PRÁCTICA

NÚMERO AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

1

UNIDAD 3 Virología |

INTRODUCCIÓN
Los virus son parásitos intracelulares
obligados, de tamaños muy pequeños
en el orden de los nanómetros
(nm). Los virus están constituidos de un
genoma, coré o material genético,
tienen un recubrimiento protéico al cual
se le llama cápside y al conjunto del
genoma y la cápside se le suele llamar
capsómero, algunos virus suelen tener
un recubrimiento lipídico a lo que se le
llama peplos o membrana, estos virus
se les llama virus envuelto, los virus sin
peplos se les llama sin peplos o
desnudos.
Figura 3.1.1 Estructuras virales
PRÁCTICA NÚMERO 1 |
2
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS
Los virus pueden parasitar células
procariotas, como las bacterias y que
en este caso el virus se le llama
bacteriófago. Cuando el parasitismo lo
realiza en células eucariotas se le llama
virus.
Los virus presentan diversas etapas en
su replicación viral las cuales son
mostradas en la figura 3.1.1.
Los virus que infectan bacterias se
denominan bacteriófagos o
simplemente fagos.
Existen dos clases de bacteriófagos:
 Fagos líticos o virulentos, en los que
tras la infección, el ácido nucléico
del fago se replica y transcribe
dentro de la bacteria huésped
originando nuevas partículas fágicas
que son liberadas al lisarse la célula
(ciclo lítico).
 Fagos lisogénicos o atenuados. Tras
la infección, su ácido nucléico puede
integrarse en el genóforo o
cromosoma de la bacteria, lo que se
denomina profago, y replicarse en
sincronía con él, manteniéndose en
estado latente (ciclo lisogénico). El
profago puede liberarse del genóforo
bacteriano y entra en un ciclo lítico,
como se muestra en la siguiente
figura.
 3
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

un césped o tapiz bacteriano sobre el

Figura 3.1.2. Ciclo vital de un fago.
que aparecen pequeñas áreas
circulares claras que corresponden a
las denominadas placas líticas o
“calvas de lisis”. Estas placas líticas
representan áreas de producción de
fagos procedentes de la lisis de
bacterias infectadas en esa área.

Las placas líticas o calvas; son áreas

claras en un medio de agar
previamente sembrado con una
muestra diluida del fago y la célula
huésped. Cada placa representa la lisis
que produjo un fago que infecto a una
bacteria como se muestra en la
El cometido de la práctica es demostrar siguiente figura.
la capacidad de los virus de replicarse
Figura 3.1.3. Placas líticas causadas
en una célula hospedera. Para este
por bacteriófagos.
motivo se proveerá de un fago virulento
y susceptible a la célula hospedadora
del cultivo. Esta técnica es útil para
enumerar partículas fágicas sobre la
base de formación de placas en un
medio de agar sólido.
Para preparar una suspensión de fagos
virulentos, se mezcla una pequeña
cantidad de estos en un cultivo de la
bacteria susceptible a ser infectada o
bacteria hospedera. Tras la infección,
las bacterias se lisaran liberándose
nuevas partículas fágicas al medio, que
se centrifuga para retirar los restos
celulares. Se mezcla una determinada
dilución de la suspensión fágica con un
cultivo exponencial de la bacteria .
hospedera, y se coloca sobre la
superficie de una placa de agar,
después de la incubación se observara

PRÁCTICA NÚMERO 1 |
 4
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

OBJETIVOS:
1. Conocer e identificar un bacteriófago, un virus y el efecto de parasitismo
intracelular que producen en una célula hospedera.
2. Llevar a cabo el manejo y aislamiento de bacteriófagos.
3. Conocer las etapas de la replicación de los bacteriófagos.

MATERIAL POR EQUIPO:

 Moscas vivas, de 20 a 30, atrápelas usted.
 Aguas residuales como fuente del bacteriófago aproximadamente 45 mL
 Cepa de Escherichia coli. sembrado en forma masiva en una caja medio EMB.
Aislada previamente.
 Dos matraces Erlen Meyer de 125 mL
 Cinco tubos para centrifuga 13X100.
 Cinco tubos con tapón de rosca 18X150.
 Ocho pipetas de un mL estériles.
 Un filtros de membrana estériles de 0.45 μm, marca Millipore.
 Una jeringa de 10 mL estéril.
 Cuatro tubos 13X100, que contiene 2 mL de caldo soya tripticaseína.
 Cuatro cajas que contiene agar nutritivo.
 Cuatro tubos 13X100, que contienen 3 mL de agar blando (0.7% de agar) de
soya tripticaseína.
 Mortero y pistilo para aproximadamente 250 mL
 Dos frascos estériles, de 50 a 100 mL
 Cinco mL de caldo nutritivo decaconcentrado, en un matraz de 50 mL
 Cuatro pipetas de un mL estériles.

PRÁCTICA NÚMERO 1 |

MÉTODO
A. Aislamiento de Escherichia coli
de diversas fuentes.
Una semana antes de realizar la
práctica es indispensable que haga
lo siguiente.
Moscas vivas como fuente:
1. Atrape usted de 20 a 30 moscas
vivas.
2. Macere las moscas con caldo BHI
o caldo soya tripticaseína.
3. Siembre de esta mezcla en agar
EMB, por extensión, e incube a
37 °C por 24 horas.
4. De todas las colonias que han
crecido aislé a la E. coli en agar
EMB.
5. Una vez aislado la E. coli, tome
una asada y resuspenda en 2 mL
de caldo de soya tripticaseína
(este cultivo se usara para el
enriquecimiento del bacteriófago).
Aguas residuales como fuente:
1. Obtenga aproximadamente 45
mL de agua residual.
2. Tome con el asa bacteriológica
calibrada 0.01 mL del agua
residual y siembre en agar EMB,
por extensión, e incube a 37 °C
por 24 horas.
PRÁCTICA NÚMERO 1 |
5
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS
3. De todas las colonias que han
crecido aislé a la E. coli en agar
EMB.
4. Una vez aislado la E. coli, tome
una asada y resuspenda en 2 mL
de caldo de soya tripticaseína
(este cultivo se usara para el
enriquecimiento del bacteriófago).
B. Enriquecimiento del
bacteriófago
Un día antes de la práctica debe
realizar lo siguiente.
Moscas vivas como fuente:
1. Adicione de 20 a 30 moscas a una
pequeña cantidad de caldo soya
tripticaseína y macere con un pistilo
hasta hacer una pulpa fina.
2. Transfiera esta mezcla a un frasco
estéril y adicione más caldo soya
tripticaseína hasta completar 20 mL
más 2 mL de caldo que contiene E.
coli (del cultivo del punto cinco del
aislamiento de E. coli de moscas
vivas).
3. Mezcle suavemente.
4. Incube 24 hrs. a 35 ºC.
Agua residual como fuente:
1. Adicione 15 mL de agua
residuales a 5 mL de caldo
nutritivo decaconcentrado en un
frasco estéril, adicione 2 mL de
cultivo en caldo de E. coli (del
cultivo del punto cuatro del
aislamiento de E. coli de agua
residual).

2. Mezcle suavemente.
3. Incube 24 hrs. a 35 ºC.
C. Identificación del bacteriófago
El día de la práctica debe realice lo
siguiente.
Tanto de la fuente de aguas
residuales como de las de
moscas.
1. Decante 10 mL del
enriquecimiento de bacteriófagos
(del punto B tanto de moscas
como de agua residual) dentro de
un tubo para centrífuga y
centrifugue a 3000 r.p.m. por 30
minutos, para remover bacterias y
material sólido.
2. Del sobre nadante del tubo
centrifugado, con la ayuda de una
jeringa, filtre el sobrenadante a
través de un filtro de membrana
(con el filtro Millipore) y deposite el
líquido claro dentro de un tubo con
tapón de rosca.
3. Marque 4 tubos de caldo soya
tripticaseína (con 3 mL cada uno),
del 1 al 4.
4. Asépticamente adicione 0.5 mL de
la suspensión enriquecida (del
paso dos) al tubo uno y mezcle
cuidadosamente aspirando y deben observar las capas líticas o
bajando el volumen dos a tres
veces. De este tubo (1) transfiera
0.5 mL al segundo tubo, y repita la
operación hasta el tubo (4) y el
restante 0.5 mL viértalo a un
contenedor con desinfectante.
PRÁCTICA NÚMERO 1 |
6
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS
5. Adicione 0.1 mL de cultivo de E.
coli del paso A, a los tubos de
agar blando, previamente fundido
y manteniéndolo a 45 ºC.,
continúe manteniéndolos a 45 ºC
sin permitir que solidifique.
6. Pipeteé del tubo (4) 1 mL y
viértalo al agar blando (marcado
con el número 4), mezcle por
agitación y rápidamente invierta
este tubo sobre la caja marcada
con el número (4), mezcle en
forma de ochos. Repita la
operación para los tubos (1) al (3)
a igual número de cajas de Petri –
resultados cuantitativos por la
aparición de las calvas (celular
formadores de colonias)-.
7. Adicione dos asadas de cultivo de
E. coli, a cada remanente de los
tubos (del 1 al 4) del paso anterior
y mezcle suavemente -resultados
cualitativos, existe o no turbidez al
día siguiente- (cuidando que la
asada de E. coli sea de la fuente
correspondiente, moscas o aguas
residuales, recuerde que los virus
son selectivos).
8. Incube las cajas y los tubos del
paso 9 a 35 ºC por 24 horas,
observe.
9. Ver la figura 3.1.3 de como se
calvas en las cajas.
 7
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

DIAGRAMA DE FLUJO

Decantar
enriquecimiento Adicionar 0.1 mL
B y centrifugar. de caldo de
E.coli y 1 mL de
caldo de fago.*

Decantar el
sobrenadante Verter mezclas
del centrifugado en cajas Petri
y filtre con con agar
ayuda de una preformado.*
jeringa y un filtro
de disco
Millipore. 0.5 mL

0.5 mL
Tubo 1
0.5 mL
Realizar
diluciones * 1 mL

1 mL Tubo 4

Fundir agar
blando y
mantener a
45 °C
Caja 4

PRÁCTICA NÚMERO 1 |
 8
PRÁCTICA NÚMERO 1
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

Adicionar asadas
de E. coli a los
remanentes de los
tubos con caldo de REFERENCIAS
fago.

1. Lorraine smith a. principles of

microbiology. 8a ed. USA: editorial
Mosby: 1981.pp 392-399.
2. Ketchum P.A. Microbiology. USA:
editorial wilwy & sons. 1988. pp 431-
Cultivo de 513
E.coli Remanente de 3. Bayley and Scott´s. Diagnostic
los tubos con microbiology. 7a ed. USA: Editorial
caldo de fago Mosby. (1986). pp 234-495.
4. Mims. P. Microbiología médica.
España: editorial Mosby. 1995. pp
1.6-24.9
5. Brooks G. Microbiología médica de
CUESTIONARIO Jawetz, Melnick y Adelberg. 17ª ed.
México: Editorial El Manual Moderno.
2002.
1. Describe la forma del DNA virus y 6. Douglas, J. Bacteriófagos. España
RNA virus. (Barcelona): Ediciones Omega. 1978.
2. Amplíe lo que es un bacteriófago. 7. Madigan M.T., Martinko J. M.
3. ¿Cuántos virus de la hepatitis hay y Biología de los microorganismos. 10ª
cuál es su forma de transmisión, de ed. España (Madrid): Editorial
cada uno de ellos? Pearson Educación, 2004.
4. Describe la forma que presenta el 8. Murray P. Microbiología Médica. 4ª
virus HIV. ed. España: Editorial Mosby, 2004.
5. ¿Qué es el SIDA?

PRÁCTICA NÚMERO 1 |