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UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 1: NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Docente: AZULA SANGUINO QUINTERO

INTRODUCCIÓN

El trabajo de laboratorio requiere la observación de una serie de normas de

seguridad que eviten posibles accidentes debido a su desconocimiento.
Las normas de Bioseguridad, son un conjunto de actividades, intervenciones y
procedimientos de seguridad ambiental, ocupacional e individual que garantizan el
control del riesgo biológico, físico y químico. No sólo protege al personal que labora
en el laboratorio, sino también la instalación física y las muestras que se procesan
en el laboratorio, para evitar la contaminación cruzada que pueda invalidar el trabajo
y dar falsos positivos.

OBJETIVOS

1. Recordar las normas de bioseguridad para aplicarlas en los diferentes

laboratorios.

Nota: No pueden olvidar su material de trabajo para el buen desempeño de

la práctica, entre ellos:

1. Uniforme completo
2. Bata
3. Gorro
4. Guantes (Cuando lo requiera)
5. Tapabocas (Cuando lo requiera)
6. Cuaderno de notas
7. Guía de laboratorio (Leída)
8. Lápiz de cera y marcador
9. Asa recta y asa curva
10. Laminas o portaobjetos
11. Laminillas o cubreobjetos
12. Papel de arroz o de limpiar lentes
2

13. Jabón desinfectante

14. Toallas desechables
15. Cinta tirro
16. Tijeras
17. Bisturí

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Cada estudiante se responsabiliza de su zona de trabajo y de su material.

Ingresar al laboratorio con los elementos de uso personal: bata, cofia y tapabocas.
No comer, fumar ni beber en el laboratorio.
No permitir la entrada de personal ajeno al laboratorio.
Mantener limpio, desinfectado y ordenado el área de trabajo
Si se derrama accidentalmente un producto contaminado, avisar a los
compañeros y al docente para proceder a su desinfección, callar la situación es un
riesgo personal y para los compañeros, contamina el ambiente y atenta contra la
bioseguridad.
No entrar animales al laboratorio.
No pipetear con la boca, usar pipeteador mecánico para tal fin.
Todos los residuos sólidos o líquidos contaminados, se descontaminarán antes
de descartarlos.
Utilice guantes pasa su protección
Cumpla estrictamente las orientaciones de los procedimientos a seguir.
Realizar control de calidad a cada uno de los procedimientos de esterilización.
Descartar material y medios de cultivo que no reúnan las condiciones de
esterilización.
Maneje con cuidado los equipos y material de vidrio, si tiene dudas al respecto
consulte al docente o al auxiliar.
Trabaje siempre muy cerca del mechero, no hablar, no toser directamente sobre
los medios de cultivo o las muestra a procesar, podría contaminarlas.
No formar aerosoles
Las asas deben esterilizarse antes y después de utilizarse.
No se desplace a otros lugares con material contaminado.
Tenga cuidado con el uso de agujas, lancetas, bisturís, jeringas, material roto,
entre otras que pueden afectar su integridad.
Identifique adecuadamente los cultivos o preparaciones que realiza, rotule todo
lo que trabaje para evitar confusiones.
 Utilice los servicios de recolección de patógenos que se dispone, separando los
residuos en bolsas de color según las recomendaciones para su uso:
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Bolsas de color negro: desechos no contaminados, se eliminan en la basura

corriente.
Recipientes rojos: elementos corto punzantes como agujas, jeringas,
lancetas, bisturís, depositarlos en recipientes plásticos; los cultivos, la sangre
y los sueros se deben esterilizar previamente antes de desecharlos y ser
llevados al incinerador.
Bolsas de color rojo: algodones, gasas, papeles contaminados, se trasladan
al incinerador.

Los desinfectantes químicos recomendados para el trabajo general en el

laboratorio: hipoclorito de sodio al 0.1%, compuestos fenólicos, formaldehído,
soluciones yodadas, entre otras.

Descontaminar el área de trabajo antes de su trabajo en el laboratorio.

RECOMENDACIONES PARA ESTERILIZAR MATERIAL DE VIDRIO Y DE OTRO

MATERIAL QUE RESISTA EL CALOR:

Todo material debe estar previamente limpio y seco, posteriormente se envuelve en

papel kraft para protegerlo del ambiente externo y luego se esteriliza ya sea por
calor seco o calor húmedo según indicaciones del material a trabajar.

BIBLIOGRAFÍA

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Prentice – Hall. Madrid. 2003
4

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 2: METABOLISMO BACTERIANO. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE

LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE.

Docente: AZULA SANGUINO QUINTERO

OBJETIVOS

 Comprender que la actividad metabólica de los microorganismos es

indispensable para una correcta identificación.
 Conocer el fundamento bioquímico de las pruebas bioquímicas utilizadas en
el laboratorio.
 Interpretar el crecimiento de las enterobacterias en los diferentes medios de
cultivo trabajados.

INTRODUCCIÓN

Según Murray et al (2008), la familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y

heterogéneo de bacilos Gram negativos de importancia clínica. Se conocen más
de 40 géneros con cerca de 150 especies, estos géneros se han descrito según sus
propiedades bioquímicas, estructura antigénica e hibridación y secuenciación de los
ácidos nucleicos. A pesar de la complejidad de esta familia, menos de 20 especies
son las responsables de más del 95% de las infecciones (p. 323)
Son microorganismos ubicuos, se encuentran en forma universal en el suelo,
agua y vegetación y también en la flora intestinal normal de muchos animales
incluyendo al ser humano. Producen una gran cantidad de enfermedades en el ser
humano; entre ellas septicemias, infecciones del aparato urinario, infecciones
intestinales, entre otras.
Revisar capítulo sugerido: Familia Enterobacteriaceae. Diagnóstico microbiológico.
Autor: Koneman et al. (2008).

IMPLEMENTOS
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EQUIPOS Y REACTIVOS

 Implementos personales
 Microscopio óptico
 Cajas de Petri con medios de cultivo: Agar Hektoeen, Agar Mac Conkey, Agar
BPLS, Agar EMB.
 Pruebas bioquímicas: Agar TSI, Agar Citrato, Agar LIA, Agar SIM, Agar Urea,
Caldo Nitratos, Caldo Rojo de Metilo/Voges Proskauer, Azúcares como
lactosa, glucosa, Sacarosa, Maltosa.
 Reactivos: Tinción de Gram, Peróxido de hidrógeno al 3%, Prueba de
oxidasa, Reactivo de Kovac’s, Indicador Rojo de metilo, KOH, α- Naftol, Polvo
de Zinc, Reactivo de Griess.

MATERIAL BIOLÓGICO

 Cultivos de cepas de Enterobacterias como: Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Proteus vulgaris, Morganella morganii, entre otros que se
encuentren disponibles en el cepario.
 Cultivos de cepas de Pseudomonas aeruginosa para control de algunas
pruebas y contrastar algunas características.

PROCEDIMIENTO

Parte I:
Observen las características del cultivo bacteriano que les correspondió, tenga en
cuenta características como tamaño, color, aspecto, elevación, borde de la colonia,
indique el medio en el que está el cultivo.

Parte II:
Realice extendido del cultivo en una lámina limpia y seca para realizar tinción de
Gram. Registre morfología y respuesta tintorial. Las células presentan alguna
agrupación bacteriana? De ser así, indique cuál.

Parte III:
a. Realice las siguientes pruebas preliminares:

1. Prueba de oxidasa: sobre la tirilla de la prueba de oxidasa, con la ayuda de

un palillo de madera realice un extendido del cultivo, observe inmediatamente
que ocurre, si observa un cambio de color a azul violeta se interpreta como
positiva, pero de no registrarse cambio de color se interpreta que la prueba
es negativa. (Tenga en cuenta que todas las enterobacterias son Oxidasa
negativas)
6

2. Prueba de catalasa: sobre un portaobjetos con un asa redonda estéril

deposite una pequeña cantidad del cultivo. Luego deje caer una gota de
Peróxido de hidrogeno al 3% y observe que ocurre.
 De ser positiva la prueba, usted observará un desprendimiento de
burbujas, si no observa ningún cambio registrará como un
resultado negativo.

b. Siembre en Pruebas bioquímicas:

 A partir del cultivo bacteriano que les correspondió, siembre a partir de una
asada en las pruebas entregadas: Agar TSI, Agar Citrato, Agar LIA, Agar
SIM, Agar Urea, Caldo Nitratos, Caldo Rojo de Metilo/Voges Proskauer,
Azúcares como lactosa, glucosa, Sacarosa, Maltosa.
 Lleve a la incubadora a 37°C/ 24 – 48 horas.
 Realice la lectura, interprete los resultados teniendo en cuenta los cambios
que se hacen evidentes por los indicadores o reveladores de cada prueba y
a las propiedades bioquímicas de cada bacteria.
 Registre los resultados obtenidos

c. Siembre en medios de cultivo selectivos y diferenciales para bacterias

Gram negativas:

 Siembre por agotamiento (técnica francés o rejilla), a partir de una asada del
cultivo a cada uno de los medios facilitados: Agar Hektoeen, Agar Mac
Conkey, Agar BPLS, Agar EMB.
 Lleve a la incubadora a 37°C/ 24 – 48 horas.
 Realice la lectura, interprete los resultados teniendo en cuenta los cambios
que se hacen evidentes por los indicadores o reveladores de cada medio y a
las propiedades bioquímicas de cada bacteria.
 Registre los resultados obtenidos.
7

Tenga a la mano las tablas de identificación que vienen en el capítulo sugerido

(Koneman et al).

Posibles resultados a obtener:

Agar TSI: Agar LIA:

Agar Citrato: Caldo RM/VP:

Fuente: https://www.google.com.co/search?biw

Consulta:

1. Realice una tabla comparativa de cada uno de los géneros de las

Enterobacterias donde incluya pruebas bioquímicas, infecciones que
causan y aspectos epidemiológicos relevantes.
2. En un cuadro mencione cada una de las pruebas bioquímicas realizadas
a las Enterobacterias; con el fundamento o principio de la prueba, medios
y reactivos utilizados, procedimiento y controles.

BIBLIOGRAFÍA

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Editorial Prentice – Hall. Madrid. 2003
8

Koneman et al. Diagnóstico microbiológico. Editorial Panamericana. 5a edición.

2008

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÀSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 3: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS Y SUELOS

RIZOSFÉRICOS

Docente: LAURA YOLIMA MORENO ROZO

OBJETIVOS

 Reconocer las técnicas básicas para realizar una toma de muestras de suelo
para análisis microbiológico.
 Realizar recuentos de microorganismos del suelo empleando el método del
recuento en placa profunda mediante la técnica de diluciones en serie.
 Establecer el número aproximado de la población microbiana en el suelo y
realizar un análisis de la calidad del mismo.

INTRODUCCIÓN

Toma de muestras. La muestra debe ser representativa del área donde sea
colectada. Un muestreo representativo es aquel que cubre la mayor parte del
terreno. Para ello se recomienda preparar un plano del terreno y tomar puntos
aleatorios caminando en zigzag.
Las muestras deben tomarse con elementos estériles, retirando previamente el
material vegetal o no material no deseado (basura, residuos). Si se utiliza pala, es
necesario primero hacer un hoyo en forma de V; luego se remueve de un lado una
capa de tierra de 3cm de grueso, después se elimina la tierra de ambos lados del
hoyo. Con la pala se toma la muestra del centro del hoyo.

Una vez seleccionado el sitio, se retira el material de cobertura y se procede a tomar

muestras entre los 10-20 cm de profundidad para muestras de suelo, y lo más
cercano a la raíz de la planta para muestra de suelo rizosférico (máximo 5cm de
distancia).

El muestreo puede ser compuesto, es decir, que de un mismo terreno se toman

varias submuestras para conformar una sola. Las submuestras se mezclan
9

homogéneamente en un cubo limpio, hasta obtener una cantidad representativa que

debe ser de 1 kg.

Las muestras para análisis microbiológico deben ser recolectadas en bolsa de papel
y no en bolsa plástica para evitar la elevación de la temperatura y la condensación.
Deben ir correctamente marcadas con nombre, dirección de la granja, número o
letra de identificación en campo.

Para análisis fisicoquímico podrán ir transportadas en bolsa plástica, pero deben ser
procesadas a más tardar dentro de las siguientes 24 horas en especial si se
pretende realizar análisis de nitrógeno amoniacal.

Tipo y cantidad de muestras a tomar.

Muestra simple: es la que se obtiene con una sola extracción del suelo, son usadas
en trabajos de investigación y en suelos muy homogéneos. Se recomiendan 4
muestras por hectárea, de 1 kg de suelo cada una.

Muestra compuesta: se refiere a la muestra de suelo obtenida por la extracción de

varias muestras simples o subcompuestas, reunidas en un recipiente y bien
mezcladas, de donde se retiran de 0.5 a 1 kg de suelo. Son las más usadas para
la planificación de la fertilización.
Se recomienda 15 – 20 submuestras por parcela de muestreo.
En la toma de una muestra compuesta, se debe tener en cuenta que cada
submuestra sea del mismo tamaño que las demás y representar la misma sección
transversal del tamaño de donde se toma la muestra (una misma profundidad).
Coyne (2000).

Transporte de la muestra: deben ser transportadas en condiciones de frío y en el

menor tiempo posible.

Procesamiento: para los análisis se deben tener en cuenta varios aspectos:

Humedad: no debe exceder la humedad del 60%. Lo ideal es que la muestra

conserve su propia humedad, pero si viene muy húmeda es necesario colocarla a
secar durante 24 horas extendiendo la muestra en papel Kraft hasta humedad
adecuada; si viene muy seca, no debe humedecerse, se analiza lo antes posible.

Textura: puede ser diferente según el porcentaje de arcillas, arena o limo que
contenga. Es importante antes de pesar, homogenizar la muestra, destruyendo las
partículas grandes y en lo posible tamizar el suelo (tamiz N| 4,10 o 20). Una vez
tamizado, se pesa y procede a realizar el análisis.

El análisis microbiológico, debe realizarse lo antes posible, no exceder las 24

horas o máximo las 48 horas, porque afecta el recuento.
10

La cantidad de suelo a tomar, estará en función de la extensión total del área a

analizar, no debe ser inferior a 100 gramos, en parcelas de 100 a 200 metros, se
deben tomar no menos de 5 muestras individuales o parciales, mientras que en
áreas mayores se debe observar proporcionalidad en cuanto al número de
muestras, teniendo en cuenta la capacidad de análisis del laboratorio.

Realice el siguiente procedimiento:

1. Elegir zonas donde efectuará el muestreo, limpiando la vegetación

superficial y sustancias ajenas al suelo. Retirar la capa superficial (1 o 2 cm)
y proceda a realizar un corte vertical hasta la profundidad deseada, evitando
derrumbes que contaminen los diferentes niveles del suelo. Con espátulas
o palas tome la cantidad de suelo requerida, tenga en cuenta tomar este
muestreo lejos de la zona del rizosférico. (Alejado de las raíces de las
plantas).
2. Rotular la muestra: con datos de profundidad, tipo de suelo, vegetación o
cultivo y otros aspectos que considere pertinentes.
3. Transporte de la muestra: lo antes posible para su análisis.

IMPLEMENTOS

 Balanza
 PHmetro
 Autoclaves
 Papel estéril para pesar
 Frascos de dilución con 90 ml de agua peptona estéril
 Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptona estéril
 Pipetas de 1 ml
 Cajas de Petri
 Agar Glicerina
 Agar Almidón Amoniacal
 Agar Rosa de Bengala cloranfenicol
 1 muestra de suelo de aproximadamente 500 g etiquetada (datos relevantes
de la muestra)

PROCEDIMIENTO

Toma de muestras: el muestreo se puede realizar al azar, siguiendo una de las

presentes formas (tenga en cuenta la fundamentación teórica sobre toma de
muestras que aparece en esta guía), mantenga la muestra refrigerada para su
procesamiento.
11

Fuente: https://www.google.com.co/imgres?imgurl=

Etiquetado de la muestra.

 Nombre del propietario y de la finca o parcela

 Localidad (de ser posible indicar altura sobre el nivel del mar)
 Municipio
 Departamento
 Lote de donde tomo la muestra (ubicación)
 Cultivo anterior y cultivo a sembrar o sembrado
 Área o superficie que representa
 Disponibilidad de residuos de cosecha
 Fertilizantes o enmiendas aplicadas en el cultivo anterior
 Tipo de análisis que requiere

Toma de pH. Se coloca en el vaso de precipitado una suspensión de suelo en agua

destilada en igual proporción (1:1), ir desplazando el dial del pH - metro hasta que
el galvanómetro este en equilibrio. Este ensayo se repite tres veces en un lapso de
10 minutos, informar el promedio de las tres tomas como el pH de su muestra de
suelo.

Análisis microbiológico: partiendo de la muestra de suelo se preparan diluciones

hasta 10 -6. Rotular dos cajas de Petri con diluciones de 10 -6 y agregar a ellas 1 ml
de dicha dilución, repetir el procedimiento pero con diluciones 10 -5 y 10 -4 . Debe
rotular en cada una de las cajas con su correspondiente dilución, grupo de trabajo
y microorganismos a identificar de la siguiente manera:

 10 -6 para recuento de Bacterias y se adiciona Agar Glicerina

 10 -5 para recuento de Actinomicetos y se adiciona Agar Almidón Amoniacal
 10 -4 para recuento de Hongos y se adiciona Agar Rosa de Bengala
cloranfenicol
12

BACTERIAS ACTINOMICETOS HONGOS

Dilución a sembrar 10 -6 10 -5 10 -4

Medio de cultivo Agar Glicerina Agar Almidón Agar Rosa de

Amoniacal Bengala
cloranfenicol
Recuento
(colonias)
Caja 1
Caja 2

Informe
microbiológico
(UFC/g)

Homogenizar el contenido de las mismas con un movimiento rotatorio suave.

Dejarlas en reposo hasta completa solidificación. Incubar a 30°C/48 horas para
Bacterias, realizando observaciones en lo posible diarias. Incubar a 30°C/3 – 5 días
para Hongos y Actinomicetos a 30°C/ 5 – 7 días. Expresar los resultados en UFC/g.

Informe el recuento total y discuta sus resultados. Describa específicamente, a partir

de cada crecimiento las características morfológicas, a nivel macro y microscópico
de las colonias obtenidas de los diferentes medios de cultivo. Explique el por qué
de su crecimiento teniendo en cuenta lo visto en teoría y las consultas realizadas
por ustedes.

Registre los resultados en la tabla, comparé con los resultados obtenidos por los
demás grupos y realice discusiones grupales con fundamentación teórica,
correlacione datos de la muestra con análisis fisicoquímicos (pH).

Cuestionario

1. Qué grupo microbiano predominó en el suelo analizado? Discuta sobre este

grupo microbiano y explique cuáles son las condiciones ideales para su
crecimiento teniendo en cuenta la fundamentación teórica.

Bibliografía

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Editorial Prentice – Hall. Madrid. 2003

Coyne et al. Microbiología del Suelo. Un enfoque exploratorio. 2000.

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UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÀSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 4: PARTICIPACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO EN LA

DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS CARBONADOS.

Docente: LAURA YOLIMA MORENO ROZO

AZULA SANGUINO QUINTERO

OBJETIVO
 Conocer las capacidades bioquímicas de los microorganismos del suelo
frente a los compuestos carbonados.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos que tienen como hábitat el suelo pueden tener dentro de sus
propiedades metabólicas la capacidad de degradar múltiples compuestos orgánicos
por medio de enzimas específicas, permitiéndoles obtener energía de la materia
orgánica, por lo tanto, podrían ser microorganismos saprófitos que cumplen un
papel o función muy importante en el ciclo del Carbono.

IMPLEMENTOS
 Balanza
 pHmetro
 Autoclaves
 Papel estéril para pesar
 Frascos de dilución con 90 ml de agua peptona estéril
 Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptona estéril
 Pipetas de 1 ml
 1 muestra de suelo de aproximadamente 500 g etiquetada (datos relevantes
de la muestra)
 Tubos tapa rosca con caldo de diferentes azúcares (glucosa, sacarosa,
lactosa, maltosa, manitol, xilosa), con indicador rojo de fenol y campana
durham.

PROCEDIMIENTO
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 Toma de muestras: el muestreo se puede realizar al azar, siguiendo una de

las presentes formas (tenga en cuenta la fundamentación teórica sobre toma
de muestras que aparece la guía anterior), mantenga la muestra refrigerada
para su procesamiento.
 Dilución: prepare una dilución del suelo fresco a analizar. Pese 10 gramos
de la muestra y diluya en un frasco de dilución con 90 ml de agua peptona
estéril. (10-1 ).
 Inóculo: con pipeta estéril tome 0.1 ml de la dilución anterior y siembre en
los caldos con diferentes azúcares (glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa,
manitol, xilosa), más indicador rojo de fenol y campana durham.
 Incube a 35°C durante 48 horas, registre resultados en la siguiente tabla:

RESULTADOS

MEDIO DE ÁCIDO GAS TURBIDEZ

CULTIVO
Caldo glucosa
Caldo sacarosa
Caldo lactosa
Caldo maltosa
Caldo manitol
Caldo xilosa

Para la interpretación de los resultados, tenga en cuenta, que el indicador Rojo de

fenol, en condiciones neutras es ligeramente naranja y si hay fermentación de los
azúcares, se producirán suficientes ácidos como para hacer virar el indicador a
amarillo, la campana durham le permitirá atrapar el gas producto de la fermentación
de cada azúcar en caso tal que lo produzcan y la turbidez es resultado del
crecimiento microbiano. Observe imagen al final de la guía.

CUESTIONARIO
1. Qué enzimas deben poseer los microorganismos para poder fermentar cada
uno de los azúcares?
2. Cuando producen gas qué enzima participa y qué tipo de gas se genera?
3. Explique cómo se lleva a cabo el proceso fermentativo y qué finalidad cumple
para
Los microorganismos

BIBLIOGRAFÍA

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Prentice – Hall. Madrid. 2012
Coyne et al. Microbiología del Suelo. Un enfoque exploratorio. 2000.
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FACULTAD DE CIENCIAS BÀSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 5: FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO

Docente: LAURA YOLIMA MORENO ROZO

AZULA SANGUINO QUINTERO

OBJETIVO

 Aislar microorganismos fijadores de nitrógeno microaerófilos y aerobios

estrictos a partir de muestras de suelo agrícola.

INTRODUCCIÓN

Entre los seres vivos, los únicos capaces de llevar a cabo la fijación de nitrógeno
son organismos procariotas. También llamados diazotróficos llevan a cabo este
proceso gracias al complejo enzimático nitrogenasa que cataliza la siguiente
reacción:

N2 + 16 ATP + 10 H+ + 8 e- → 2 NH4+ + H2 + 16 Pi + 16 ADP

Este complejo enzimático es muy sensible al oxígeno. Sin embargo muchos de

estos organismos presentan adaptaciones que les permiten fijarlo en condiciones
muy diversas. En primer lugar se debe distinguir entre organismos capaces de
llevar a cabo la fijación de Nitrógeno en vida libre y aquellos que establecen
asociaciones simbióticas para llevar a cabo este proceso.
Dentro de los organismos fijadores en vida libre se pueden encontrar bacterias
anaerobias estrictas, como Clostridium sp, y facultativas, como Klebsiella sp, pero
también aerobias estrictas como Azotobacter sp, Beijerinckia sp, Azospirilum sp,
entre otras. Se encuentran también en este grupo, arqueobacterias
como Methanosarcina sp y Methanococcus sp, bacterias fotosintéticas
como Rhodospirillum sp y Chromatium sp y cianobacterias como Oscillatoria
sp y Gloeothece sp, entre otras.
16

Los organismos fijadores en simbiosis se destacan por su importancia agronómica,

los organismos que forman simbiosis con plantas leguminosas. Estos organismos
pertenecen al subgrupo de las proteobacterias en el que se incluyen los
géneros Allorhizobium sp, Azorhizobium sp, Bradyrhizobium sp, Mesorhizobium
sp, Rhizobium sp y Sinorhizobium sp y se denominan genéricamente rizobios.
También existen algunas simbiosis fijadoras de nitrógeno entre algunos géneros
de plantas no leguminosas y otros organismos procariotas como el
actinomiceto Frankia sp y las cianobacterias Nostoc sp, Anabaena sp, entre otras.
Dentro de los géneros que forman simbiosis con las leguminosas, el
género Rhizobium sp forma nódulos con leguminosas de origen templado,
presenta un crecimiento rápido en vida libre y los genes relacionados con la fijación
se encuentran en plásmidos. Por el contrario, el género Bradyrhizobium sp forma
simbiosis con leguminosas de origen tropical, presenta un crecimiento lento en
vida libre y los genes relacionados con la fijación son cromosómicos. El resto de
los géneros presenta características intermedias y una similitud entre el 93-96%
respecto a los dos primeros géneros.
En los últimos años se han descrito nuevos géneros capaces de establecer
simbiosis y formar nódulos con leguminosas, como Burkholderia sp y Ralstonia
sp.

IMPLEMENTOS

 Balanza
 pHmetro
 Autoclaves
 Papel estéril para pesar
 Frascos de dilución con 90 ml de agua peptona estéril
 Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptona estéril
 Pipetas de 1 ml
 1 muestra de suelo de aproximadamente 500 g etiquetada (datos relevantes
de la muestra)
 Viales con medio semisólido NFB (Bacterias fijadores de nitrógeno)
 Cajas de Petri con agra Ashby
 Kit de trabajo

METODOLOGÍA

1. Recuento de microorganismos diazotróficos por el método de NMP:

partiendo de la muestra de suelo se preparan diluciones hasta 10 -6 , a partir
de las diluciones
10-4, 10-5 , 10-6 sembrar por triplicado 0.1 ml de la dilución correspondiente a
cada vial que contiene 15 ml aproximadamente del medio NFB. Incubar los
viales a 32°C durante 5 a 7 días y observar la formación de biopelicula y viraje
del medio de color verde claro a un azul intenso por la alcalinización del
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medio por la formación de amonio por parte de los microorganismos fijadores

de nitrógeno, esto gracias a la reacción del indicador de pH azul de
Bromotimol. Interprete luego los resultados utilizando la tabla de Mc Craddy.
(Dobereiner et al. 1995).

2. Técnica de Gránulos: realizar siembras directas de (10 a 12) gránulos de

suelo sobre el medio de cultivo Ashby previamente atemperado el cual es
libre de nitrógeno, favorable para el crecimiento de Azotobacter sp y otras
bacterias diazotróficas. Incubar a 32°C/5 a 7 días. Realice observaciones de
colonias típicas de Azotobacter sp, las cuales tienen un aspecto brillante, son
circulares convexas, de color verde, negro o café, de ser necesario purifique
colonias sospechosas de Azotobacter sp, que al realizar tinción de Gram
respondan como bacilos o cocobacilos aislados o en pareja, Gram negativos
y formadores de quistes, los cuales se relacionan con la resistencia de la
bacteria a las condiciones ambientales.

RESULTADOS
Registre sus resultados y analice la calidad del suelo, tenga en cuenta los dos tipos
de análisis.

CUESTIONARIO

1. Indague características claves de los microorganismos relacionados en la

introducción y su importancia en el suelo.
2. Consulte especies del género Azotobacter sp y su importancia en los suelos
agrícolas. Cómo se identifican, explique las técnicas o procedimientos.

BIBLIOGRAFIA

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Prentice – Hall. Madrid. 2012

Coyne et al. Microbiología del Suelo. Un enfoque exploratorio. 2000.

Argüello, Adriana. Moreno, Laura. Consultado en:

https://revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/41033/48394
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UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÀSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 6. INTERACCIONES MICROBIANAS

Docentes: LAURA YOLIMA MORENO ROZO

AZULA SANGUINO QUINTERO

OBJETIVOS

 Determinar por siembra directa la microflora epifita o flora comensal

de las plantas.
 Analizar los diferentes tipos de interacciones microbianas que ocurren
en la naturaleza.

INTRODUCCIÓN

En la naturaleza existe un número indeterminado de asociaciones entre poblaciones

microbianas así como individuos, éstas son reguladas por factores del ambiente:
físicos y químicos, en el suelo, en las raíces de las plantas, en los tallos y sus hojas;
las relaciones microbianas determinan cual es la comunidad dominante, las
inhibidas e incluso aquellas que coexisten sin afectar positiva o negativamente otras
poblaciones microbianas. La dinámica de las interacciones entre especies de
microorganismos con las plantas es más compleja, aquí como en el suelo tienden
al equilibrio e influyen en la productividad agrícola.

IMPLEMENTOS
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 Solución de hipoclorito al 0.1%

 Papel estéril para cortar
 Material vegetal: tallos frescos, hojas frescas y frutos maduros de un cultivo
agrícola (de semillas pequeñas).
 Bisturí
 Cajas de Petri con agar Sabouraud, agar Nutritivo, agar Müeller Hinton
 Cepas de microorganismos antagonistas: Trichoderma sp, Pseudomonas sp
u otros que se faciliten.
 Cepas de microorganismos patógenos: Fusarium sp, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus u otros que se faciliten.
 Kit de trabajo

PROCEDIMIENTO

1. Estudio de la micro flora epifita o comensalismo:

Se quiere evidenciar la participación microbiana como flora epifita (comensal) sobre

el material vegetal.

1. Retire las semillas de los frutos y conserve muy cerca del mechero.
2. Corte cerca del mechero con bisturí estéril en fragmentos muy pequeños
los tallos y hojas del material vegetal.
3. Coloque en suspensión durante un lapso de 5 minutos en solución de
hipoclorito al 0.1% con el fin de eliminar contaminación ambiental.
4. Retire de la solución desinfectante, coloque sobre una toalla absorbente
para evitar exceso en la siembra
5. Método de siembra directo de las semillas, hojas y tallos en las cajas de
agar nutritivo y agar sabouraud.
6. Incubar a 30°C/ 5 días las cajas de agar Sabouraud e incube a
30°C/48horas las cajas de agar Nutritivo.
7. Después del periodo de incubación realice lectura, registre características
macroscópicas de las colonias, son representativas como flora epífita
cuando hay varias colonias con igual a parecida morfología. Interprete
los resultados.

2. Prueba de antagonismo:

Se evalúa la posibilidad de inhibición de un microorganismo por los metabolitos que

produce o el metabolismo acelerado de microorganismos con capacidad antagónica
como Trichoderma sp (antagónico) frente a Fusarium sp (patógeno).
20

1. Técnica Dual: sobre una caja de Petri con agar sabouroud atemperado y
seco, realice siembra por contacto una asada del cultivo de Trichoderma
sp hacia un lado de la caja y al otro lado de la caja siembre por contacto
una asada del cultivo de Fusarium sp. Incubar a 30°C/5días y realizar la
lectura e interpretación de resultados.

Técnica dual. Consultado en:

https://www.google.com/search?tbm=isc
h&q=tecnica+de+siembra+microbiol%C3
%B3gica+dual&chips=q:tecnica+de+siemb
ra+microbiol%C3%B3gica+dual,online_chi
ps:trichoderma&sa=X&ved=0ahUKEwjG3f
G65o_eAhWJr1kKHR19BQAQ4lYI

2. Técnica Igarashi: sobre una caja de Petri con agar Sabouroud

atemperado y seco, realice siembra de 4 estrías utilizando una asada del
cultivo de Trichoderma sp para cada estría (realizar una cuadricula) y en
el centro de la cuadricula inocular el microorganismo patógeno en este
caso Fusarium sp. Incubar a 30°C/5días y realizar la lectura e
interpretación de resultados.

Técnica Igarashi.
Consultado en:
https://www.google.com/search?tbm=isch&
q=tecnica+de+siembra+microbiol%C3%B3gic
a+dual&chips=q:tecnica+de+siembra+microb
iol
21

Ilustración 3. Trichoderma sp Ilustración 4. Fusarium

sp

3. Antibiograma:
Se evalúa la resistencia o sensibilidad que puedan presentar diferentes bacterias
Gram negativas al antibiótico Amikacina de 30µg.

Técnica de siembra: sobre una caja de Petri con Agar Müeller Hinton, realice una
siembra masiva del cultivo bacteriano que le corresponda (Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa u otras
disponibles en el cepario). En el centro de la caja, coloque un sensidisco del
antibiótico Amikacina de 30µg. Incube a 37°C por 48horas.

Interprete los resultados. Mida el halo de inhibición que se haya generado y

determine si el microorganismo muestra sensibilidad (Halo ˃ a 17 mm), Resistencia
(Halo ˂ 17 mm) o sensibilidad intermedia (Halo =17mm).

Tomado de:
https://www.revistabiomedica.org/index.ph
p/biomedica/article/viewFile/1891/1917

CUESTIONARIO:

1. Busque fundamento del antibiótico y qué efecto ejerce a nivel bacteriano para
discutir sus resultados.
2. Indague el comportamiento del microorganismo antagónico (Trichoderma sp)
y microorganismo patógeno (Fusarium sp), para sustentar los resultados.
22

3. Qué tipo de flora epífita o comensal puede tener el tipo de cultivo agrícola
que utilizó en la práctica, discuta los resultados.

BIBLIOGRAFIA

Madigan, M. T: Martinko, J. M. y Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos.

10° edición. Prentice – Hall. Madrid. 2012

Coyne et al. Microbiología del Suelo. Un enfoque exploratorio. 2000.

Mellado, J. C. Microbiología agrícola e interacciones microbianas. 2006. Consultado

en: http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2006/mi062p.pdf
23

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÀSICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

LAB. No 7. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS

Docente: LAURA YOLIMA MORENO ROZO

AZULA SANGUINO QUINTERO

OBJETIVOS

 Conocer las diferentes técnicas de toma de muestra para análisis

microbiológico de aguas.
 Analizar microbiológicamente diferentes muestras de agua cruda.
 Revisar diferentes referentes teóricos que orienten al estudiante en la
normatividad fisicoquímica y microbiológica para determinar la calidad del
agua.

INTRODUCCIÓN

La muestra llevada al laboratorio debe ser representativa de la fuente que se analiza

y no haber sufrido cambios significativos, luego de ser colectada. Por lo tanto, se
debe disponer de frascos de vidrio neutro con tapón esmerilado o roscado, muy
limpios y esterilizados en autoclave a 121ºC durante treinta minutos o en horno de
Pasteur a 180ºC durante dos horas. También pueden utilizarse frascos de material
macromolecular con tapón roscado, esterilizados mediante etileno óxido,
radiaciones gamma u otros sistemas adecuados.
Los recipientes empleados han de tener una capacidad mínima de 250 ml, si bien
es útil disponer de otros de mayor capacidad cuando la técnica analítica así lo exija.

Diferentes tipos de muestras de agua que se pueden analizar y como

recolectarla:

Grifos: una vez retirados filtros u otros accesorios se procederá a una cuidadosa
desinfección con alcohol. Con el grifo cerrado se flameará el extremo del mismo,
mediante la llama obtenida con un poco de algodón empapado de alcohol y
sostenido con unas pinzas o bien una lámpara de soldar. Se abrirá el grifo para que
el agua fluya abundantemente y se renueve la contenida en la tubería que la
alimenta. Se destapará el frasco esterilizado sin tocar la boca del mismo ni el interior
24

del tapón.

Todos los movimientos deberán realizarse sin interrupciones, al abrigo de

corrientes de aire y con las máximas precauciones de asepsia.

Pozos y depósitos: si se dispone de bomba de captación se opera como se ha

indicado en el caso del grifo. Si no existe sistema de bombeo, no es posible obtener
una muestra representativa. Con esta salvedad se introducirá en la masa de agua
el frasco de muestreo o un cubo lo más limpio posible, sostenidos con una cuerda
y tomando la muestra tras haber agitado la superficie del agua con el mismo
recipiente. También podrán utilizarse aparatos especiales lastrados que permiten
introducir el frasco esterilizado y destaparlo a la profundidad deseada. En estos
casos deberán utilizarse frascos con tapón a presión.

En ríos o cursos de agua: será preciso considerar diversos factores, tales como:
profundidad, caudal, distancia a la orilla, entre otros. La muestra se tomará lo más
lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando los remansos o
zonas de estancamiento. Para tomar una muestra del agua de un lago o de un río
se sujetará el frasco por el fondo en posición invertida, sumergiéndolo
completamente y dándole la vuelta en sentido contrario a la corriente (río) o
desplazándolo horizontalmente en la dirección de la boca del frasco (lago).

Aguas tratadas o potables (acueducto o aguas envasadas): si son envasadas

deben llevarse al laboratorio en el empaque o envase original. Si es potable proceda
a desinfectar como en el agua de grifo pero al frasco debe adicionarse Tiosulfato de
sodio al 10% de 0.02 a 0.05 ml por cada 100ml de muestra a recolectar. Con la
finalidad de neutralizar el cloro residual que inhibiría el desarrollo de los
microorganismos presentes.

IMPLEMENTOS

 Traer una muestra de agua de rio (Pamplonita o El Zulia) dependiendo de la

organización dado a los grupos de trabajo.
 Equipo de filtración por membrana
 Cajas pequeñas con Agar Chromocult
 Tubos con 10ml de caldo Lauryl sulfato y campana durham
 Tubos con 10 ml de caldo bilis verde brillante con campana durham (BRILLA)
 Agar Estándar Plate Count
 Agar Sabouraud
 Cajas de Petri para siembra por profundidad
 Tubos tapa rosca con 9ml de Agua peptona
 Frasco con 90 ml de Agua peptona
 Incubadora
25

TECNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

La filtración por membrana es un proceso físico que trabaja con una bomba de
vacío en el que las sustancias se separan mediante membranas de celulosa con
una porosidad de 0.45 µm, reteniendo la gran mayoría de los microorganismos de
un tamaño superior a la porosidad de los filtros. Luego, los filtros se retiran con pinza
esteril y se colocan sobre la superficie de Cajas de Petri de tamaño pequeño con
Agar Chromucult (para Coliformes y Escherichia coli) o cualquier otro agar
dependiendo del analito o indicador microbiológico que se desee recuperar como
Agar Estándar Plate Count para Aerobios Mesófilos o agar Cetrimide para
Pseudomonas aeruginosa, entre otros.

Luego debe incubar a temperatura apropiada dependiendo del analito que indague
o busque. En este caso, 37°C/24 o 48 horas, para Coliformes y E. coli.

Observe las colonias rojas que representan al grupo indicador denominado

Coliformes (los cuales son géneros de la Familia Enterobacteriaceae que se
caracterizan por fermentar fuertemente la lactosa por la acción de las enzimas B-
galactosidasa y B- galactosido permeasa como (Edwarsiella sp, Klebsiella sp,
Escherichia sp, entre otros) o fermentación débil por la acción de la enzima B-
galactosidasa y deficientes o ausente presencia de la enzima B- galactosido
permeasa como (Citrobacter sp, Enterobacter sp, Hafnia sp, Pantoae sp, entre
otras). Bacterias que actúan sobre el compuesto cromógeno presente llamado XGal
en el medio y les permite generar esa característica típica de colonias rojas.

Pero las células de Escherichia coli, además de las enzimas B-galactosidasa y B-

galactosido permeasa (colonias rojas), poseen la enzima B- Glucoronidasa que
actúa sobre el compuesto cromógeno presente en el medio llamado X Glu y
producen colonias azules que al mezclarse con el rojo típico de una coliforme,
combina y da la formación de colonias azul violeta que se consideran Escherichia
coli.

Tomado de:
www.google.com.co/search?q=filtración+
por+membrana+colonias+típicas+agar+chr
omocult&hl=es-
419&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved
=0ahUKEwjxl5XN4KbeAhWLvlMKHZR
7AGwQ_AUIDigB&biw=1024&bih=657#
imgrc=b5I72SNFnmHobM:
26

TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE PARA COLIFORMES Y E. coli

Realice diluciones seriadas del agua a analizar, siguiendo indicaciones dadas en

clase.

1. Prueba presuntiva de Coliformes: De las diluciones 10 -1 , 10 -2 , 10 -3.

Siembre 1 ml por triplicado de cada dilución en tubos que contienen 10 ml
de Caldo Lauryl sulfato con campana durham. Incube a 37°C/24- 48 horas.
Revise turbidez del caldo y gas atrapado en cada uno de los tubos.
2. Prueba confirmativa para Coliformes: de aquellos tubos con respuesta
positiva inocule una asada a tubos con caldo bilis verde brillante con
campana durham, uno por cada tubo positivo. Incube a 37°C/24- 48 horas.
Revise turbidez del caldo y gas atrapado en cada uno de los tubos. Registre
cuántos tubos le dieron positivo y busque en la Tabla de Número Más
Probable. Determine NMP de Coliformes.

Ejemplo: Dilución 10 -1 = 3 tubos positivos, 10 -2 = 2 tubos positivos, 10 -3 = 2 tubos

positivos.

Busque en la tabla de NMP: 3 – 2 - 1 = 150 bacterias/ml de Coliformes

3. Prueba confirmativa para Escherichia coli: de los tubos positivos para

Coliformes, repique una asada a : Caldo Bilis verde brillante, Caldo triptófano
y cajas de agar Eosina Azul de Metileno (EMB). Incube los dos primeros a
44+/- 0.05°C/24 o 48 horas y las cajas a 37°C/24 o 48 horas. Registre
resultados positivos si: hay presencia de gas y turbidez en los caldos Brilla,
Indol en el caldo triptófano después de revelar con reactivo de Kovac’s y
crecimiento típico de un microorganismo fermentador de lactosa y sacarosa
en agar EMB, es decir colonias con precipitado negro y colonias de color
purpura con o sin formación de brillo metálico por la gran producción de ácido
que precipita la eosina y el azul de metileno que actúan en este medio como
inhibidores e indicadores de pH.

4. Registre cuántos tubos y cajas de cada dilución le dieron positivo y busque

en la Tabla de Número Más Probable. Determine NMP de Escherichia coli.

Ejemplo: Dilución 10 -1 = 2 tubos positivos, 10 -2 = 1 tubos positivos, 10 -3 = 0 tubos

positivos.

Busque en la tabla de NMP: 2 – 1 - 0 = 15 bacterias/ml de Escherichia coli.

27

Nota: tenga en cuenta que las muestras de agua pueden tener igual o menor
número de E. coli con relación a los Coliformes pero nunca puede haber mayor
presencia de estos.

Si las diluciones son diferentes a las anteriormente explicadas, aplique la siguiente

fórmula:

NMP = Dato de la tabla por el inverso de la dilución intermedia/ 100

Ejemplo: Dilución 10 -2 = 2 tubos positivos, 10 -3 = 1 tubos positivos, 10 -4 = 0 tubos

positivos.

Busque en la tabla de NMP: 2 – 1 - 0 = 15 bacterias

NMP= 15 bacterias x 10 3 /100= 150 bacterias/ml

5. Recuento en placa para Aerobios Mesófilos y Mohos y levaduras:

Realice siembra por placa profunda de las diluciones indicadas por duplicado en
cajas de Petri estériles, para luego adicionar el Agar Sabouraud para recuento de
hongos que se incuban a 30°C/3 a 5 días y Agar Estándar Plate Count para recuento
de Aerobios Mesófilos. Cuente todo lo que crezca y tenga en cuenta normas para
el recuento microbiológico en cada caso.

Registre en tabla de resultados para todos los análisis realizados como Coliformes,
E. coli, Aerobios Mesófilos y Hongos.

Discuta teniendo en cuenta normatividad microbiológica, revise Resolución 2115 del

22 de junio de 2007, para que determine que parámetros le exige la norma para el
cumplimiento de la calidad del agua para consumo.

Tenga en cuenta que se analizó una muestra de agua cruda con la finalidad de
que pudieran observar todos los posibles indicadores de calidad en el agua.
28

Brilla Positivos y negativos.

Tomado de:
ttps://www.google.com.co/search
?q=caldo+bilis+verde+brillante&s
a=X&hl=es-
419&biw=1024&bih=657&tb

Brilla y Caldo Lauryl positivos y negativos. Tomado

de:
ttps://www.google.com.co/search?q=caldo+bilis+v
erde+brillante&sa=X&hl=es-
419&biw=1024&bih=657&tb

CUESTIONARIO

1. Indague sobre la normatividad para el agua potable. Resolución 2115/2007

2. Consulte sobre los fundamentos de los diferentes medios de cultivos
utilizados en la práctica y fundamentos de las técnicas de identificación.
3. Consulte sobre cada analíto o indicador de calidad microbiológica para el
agua.

BIBLIOGRAFIA
Instituto Colombiano de Vigilancia de alimentos y medicamentos. (INVIMA). Agua
potable para consumo humano. Consultado en:
https://www.invima.gov.co/procesos/archivos/procesos_eliminados/Capacitacion_y
_asistencia/2008/formatos/PM06-CAT-DI22.pdf
29