa de tela. (Figura 1). Solo dos de los tratamientos en el los bioensayos de tejido foliar dieron
como resultado una respuesta a la dosis significativa a lo largo del tiempo según lo determinado
por el análisis probit (Robertson y Preisler 1992) (Tabla 1). No se pudo estimar un valor LT50 para
el maíz Bt tratado con la baja tasa de clothianidina, ya que cayó fuera del rango de dosis de 336 h.
El significativo x2 (Tabla 1) para el tratamiento de baja tasa de clothianidina sugiere un poort
pobre del modelo probit. El maíz Bt tratado con la baja tasa de clothianidina siguió un perfil de
respuesta a la dosis más tradicional con un mejor ajuste del modelo (Tabla 1). Las pendientes de
las dos líneas probit no diferían significativamente, pero las intersecciones no eran las mismas (2
70.9, df 30, P 0.05). El maíz Bt tratado con la baja tasa de clothianidin fue 0,43 0,11 veces más
potente que el maíz no Bt tratado con la alta tasa de clothianidin para causar la mortalidad del
gusano negro.

Sin embargo, se observaron efectos subletales entre las larvas sobrevivientes. El análisis ANOVA
del aumento de peso de las larvas supervivientes es significativo para el tratamiento (F 9.64; df 4,
511; P 0.0038), tiempo (F 108.72; df 3, 511; P 0.0001), y tratamiento y tiempo interacción (F 7,67;
df 12, 511; P 0,0001).

Tabla 1. Tiempo de exposición letal para la lombriz negra de tercer estadio alimentada con
plántulas de maíz no Bt tratadas con la alta tasa de etiqueta de clothianidin (125 mg AI kernel 1) y
semillas de maíz Bt tratadas con la baja tasa de etiqueta de clothianidin (25 mg AI núcleo 1)
bioensayo de inano-elección para 84, 168, 252 o 336 h, respectivamente, según lo determinado
por el análisis probit.

Figura 2. Aumento medio de peso de SE (gramos) y peso de pupación (gramos) de gusano negro
del tercer estadio (n 600) alimentado solo con plántulas de maíz no Bt o plántulas de maíz no Bt
tratadas con el bajo (25 mg [AI] kernel 1) alta tasa de etiquetado (125 mg [AI] kernel 1) de
clothianidin y plántulas de maíz Bt solas o tratadas con la baja tasa de etiquetado de clothianidin
(25 mg [AI] kernel 1) en un bioensayo sin elección para 84, 168, 252 o 336 h, respectivamente, y en
pupación para todos los grupos de tiempo combinados.

la interacción es menor, como resultado de las diferencias en la duración del tratamiento con
partículas en el tiempo que causa un efecto observable en el aumento de peso de las larvas, por lo
que los tratamientos se probaron para detectar diferencias dentro de un período de tiempo
particular (Quinn y Keough 2002). Aunque no hubo diferencias significativas entre los tratamientos
después de las primeras 84 h (Fig. 2), la tendencia a aumentar el aumento de peso de las larvas
alimentadas con plántulas de maíz no Bt tratadas con la baja tasa de clothianidina en comparación
con el maíz no Bt solo ya era evidente. Después de 168 h, las larvas fueron alimentadas con Bt sin
tratar con la baja tasa de clothianidina o el maíz Bt solo tuvo el mayor peso, seguido de no
tratados con B con la alta tasa de clothianidina. Las ganancias de peso fueron más bajas entre las
larvas que se alimentaron con maíz no Bt o maíz Bt tratado con la baja tasa de clothianidina. El
aumento de peso continuó siendo el más alto entre las larvas criadas en plántulas tratadas con la
baja tasa de clothianidina durante la duración del experimento, seguido de maíz sin Bt tratado con
la alta tasa de plántulas de tela de clothianidina y Bt sin tratamiento con clothianidina (Fig. 2) . Al
final del período de exposición más largo de 336 h, el aumento de peso de las larvas en el
tratamiento de baja tasa de clothianidina fue 2.5 veces mayor que en el grupo control (Fig. 2). Las
ganancias de peso larval en el control de maíz sin Bt, la alta tasa de clothiandin y los tratamientos
con maíz Bt no fueron significativamente diferentes entre sí después de 336 h (Fig. 2). Solo las
larvas alimentadas con la baja tasa de clothianidina combinada con maíz Bt tuvieron ganancias de
peso menores que los controles no tratados después de 252 y 336 h de exposición,
respectivamente. Los pesos en la pupación no fueron significativamente diferentes para la
duración de la exposición (F 2.06; df 3, 371; P 0,1055) o la interacción entre el tratamiento y la
duración de la exposición (F 0,76; df 12, 371; P 0,6903) y los pesos se agruparon para todos los
períodos de exposición. Los pesos agrupados en la pupación de las larvas supervivientes difirieron
significativamente entre los cinco tratamientos (F 2,53; df 4,396; P 0,0404). Las larvas
sobrevivientes que se alimentaban de maíz no Bt tratado con la baja tasa de clothianidina tenían
pesos pupales significativamente más bajos que todos los otros tratamientos, excepto el maíz Bt
tratado con la baja tasa de clothianidina (Fig. 2). Los valores esperados para la interacción de la
toxina no difirieron de la respuesta media observada y la interacción del maíz Bt y la baja tasa de
clothianidina en el aumento de peso de las larvas en los bioensayos de la hoja, por lo tanto, era
aditiva y no sinérgica o antagonista (Tabla 2). La comparación de las ganancias de peso larvario
promedio muestra que la toxina Bt es el principal contribuyente a la actividad subletal total contra
el insecto (Tabla 2). La adición de la baja tasa de clothianidin a las plántulas de maíz Bt aumentó la
proporción de larvas con ganancias de peso por debajo del grupo de control en un promedio del
20%, a pesar de que no se observó ningún efecto subletal negativo, como una reducción de peso
en el grupo expuesto. solo a la baja tasa de clothianidin (Fig. 2).

Solo dos de los seis sitios de prueba de campo experimentaron infestaciones de gusanos negros,
por lo tanto, solo se presentarán los datos de los sitios de Long Point (2003) y Woodstock (2004).
El sitio de Long Point experimentó una infestación muy intensa de gusanos cortadores, que
variaron de uno a siete gusanos cortadores de estadio tardío por cada 10 m de hilera. La prueba
de tira se plantó en un campo infestado de pamplina, Stellaria media L., que se controló con
herbicidas en el momento de la siembra. Por lo tanto, las plántulas de maíz en desarrollo estaban
bajo un fuerte ataque de los gusanos cortadores que ya no tenían malezas para alimentarse.

 La variable de respuesta representa la proporción de larvas con ganancias de peso por debajo de la del control
alimentado con plántulas de maíz no tratadas. Los valores esperados se calcularon en función de las ganancias
de peso observadas de las larvas criadas en plantas de maíz Bt solas o plantas de maíz no Bt tratadas con
clothianidina de baja tasa de etiquetado en un bioensayo sin elección durante 84, 168, 252 o 336 h.

 Las diferencias entre los tratamientos fueron claramente aparentes tras la inspección visual de las
parcelas y luego confirmadas por análisis estadístico de las poblaciones de plantas (F 13.24; df
4,12; P 0,0002), espaciamiento de plantas (F 7.10; df 4, 12; P 0.0036), y rendimientos (F 48.05; df
4, 12; P 0.0001). El maíz Bt tuvo las poblaciones de plantas más altas con o sin la baja tasa de
clothianidina (Tabla 3). La alta tasa de clothianidina aplicada al maíz no Bt tenía mayores
poblaciones de plantas que el maíz no Bt o la baja tasa de clothianidina aplicada al maíz no Bt,
pero no tan alta como el tratamiento con maíz Bt. El mismo patrón surgió en el espaciamiento de
las plantas, así como en los rendimientos (Tabla 3). Los rendimientos para las parcelas de control
no Bt fueron los mismos que para el maíz no Bt tratado con la baja tasa de clothianidina. El
rendimiento para el maíz no Bt tratado con la alta tasa de clothianidina fue mayor que para el maíz
no Bt solo, pero este tratamiento no funcionó tan bien como ninguno de los tratamientos de maíz
Bt. El maíz Bt solo tuvo el mejor rendimiento, seguido del maíz Bt tratado con la baja tasa de
clothianidina (Tabla 3).

La parcela de Woodstock experimentó una infestación leve, con una o dos larvas por cada 10 m de
hilera. Las poblaciones de plantas variaron significativamente entre tratamientos (F 4.44; df 4, 12;
P 0.0196) y fueron más altas para las parcelas plantadas con maíz Bt con o sin la baja tasa de
tratamiento de semillas de clothianidina, seguidas de las tasas bajas y altas de Tratamientos de
clothianidina en maíz no Bt (Tabla 3). Las poblaciones de plantas fueron más bajas en las parcelas
de maíz no Bt (Tabla 3). El espacio entre las plantas (F 3.70; df 4,12; P 0.0347) fue mayor en las
parcelas que no son Bt, considerando menos tratamiento de semillas y menor en las parcelas de
maíz Bt tratadas con la baja tasa de clothianidina (Tabla 3). En la cosecha, los tratamientos ya no
diferían significativamente (F 2.12; df 4, 12; P 0.1461) (Tabla 3).

Las combinaciones de tratamiento probadas fueron plántulas de maíz sin Bt, plántulas de maíz sin Bt tratadas
con una tasa baja (25 mg de grano AI 1) o alta (125 mg de grano AI 1) de clothianidina, y plántulas de maíz
Bt solas o tratadas con baja tasa de clothianidin (25 mg AI núcleo 1). a Las medias seguidas de la misma letra
no difieren significativamente (P 0.05; prueba LSD), los sitios de prueba se analizaron por separado.

DISCUSIÓN

El control del daño del gusano negro cortado observado en el campo fue inconsistente con los efectos de los
mismos tratamientos en las larvas observados en los bioensayos controlados realizados en el laboratorio. En
el laboratorio, ni la proteína Cry1Fa2 ni la clothianidina fueron suficientemente tóxicas solas o en
combinación para explicar el control de la lombriz negra observada en el campo. Hay varias explicaciones
posibles para esta respuesta inesperada y contradictoria. Estos incluyen el consumo compensatorio
(Winterer y Bergelson 2001), la hormesis de crecimiento (Stebbing 1998) y la hormoligosis (Luckey 1968).

Andersch y Schwarz (2003) sugieren que la clothianidina es un elemento disuasorio para la alimentación de
las larvas de gusano negro, similar al conocido efecto disuasorio de la alimentación de las toxinas Bt en otras
plagas de lepidópteros (Bartelt et al. 1990; Harris et al. 1997), con alimentación inmediata. cese que ocurre
después de ingerir pequeñas cantidades de plantas tratadas con clothianidin (Andersch y Schwarz 2003).
Esta afirmación no está respaldada por los resultados de nuestro estudio. Si la clothianidina hubiera actuado
como un elemento disuasivo de la alimentación, podría haber disminuido la efectividad del híbrido Bt al
reducir la cantidad de toxina consumida (Berdegue ´ y Trumble 1997). En cambio, se produjo un efecto
aditivo cuando el maíz Bt se combinó con la baja tasa de clothianidina, disminuyendo las ganancias de peso
de las larvas más que la tasa baja o alta de clothianidina aplicada al maíz no Bt (Fig.2; Tabla 2). Aunque no se
cuantificó, no se observó la interrupción de la alimentación durante los bioensayos y las larvas que se
alimentan de plántulas de maíz no Bt tratadas solo con la baja tasa de clianidina a menudo consumida en
una planta durante la tercera reposición. Además, aunque el consumo no se probó específicamente, el
aumento de 250% en peso sobre los controles, como ocurrió en las larvas después de 336 h de exposición a
las plántulas tratadas con la baja tasa de clothianidina (Fig. 2) debe haber sido acompañado por un aumento
en la cantidad de tejido foliar consumido (Meisner et al.1990). Los resultados del bioensayo del tejido de la
hoja sugieren que la clothianidina puede haber actuado como un fagostimulante para A. ipsilon. Farrar y
Ridgeway (1995) demostraron que los fagostimulantes pueden aumentar la ingestión larval de toxinas Bt,
aumentando su eficacia, tal vez explicando la mayor eficacia observada en el tratamiento donde Bt se
combinó con clothianidin (Fig. 1; Tabla 2). Sin embargo, las bajas tasas de mortalidad observadas en nuestro
estudio pueden indicar que las larvas ingieren una dosis subletal de Bt y clothianidin, dejan de alimentarse,
se recuperan y luego reanudan la alimentación y, finalmente, infligen más daño a los cultivos que si estos
bordes no hubieran sido tratados (Farrarand Ridgeway 1995 ).

El consumo compensatorio es una posible explicación de las altas ganancias de peso en las larvas de gusano
negro. El consumo compensatorio ocurre cuando un organismo responde a la exposición a un agente tóxico
o la baja calidad de los alimentos al aumentar su consumo de energía. Los insectos compensan la menor
eficiencia de conversión con un aumento en el consumo, lo que en última instancia conduce a un mayor
daño a las plantas y sin impactos negativos en la población de especies de plagas que aumentan los tratos
(Winterer y Bergelson 2001). Se ha observado un consumo compensatorio cuando las larvas de Spodoptera
littoralis Boisduval fueron alimentadas con plantas transgénicas que expresan bajos niveles de tripsina
proteinasa (De Leo et al. 1998). Las larvas se desarrollaron más rápido, ganaron más peso y consumieron
proporcionalmente más tejido foliar, superando el efecto inhibitorio de la tripsina proteinasa al
sobreexpresar las proteinasas intestinales. Las larvas expuestas a plantas con niveles más altos de expresión
tuvieron tasas de mortalidad aumentadas y aumento de peso reducido (DeLeoetal. 1998). Estos son
ejemplos de consumo excesivo como amortiguador de aptitud física contra la exposición futura a toxinas
(Forbes 2000) o como respuesta a la baja calidad de la planta (Obermaier y Zwo ¨lfer 1999). El aumento de
peso aumentado de las larvas de gusano negro puede ser un aspecto de una respuesta similar. Al comer más
herbívoros del tejido de las hojas, en realidad puede causar más daño a la planta que si se hubieran
alimentado de hojas no tóxicas (Hoyetal, 1998), una consideración de importancia obvia para su manejo.

La hormesis puede ser una explicación alternativa para el aumento de peso significativo en las larvas de
gusano negro en respuesta a los bajos niveles de clothianidina. Southam y Ehrlich (1943) definieron la
hormesis como el efecto estimulante de las concentraciones subinhibitorias de cualquier sustancia tóxica en
cualquier organismo. Las definiciones más recientes afirman que la hormesis es una respuesta de
sobrecompensación a las interrupciones en la homeostasis (Calabrese1999) y que la hormesis del
crecimiento es una respuesta sobrecompensadora de los mecanismos de control a los efectos inhibitorios de
los agentes tóxicos a altas concentraciones (Stebbing 1998). La hormesis es a menudo una respuesta a
niveles bajos de exposición de metales, insecticidas y radiación (Brownet al. 2003). Independientemente del
inductor, los efectos de bajo nivel pueden no ser causados por el mismo mecanismo que se observa a
mayores concentraciones (Giesy 2001). La hormesis se ha observado en una amplia gama de células, tejidos
y especies (Giesy 2001) y está bien documentada en la literatura farmacológica, toxicológica (Calabrese y
Baldwin2001) y entomológica (Luckey1968, DeLeoetal.1998, Guedesetal.2009).

Existen varios criterios que definen una respuesta hormética: evidencia de inhibición a dosis altas,
significación estadística y al menos tres dosis con respuestas del 110% del control (Calabrese y Baldwin
2001). La evidencia de inhibición de dosis altas solo fue evidente como una tendencia general en las larvas
alimentadas con plántulas tratadas con la alta tasa de clothianidina (Fig. 2), lo que indica que se deben
probar dosis más altas para confirmar una respuesta hormética. Hubo aumentos significativos en el
aumento de peso de las larvas que superaron el 110% del control en tres de los cuatro períodos de
exposición para la baja tasa de clothianidina. Típicamente, la hormesis causa aumentos que son 30 a 60%
más altos que la respuesta del grupo de control (Calabrese y Baldwin 2001), aunque se han observado
aumentos de 270% más que los controles en algunos sistemas de plantas (Belzetal. 2008). Las larvas de
gusano negro eran hasta un 260% más pesadas que los controles después de 336 h de alimentación con
plántulas de maíz tratadas con la baja tasa de clothianidina, lo que sugiere que puede estar involucrada algo
más que una respuesta hormética. Los cambios en el aumento de peso de las larvas con el tiempo muestran
claramente un patrón de respuesta de rebote excesivamente compensatorio (Calabrese y Baldwin 2001).
Hay un retraso en la respuesta a los tratamientos, lo que indica la necesidad de optimizar la duración de los
experimentos para permitir la observación de los efectos máximos. Si las mediciones se hubieran detenido
después de los primeros 3 días del bioensayo de la hoja, todavía no se habrían notado diferencias
significativas entre los tratamientos (Fig. 2).

La estimulación de la respuesta hormonal a menudo se produce a un costo; disminuya en el tránsito

correspondiente durante el tiempo de recuperación después de que el organismo se recupere del estrés de
la exposición (Forbes 2000, Cedergreen 2008). En el presente caso, el aumento de peso entre las larvas que
se alimentan de plántulas tratadas con la baja tasa de clothianidina fue seguido por la reducción de peso en
la pupación en comparación con los controles. Este es un patrón característico de un organismo que intenta
retener la homeostasis después de la perturbación, una visión consistente con la hipótesis de que la
hormesis es acumulativa y sostenida sobre la corrección de los mecanismos de regulación de la velocidad a
bajos niveles de inhibición del inhibidor (Stebbing 1998). Los bajos pesos en la pupación después de la
respuesta hormética durante la etapa larval también pueden ser un indicador de toxicidad específica de la
etapa. La mosca reina, las larvas de Phormia regina (Meigen) han aumentado significativamente las tasas de
pupación cuando se exponen a dosis subletales de cadmio, pero la exposición al cadmio afecta
negativamente la aparición de moscas adultas del caso de la pupa (Nascarellaetal.2003). La fecundidad
también aumenta con frecuencia por la exposición subletal a pesticidas (Sota et al. 1998, James y Price
2002), pero otros parámetros de aptitud física, como la supervivencia fuera de primavera, pueden reducirse
(Forbes 2000). El resurgimiento de plagas inducido por la hormona (Morse1998) no es probable que sea un
problema en el sistema estudiado porque las plantas de maíz solo son vulnerables al gusano negro durante
las primeras etapas de la hoja y no ocurre una segunda generación en el maíz en la región de los Grandes
Lagos (Kullik et al. 2005). Para determinar la importancia ecológica de la hormesis en respuesta a un desafío
de clothianidin para la lombriz negra, se deben investigar varios rasgos de la historia de vida adicionales no
examinados en el estudio actual. Esto es especialmente necesario ya que no todos los rasgos pueden verse
afectados de la misma manera o en la misma dirección (Forbes 2000). La hormoligosis se usa con frecuencia
como sinónimo de hormesis por entomólogos y acarólogos (Guedes et al. 2009). Sin embargo, los dos
términos no son intercambiables, porque la hormoligosis, a diferencia de la hormesis, ocurre en condiciones
de crecimiento subóptimas (Guedes et al. 2009). Luckey (1968) aplicó dosis subletales de pesticidas a los
grillos domésticos, Acheta domestica (L.), en condiciones subóptimas de dieta y temperatura que dieron
como resultado la estimulación del crecimiento. El crecimiento larval del gusano negro en el maíz es
subóptimo (Reese y Field 1986); La supervivencia larval y las tasas de desarrollo aumentan
significativamente cuando se crían en otras plantas de cultivo como avena, Advena sativa L. o trigo, Triticum
aestivum L., y en algunas especies de malezas (Busching y Turpin 1977). Las larvas que se alimentan de maíz
ganaron solo un 14-15% más de peso que las larvas con dieta artificial durante 8 días (Reese y Field 1986).
Evena 2-dexposición a la misma dieta artificial que se utilizó para criar larvas en este estudio mejoró
significativamente el crecimiento larvario, a pesar de que era mucho más bajo en nitrógeno que las hojas de
maíz (Reese y Field 1986). Las larvas criadas con maíz se desarrollan significativamente más lentamente y
alcanzan la pupación más tarde en comparación con las criadas con una dieta artificial (Santos y Shields
1998).

Este estudio fue diseñado para evaluar la mortalidad y las interacciones de pesticidas a tasas
comercialmente disponibles, con solo unos pocos niveles de dosis. Esto significaba que los datos no podían
analizarse con modelos desarrollados específicamente para curvas de dosis-respuesta en forma de U
(Dengetal. 2001). Se requiere un rango mucho mayor de dosis de clothianidin, preferiblemente administrado
por separado en la dieta artificial y las plántulas de maíz, para determinar si se produjo hormesis o si este
fue un caso de hormoligosis según lo definido por Luckey (1968). También se debe agregar otro tratamiento
de control con una formulación en blanco que contenga todos los ingredientes inertes del Poncho de
tratamiento de semillas disponible comercialmente pero no el ingrediente activo clothianidin.

La mortalidad de las larvas de gusanos cortadores negros en los bioensayos de laboratorio no fue lo
suficientemente alta como para explicar el rendimiento notable del híbrido de maíz Bt en los ensayos de
campo. Las plántulas de maíz Bt pueden tener un efecto repelente, haciendo que las larvas vaguen en busca
de un huésped más adecuado. Las larvas de gusanos cortadores negros altamente móviles se mueven un
promedio de 8.8 m por noche en campos de golf (Williamson y Potter 1997a) y no necesariamente prefieren
el huésped óptimo para el desarrollo de larvas (Williamson y Potter1997b). Por lo tanto, es concebible que el
aumento del daño en algunas de las parcelas de campo no Bt fue causado por las larvas que se alejan de las
parcelas de maíz Bt. Esta especulación podría confirmarse realizando una serie de experimentos de prueba
de elección entre los diversos tratamientos. Un estudio reciente de Spencer et al. (2003) utilizaron la
proteína Bt en sí misma como un marcador distintivo para estudiar los movimientos y los hábitos de
consumo de los gusanos de la raíz del maíz adulto en los campos de maíz y soja, Glycine max (L.) Merr. Un
enfoque experimental similar, posiblemente detectando clothianidin y Cry1F en el tracto digestivo de las
larvas recolectadas en el campo, podría proporcionar información valiosa sobre las elecciones de
hospedadores de gusanos cortadores negros en el campo.

Los resultados de este estudio sugieren que la baja tasa de clothianidin no es suficiente para un control
eficaz de gusanos cortadores cuando se aplica al maíz sin Bt, pero que el rendimiento mejora cuando se
combina con maíz Bt. En las dos pruebas de campo, los tratamientos de maíz Bt tuvieron consistentemente
las mayores poblaciones de plantas y rendimientos (Tabla 3), independientemente de si fueron tratados con
la baja tasa de clothianidina o no. El maíz Bt solo o en combinación con la baja tasa de clothianidina parece
adecuado como un medio para suprimir la lombriz negra en los campos de maíz de labranza cero, aunque
aún pueden ser necesarios tratamientos de rescate para infestaciones severas. Esto es particularmente
cierto sabiendo que la mortalidad en el laboratorio fue muy baja cuando las larvas fueron alimentadas con
plántulas de maíz que contenían la proteína Cry1Fa2, la clothianidina o ambas. De manera similar, la alta
tasa de clothianidina proporcionó cierta protección contra las larvas de gusanos cortadores negros, pero
puede no ser económica para el maíz de campo y debe monitorearse en caso de que se requieran
tratamientos de rescate. La baja tasa de clothianidina aplicada al maíz no Bt no debe recomendarse en
campos donde se espera gusano negro hasta que se entiendan mejor sus efectos sobre la fisiología de las
larvas y el rendimiento del campo. La baja tasa de clothianidin se puede usar si otras plagas de la temporada
temprana, como los gusanos de maíz y los gusanos de alambre son más preocupantes que una infestación
de lombriz negra en un campo en particular.