Concentración de disolución problema de azul de metileno a partir de

técnica de colorimetría

Concentration of methylene blue test solution as from a colorimetry

technique
Marianela Rodríguez Lozano1, Andrea Velásquez Valcárcel2

1
Estudiante de Ingeniería Química- Universidad Nacional de Colombia. Colombia, Bogotá. mrodriguezloz@unal.edu.co

2
Estudiante de Ingeniería Química- Universidad Nacional de Colombia. Colombia, Bogotá. anvelasquezv@unal.edu.co

Resumen

La colorimetría es una rama de la ciencia que estudia el color, es decir las longitudes de onda que están
dentro del espectro de luz que puede percibir el ser humano (400 nm-700 nm aproximadamente), este
tipo de radiación electromagnética puede relacionarse con la materia, de tal manera que podemos
conocer la concentración de una disolución coloreada al medir con un espectrofotómetro la cantidad
de luz absorbida por las moléculas de dicha disolución, esto se define como absorbancia, la cual es
directamente proporcional a la concentración (este hecho se fundamenta en la Ley de Lambert Beer),
lo que quiere decir que si aumentamos la concentración en una disolución aumentará su absorbancia.
También se puede considerar entonces como una relación lineal, lo que ayudó dentro de la práctica a
construir una curva de calibración relacionando estas dos variables (concentración y absorbancia) para
a partir de unas diluciones patrón de azul de metileno con concentraciones conocidas, encontrar la
concentración de una disolución problema (también de azul de metileno) encontrando que su
concentración fue de 2,2 mg/L con una absorbancia de 0,168 ± 0,002. También se pudo comprobar
con las diluciones patrón que a mayor absorbancia mayor concentración.

Palabras clave: Absorbancia, dilución, espectrofotómetro, curva de calibración.

Abstract

Colorimetry is a branch of science that studies color, that is, the wavelengths that are within the light
that can be perceived by humans (approximately 400 nm-700 nm), this type of electromagnetic
radiation can be related to matter, so that we can know the concentration of a colored solution by
measuring with a spectrophotometer the amount of light absorbed by the molecules of said solution,
this is defined as absorbance, which is directly proportional to the concentration (this fact is based on
Lambert Beer’s Law), which means that if we increase the concentration in a solution it will increase
its absorbance, it can also be considered then as a linear relationship, which helped within the practice
to construct a calibration curve by relating these two variables (concentration and absorbance) for from
standard dilutions of methylene blue with known concentrations, to find the concentration of a test
solution (also methylene blue) finding that its concentration was 2.2 mg/L with an absorbance of 0,168
± 0,002. It was also possible to check with the standard dilutions that the higher the absorbance the
higher the concentration.

Keywords: Absorbance, dilution, spectrophotometer, calibration curve.

Introducción
La ley de Lambert Beer (A= εbc) donde A es absorbancia (sin unidades), ε es absortividad molar
(propiedad relacionada con la naturaleza de la materia, expresada en L/mol*cm), b es la trayectoria del
haz de luz a través de la muestra (en cm) y c es concentración (en mg/L o mol/L). Esta Ley es
sumamente útil ya que relaciona la absorbancia (la cual se define como la cantidad de luz absorbida
por x sustancia) con las propiedades de la sustancia o el objeto, la trayectoria del haz de luz y con su
concentración, esta última es la más relevante ya que esta ley establece que la concentración es
proporcional a la absorbancia y gracias a este principio se puede estudiar la absorbancia de un material
o sustancia utilizando diferentes concentraciones, sin embargo esta ley es limite a concentraciones
mayores a 0.01 M es poco preciso el cálculo de su absorbancia debido a que las distancia entre las
partículas es menor en una mayor concentración que en una menor concentración, es por eso que en la
práctica se debe trabajar con diluciones, es decir que se ha disminuido progresivamente su
concentración en un volumen fijo determinado.

La absorbancia 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 % 𝑇 está fuertemente ligada a otro concepto, el cual es la transmitancia

𝑇 = 𝐼/𝐼𝑜, la transmitancia se define como la relación entre la cantidad de luz que incide en un objeto
y la cantidad de luz que logra pasar a través del objeto, es decir, cuando un haz de luz pasa por x objeto
o sustancia un porcentaje de esa luz se absorbe, otro traspasa y otro a veces se refleja. La relación entre
transmitancia y absorbancia es dada por la Ley de Lambert-Beer [1].

El cálculo de la absorbancia se debe hacer es un instrumento adecuado para este fin, en este caso un
espectrofotómetro es ideal, ya que su principio de funcionamiento permite que, a partir de la radiación
de un haz de luz blanca con todas las longitudes de onda, calcular la absorbancia en cada una de esas
longitudes de onda (gracias al monocromador), y así observar en que longitud de onda tiene la mayor
absorbancia. Es importante tener un blanco al momento de querer hallar la absorbancia de un
componente especifico en una mezcla o una disolución, que es el soluto (el que está en menor
concentración) por tanto el blanco será el solvente en el compartimiento de muestras.

Teniendo esto en cuenta el objetivo de la práctica fue hallar la concentración de una disolución de azul
de metileno, a partir de la técnica descrita de colorimetría, utilizando también herramientas estadísticas
como regresión lineal para construir una curva de calibración.
Materiales y métodos

Materiales:

- 6 tubos de ensayo
 - Gradilla
- Bureta de 25 ml
- Balón aforado de 10 ml
- Vaso de precipitados de 100 ml
- Disolución de azul de metileno de 20mg/L
- Disolución problema
- Espectrofotómetro
- Pipeteadores

Métodos:

1. Preparación de diluciones a partir de disolución Stock a partir de la disolución de azul de

metileno de 20 mg/L, para las concentraciones de 5,0 mg/L, 2,0 mg/L, 1,5 mg/L, 1,0 mg/L, 0,5
mg/L y 0,2 mg/L por lo tanto se usaron los siguientes volúmenes de la disolución Stock: 2,5
ml, 1,0 ml, 0,75 ml, 0,50 ml, 0,25 ml y 0,10 ml respectivamente.

Para este proceso se realizaron los siguientes pasos:

a. Agregar aproximadamente 20 ml de la disolución de azul de metileno de 20 mg/L a la bureta.

b. Transferir el volumen correspondiente según la dilución a preparar a un balón aforado de 10
ml, en este caso se empezó con 2.5 ml para preparar la de 5.0 mg/L de concentración.
c. Aforar con agua destilada hasta completar los 10 ml
d. Transferir a un tubo de ensayo y ponerlo en la gradilla
e. Repetir el procedimiento para cada concentración deseada, marcando en la bureta con un
marcador las indicaciones de control de volumen

2. Construcción de una curva espectral

a. Tomar una dilución de concentración conocida, en este caso se tomó la de 2.0 mg/L
b. Medir la absorbancia en diferentes longitudes de onda, en este caso se tomaron valores desde
350 nm a 700 nm
c. Anotar resultados
d. Construir la curva espectral tomando como eje x la longitud de onda y como eje y la
absorbancia, ubicando los puntos y uniéndolos

3. Construcción de una curva de calibración

a. A partir del procedimiento anterior se puede identificar cual fue la longitud de onda en que la
disolución tuvo mayor absorbancia
b. Se debe medir el resto de las diluciones a esa longitud de onda en es espectrofotómetro y
obtener la absorbancia de cada una
c. Con esos datos se debe realizar una regresión lineal para hallar los valores de una función lineal
y=mx+b, los cuales se reemplazarán por los valores de la Ley de Lambert-Beer A= εbc, donde
y es igual a la absorbancia (A), x hace referencia a la concentración (c), la pendiente m, es el
 producto entre la contante de absortividad (a) y la longitud de la cubeta (b) y +b es el intercepto
de la recta.

4. Hallar la concentración de una disolución de azul de metileno problema

a. Medir la absorbancia de la disolución en él espectrofotómetro a la misma longitud de onda que
las diluciones anteriores
b. A partir de la ecuación de la recta hallada gracias la regresión lineal, despejar la ecuación para
hallar concentración
c. Remplazar el valor de absorbancia en la ecuación

Análisis de incertidumbres
Para hallar las incertidumbres referentes en la Tabla 2.1 en cuanto a las concentraciones de las
diluciones sugeridas estándar de la sección (2) de resultados y discusión, se hizo uso de las siguientes
fórmulas de propagación de errores, teniendo en cuenta los límites de error reportados por cada
instrumento de medida y la solución inicial estándar de azul de metileno.

2
%𝐼𝐷𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑠𝑡𝑜𝑐𝑘 = ∗ 100 (1)
20
0,025
%𝐼𝐵𝑎𝑙𝑜𝑛 𝑎𝑓𝑜𝑟𝑎𝑑𝑜 = ∗ 100 (2)
10
0,1
%𝐼𝐵𝑢𝑟𝑒𝑡𝑎 = ∗ 100 (3)
𝑉1

%𝐼[𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛] = √(%𝐼𝐷𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑠𝑡𝑜𝑐𝑘 )2 + (%𝐼𝐵𝑎𝑙𝑜𝑛 𝑎𝑓𝑜𝑟𝑎𝑑𝑜 )2 + (%𝐼𝐵𝑢𝑟𝑒𝑡𝑎 )2 (4)

El porcentaje hallado se multiplica por la concentración de la dilución estándar a la cual se le quiere

hallar la incertidumbre, esta incertidumbre debe de tener el mismo número de decimales reportado por
la concentración y ha de ser expresado de la siguiente manera: (5,0 mg/L ± 0,5 mg/L)

Resultados y discusión

1. Construcción de la curva espectral

A partir de la disolución stock de azul de metileno con concentración inicial de (20 mg/L ± 2mg/L) ,
se prepararon las diluciones sugeridas de (5,0 mg/L, 2,0 mg/L, 1,5 mg/L, 1,0 mg/L, 0,5 mg/L y 0,2
mg/L), utilizando la Ec.(1) :

𝐶1 ∗ 𝑉1 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 (5)

Donde 𝐶1 es la concentración de la disolución de partida para hacer la dilución (20 mg/L), 𝑉1 el

volumen de la alícuota a tomar, 𝐶2 la concentración final a la cual se quiere llevar la disolución de
partida y 𝑉2 el volumen al cual se completa la alícuota (10 mL). Dado a que 𝑉1 es la incógnita,
despejamos en la Ec.(1) con el fin de obtener el volumen exacto a medir de disolución stock para
preparar las diluciones sugeridas:

𝐶2 ∗ 𝑉2
𝑉1 = (6)
𝐶1

Los volúmenes obtenidos para cada dilución sugerida estándar y sus respectivas incertidumbres se
encuentran en la Tabla 2.1 de la sección (2) de este apartado. Estos se midieron a través de una bureta
de 50 mL y se transfirieron a un balón aforado de 10 mL, para luego aforar al volumen del balón
requerido con agua destilada. Sin embargo, su valor relativamente bajo, dificulto su medida en el
momento de emplear dichos instrumentos. Los límites de error de la bureta y balón aforado reportados
por el fabricante fueron respectivamente de (± 0,1 mL) y (± 0,025 mL).

Teniendo las diluciones estándar, se procedió a pasar una de ellas, en este caso de 2,0 mg/L, por el
espectrofotómetro (UV-visible) para leer su absorbancia a diferentes longitudes de onda, realizando
previamente su correcta calibración a través de un blanco de reactivos (agua destilada) para ajustar en
cero el instrumento. Los datos obtenidos se registran en la Tabla 1.1, con el fin de graficar el espectro
de absorción del analito:

Tabla 1.1. Datos para la curva espectral de absorbancia (A)

Longitud de onda (nm) Absorbancia (± 0,001)

350 0,062
400 0,012
450 0,016
500 0,016
550 0,019
600 0,067
620 0,088
630 0,094
650 0,145
660 0,166
670 0,158
680 0,097
690 0,040
700 0,015
Figura 1.1. Curva espectral de absorbancia (A) en función de su longitud de onda λ

Curva de Espectro de Absorbancia

0,180
0,160
0,140
0,120
Absorbancia

0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
300 400 500 600 700
λ Longitud de onda (nm)

Como podemos observar en la Figura 1.1, la longitud de onda que presenta la mayor absorbancia es
660 nm, dicha longitud recibe el nombre de λ𝑚á𝑥 (longitud máxima) y es necesaria para la
determinación cualitativa y cuantitativa de un compuesto en específico, puesto que a esta longitud de
onda se presenta el mínimo error de medición. Para este experimento la longitud de onda mayor nos
permitió encontrar la concentración desconocida de una muestra problema de azul de metileno a través
de la curva de calibración de absorbancia vs concentración de las diluciones estándar preparadas
anteriormente.

2. Determinación de concentración desconocida de azul de metileno en muestra problema

Las absorbancias de las diluciones estándar fueron leídas dentro del espectrofotómetro a la longitud
de onda máxima (660 nm). Dicho procedimiento no difirió del hablado en la sección (1) de este
apartado para la dilución de 2 mg/L, sin embargo, es sumamente importante volver a realizar la
calibración el espectrofotómetro desde la marca cero con el blanco de reactivos (agua destilada), antes
de leer las absorbancias de las seis diluciones sugeridas y la muestra problema con el fin de generar el
menor error de desviación de resultados. Los resultados obtenidos están concertados en la Tabla 2.1:

Tabla 2.1. Información sobre disoluciones para curva de calibración colorimétrica

Concentración Volumen de
Volumen total
del patrón disolución stock Absorbancia
(mL)
(mg/L) (mL)
5,0 ± 0,5 2,5 mL ± 0,1 mL 10 mL ± 0,025 mL 0,349 ± 0,002
2,0 ± 0,4 1,0 mL ± 0,1 mL 11 mL ± 0,025 mL 0,153 ± 0,002
 1,5 ± 0,3 0,75 mL ± 0,1 mL 12 mL ± 0,025 mL 0,127 ± 0,002
1,0 ± 0,2 0,50 mL ± 0,1 mL 13 mL ± 0,025 mL 0,084 ± 0,002
0,5± 0,2 0,25 mL ± 0,1 mL 14 mL ± 0,025 mL 0,046 ± 0,002
0,2± 0,2 0,10 mL ± 0,1 mL 15 mL ± 0,025 mL 0,044 ± 0,002
0,0 (Blanco) 0,0 mL 0,0 mL 0,0
Muestra Problema 0,168 ± 0,002

A partir de los datos de la Tabla 2.1, se construyó la siguiente curva de calibración:

Figura 2.1. Curva de calibración lineal colorimétrica

Absorbancia vs Concentración
0,400
0,350
0,300
Absorbancia

0,250 y = 0,065x + 0,023

R² = 0,997
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Concentración (mg/L)

De la cual se obtuvo la siguiente relación matemática:

𝑦 = 0,065𝑥 + 0,023 (7)

Donde y es igual a la absorbancia (A), x hace referencia a la concentración (c), la pendiente 𝑚 =

0,065, el producto entre la contante de absortividad (a) y la longitud de la cubeta (b) o como
formalmente es llamado cuarzo ultravioleta, utilizado para introducir la muestra dentro del
espectrofotómetro y 0,023 al intercepto de la recta (n):

𝐴 = 𝑚𝑐 + 𝑛 (8)

Teniendo la función en términos de A, se procedió a determinar la concentración de la muestra

problema de azul de metileno en función de onda máxima (660 nm), la cual reporto una absorbancia
de (0,168 ± 0,002):
 𝐴−𝑛
𝑐= (9)
𝑚
0,168 − 0,023 𝑚𝑔
𝑐= = 2,2 (10)
0,065 𝐿

Por tanto, la concentración de la muestra problema de azul metileno proporcionada fue de 2,2 mg/ L.

No obstante, si hubiéramos querido saber la capacidad de absorbancia de luz de la muestra de azul de

metileno a la longitud de onda de 660 nm, partiendo de la concentración hallada y teniendo en cuenta
que la longitud de la cubeta (b) usada fue de 1 cm, podemos aplicar la Ec.(7) de la ley de Beer-Lambert,
que relaciona los términos de absorbancia y concentración con el coeficiente de extinción molar o
como es comúnmente conocido absortividad molar [2]:

𝐴 = 𝜀𝑏𝑐 (11)

Donde 𝜀, es expresado en unidades de 𝑀−1 𝑐𝑚−1, es por tal razón que pasamos la concentración dada
en ppm a términos de molaridad con el fin de hallar el coeficiente a 660 nm:

𝑚𝑔 1𝑔 1 𝑚𝑜𝑙 𝐴𝑀
2,2 ∗ ∗ = 6,9 ∗ 10−6 𝑀 𝑑𝑒 𝐴𝑀 (12)
𝐿 1000 𝑚𝑔 320 𝑔 𝐴𝑀

𝐴 0,168
𝜀660 𝑛𝑚 = = (13)
𝑏 ∗ 𝑐 1 𝑐𝑚 ∗ 6,9 ∗ 10−6 𝑀

𝜀660 𝑛𝑚 = 24347 𝑀−1 𝑐𝑚−1 (14)

Ahora bien, es importante decir que, en cualquier práctica experimental, los resultados obtenidos
pueden presentar errores dentro de sus resultados mínimos o considerables que son importantes a
analizar y discutir. Un ejemplo es la Figura 2.1, en la cual, aunque podemos constatar gracias a su
coeficiente de relación 𝑅2 = 0,997 , según la ley de Beer-Lambert [3], que la absorbancia (A) es una
función lineal de la concentración y, por tanto, son directamente proporcionales siempre y cuando el
espesor de la muestra se mantenga constante. Es importante resaltar que, dentro de las diluciones
realizadas de menor concentración (0,2 mg/ L y 0,5 mg/L), se presenta una ligera desviación de la
tendencia lineal, esto se da dado a que progresivamente dentro de las diluciones realizadas se requiere
de volúmenes más bajos de concentración del analito, lo cual puede generar mayores errores en el
manejo de la bureta que se emplea si no se tiene cuidado en la lectura de medida del volumen requerido,
una menor o mayor concentración de azul de metileno en la dilución estándar provoca por tanto que
la absorbancia leída por el espectrofotómetro cambie significativamente y genere una desviación
dentro de la curva de calibración.

Aun así, se pueden presentar otras variables de alteración importantes a señalar, una de las más
importantes, la longitud de onda máxima. Aunque dentro del curso se manejó los resultados de un solo
grupo respecto a la curva espectro de absorbancia de las diluciones estándar, se hubiera podido obtener
una mayor confianza respecto al dato reportado de esta curva en cuanto a la longitud máxima de onda
si cada uno de los grupos pudiera haber obtenido los valores y de esta manera realizar un tratamiento
estadístico con el fin de determinar un valor homogéneo. Puesto que un valor mayor o menor cambia
la lectura directa del espectrofotómetro sobre la absorbancia y por tanto afecta directamente la medida
de la concentración problema a encontrar. Sin embargo, dicho proceso no fue posible dado a la
utilización de un solo instrumento de espectrofotometría.

A pesar de lo dicho anteriormente, según lo citado por los autores Abramowitz y W. Davidson [4], el
azul de metileno presenta una banda de absorción bastante fuerte en la longitud de onda de 660 nm,
justo en la región roja del espectro visible y trasmite ondas longitudes de onda por debajo de 600 nm
otorgando un color azul al tinte, estos datos son consistentes con lo presentado en la Figura 1.1 en
donde podemos visualizar el espectro de absorción del azul del metileno.

Otros errores relacionados pueden estar ya directamente relacionados a incertidumbres naturales de

los instrumentos de medida utilizados, como la bureta, balón aforado o el mismo espectrofotómetro
usado. También se puede presentar, aunque en condiciones raras para esta práctica que el analito
pudiera haber reaccionado de forma mínima con el solvente o la presencia de otros componentes en la
muestra que absorbieran la luz incidente del espectrofotómetro, es importante resaltar también que, a
concentraciones mayores de 0,010 M, la ley de Beer-Lambert no se cumple al 100%, dado a que a
mayores concentraciones se presenta una distancia mínima entre las partículas absorbentes que alteran
la absorbancia dada la modificación de sus cargas.

Conclusiones

Los resultados obtenidos demostraron que el azul de metileno presenta una gran absorbancia en la
longitud de onda máxima λ𝑚á𝑥 = 660 𝑛𝑚 , justo en el espectro visible rojo. Dicha longitud nos permite
leer las absorbancias de una serie de diluciones con concentraciones conocidas a través de un
espectrofotómetro, el cual permite comparar la radiación absorbida de una sustancia que dependerá de
la concentración que está presente.

Por otra parte, la curva de calibración dada entre las absorbancias y concentraciones conocidas de una
dilución, muestra una relación matemática lineal que nos permite definir que estas dos variables son
directamente proporcionales y, por tanto, es posible determinar la concentración de una muestra
problema en función de su absorbancia al igual que su coeficiente de extinción molar, entre más el
coeficiente de relación se acerque a 1, mejor será la exactitud del dato obtenido. Si en cuyo caso existe
una desviación dentro de esta tendencia lineal, no solamente puede ser causa de la concentración de la
dilución y errores sistemáticos asociados, sino también a otra serie de errores que pueden cambiar la
naturaleza directa de la muestra que causan en consecuencia que la ley de Beer-Lambert no se cumpla.

De igual manera se muestra que, aunque la ley de Beer-Lambert no funciona para concentraciones
mayores a 0,010 M, preparar diluciones con concentraciones relativamente bajas a través de una
solución estándar, puede generar errores de medida, pues requieren de una mayor precisión de la
persona en cuanto al manejo de instrumentos volumétricos, pues cualquier mínima diferencia repercute
en el cambio de concentración deseado.

Referencias
[1]:Berríos, J. C, Transmitancia (fórmula y cálculo de transmitancia a absorbancia), TELCOM:

Aprenda ingeniería eléctrica y electrónica (gratis), 16 de septiembre del 2021. [Online]. Disponible

en: https://telcom.jaol.net/que-es-la-transmitancia/ . (Acceso Dic.1, 2021).

[2]: Universidad Nacional de la Plata, “Espectrofotometria”, 2019. [Online]. Disponible en:

https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginfile.php/43546/mod_resource/content/3/Espectrofotometr%
C3%ADa%202019%20versi%C3%B3n%20final.pdf. (Acceso Dic.1, 2021).

[3] F. Magadalena García, “Apuntes para Espectrometría de Radiación Ultravioleta Visible

(UV/VIS)”, Universidad Autonoma Del Estado De México, 2016.[Online]. Disponible en:
https://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500.11799/68318/secme1814.pdf?sequence=1&isAllowed
=y. (Acceso Dic.1, 2021).

[4] M.Abramowitz & W. Davidson, “Absorption Characteristics of Stains for Black & White
Photomicrography”, Olympus.[Online]. Disponible en: https://www.olympus-
lifescience.com/en/microscope-resource/primer/photomicrography/bwstainchart/ (Acceso Dic.1,
2021)