PRACTICA Nº 10 ENTEROBACTERIAS

TOMA DE MUESTRA, SIEMBRA E IDENTIFICACION

ENTEROBACTERIAS
Objetivo. -
Desarrollar las técnicas de aislamiento e identificación de enterobacterias, comprendiendo el
significado de las pruebas bioquímicas.

INTRODUCCION
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos
que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo oxidasa negativos; reducen los nitratos a
nitritos. Cuando son móviles son flagelados peritricos. Son llamadas enterobacterias porque con
frecuencia residen en el aparato digestivo de animales y humanos, pero algunas especies también
viven en la tierra y en el agua. Incluye los géneros Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella,
Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia,
Erwinia y Pantoea. La mayoría forman parte de la flora normal o son bacterias ambientales, a
excepción de los géneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son causantes de infecciones
gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces, es muy probable que estén
causando daño.

Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen enfermedades
como neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia, infecciones neonatales, infecciones de
heridas y de cirugías. Se comportan como patógenos oportunistas sobre todo en pacientes
inmunocomprometidos.

A semejanza de las enterobacterias, los géneros Campylobacter y Helicobacter causan

enfermedades gastrointestinales. Campylobacter es un bacilo curvo gramnegativo, microaerofílico,
con un solo flagelo polar. Causa enteritis aguda.

Helicobacter es un bacilo un poco curvo, microaerofílico, con flagelos polares múltiples. Requiere
medios específicos para cultivarse. Causa gastritis crónicas y úlceras gástricas y duodenales.

MATERIALES Y METODOS.

I. Aislamiento en medios selectivos:

- A partir de una cepa pura siembre por estría cruzada placas de SS, EMB o Mac Conkey y
agar-verde-brillante, descargando la muestra con el asa en un extremo de la caja y
extendiendo después. Incube 24 hs a 37o C.
- En agar-verde brillante todas las salmonellas, excepto S. typhi, forman colonias rojas o
rosas a las 48 hs de incubación.
- El Proteus mirabilis forma colonias amarillas o amarillo -verdosas con un halo amarillo
verdoso. E. coli no crece.
- En EMB E. coli forma colonias negruzcas o moradas, usualmente con brillo verde metálico.
Las shigellas producen colonias sin color
- En SS el Enterobacter forma colonias rojas o rosas a las 24 hs. Salmonella forma colonias
sin color con centro negro. E. coli crece poco.
-
1. Haga un Gram de las colonias obtenidas y compruebe que son de bacterias gramnegativas.

II. Pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias:

Elija las colonias de enterobacterias a partir del desarrollo en las placas de medio selectivo
sembradas con la cepa. Cada tipo diferente de colonia deberá sembrarse en todos los medios para
pruebas bioquímicas.
A. Medio Triple de azúcar Agar TSI (fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa) en tubo
inclinado (medio de color naranja):
1. Con un asa recta sin anillo, se toma una colonia bien aislada y se siembra por estría en la
superficie de agar del tubo
2. Luego se punza en profundidad o por picadura en el centro del tubo, sin tocar el fondo, cuidando
que no le tiemble la mano. Incube 24 hs a 37o C.
Al cabo de este término, la fermentación de la glucosa ocurre en anaerobiosis hasta ácido, lo cual
se manifiesta por un cambio de color del indicador de pH en el medio, de rojo a amarillo en el fondo
del tubo. La degradación de la lactosa o sacarosa en aerobiosis es indicada por un color amarillo
en la superficie del agar.

B. Medio de SIM en tubo (color beige):

A partir de una colonia siembre un tubo por picadura en el centro, sin tocar el fondo, cuidando que
no le tiemble la mano e incube 24 hs a 37o C.
- La producción de sulfuros toma lugar a partir r de aminoácidos con azufre y es indicada por la
aparición de un color negro
- La movilidad positiva es demostrada al crecer la bacteria homogéneamente en todo el medio,
observándose una turbidez
- La producción del metabolito indol es indicada por un anillo de color rojo que se forma
después de adicionar unas 2 o 3 gotas del reactivo de Kovacs.

C. Medio MIO en tubo (color café):

Siembre una colonia por picadura en el centro e incube igual. El indicador de pH en el medio
cambia de color, de café a color violeta al alcalinizarse, lo que indica la descarboxilación de la
ornitina por la enzima ornitína descarboxilasa

D. Citrato como única fuente de carbono (color verde) en tubo inclinado: Siembre una colonia
por estría en la superficie del agar e incube igual. El crecimiento y el cambio de color del indicador
de pH a azul en condiciones alcalinas, indica la utilización del citrato positiva.

E. Urea (color beige) en tubo inclinado. Se siembra por estría y se incuba igual. La aparición de un
color fucsia(rosa mexicano) en el medio, indica la acción de la ureasa y alcalinización del medio. El
indicador de pH se torna rosa en condiciones alcalinas.

F. Lisina Iron Agar (LIA) Se siembra por estría en la superficie y por picadura Alcalino toma color
violeta, acido, color amarillo. Se utiliza para conocer la acción de la Lisina descarboxilasa

G Fenil alanina Se siembra en la superficie y por picadura, se agrega después de la incubación

cloruro férrico, interpretándose como positivo si da una coloración verdosa. O desanimación de la
fenil alanina

H. Voges proskawer Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo

de fermentar la glucosa con producción de acido por la vía acido-mixta o con producción de
acetoína por la via butanodiólica.

Haga una tabla de resultados y compare con los datos de la literatura. La identificación de las
bacterias encontradas puede efectuarse hasta género o hasta especie, según el número de datos.
Una vez identificada la bacteria, investigue las enfermedades que ocasiona.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS:
1ra parte:

1. Hacer el estudio macroscópico de la muestra según corresponda.

2. Hacer el estudio microscópico de las mismas.
3. Fijar muestras y hacer la coloración de Gram.
4. Según el resultado del examen microscópico y la coloración de Gram proponer en que
medios de cultivo se puede sembrar.
5. hacer la siembra en los medios elegidos

2da parte
1. reconocimiento de las colonias en los medios sembrados.
2. Resiembra en medios para el reconocimiento de la bacteria (TSI, LIA, UREA, CITRATO,
SIM)
3. Identificación de las Entero bacterias haciendo uso de su tabla de reacciones bioquímicas.

DESARROLLO 1ra Parte.

MUESTRAS:
1. Orina
2. Heces

1. Muestra de Orina
Materiales:
- Laminas portaobjetos
- Laminilla cubreobjetos
- Muestra
- Tubo de ensayo
- Centrifuga
- Set de coloración de Gram.
- Microscopio

Procedimiento:
1. Se coloca en un tubo de ensayo una muestra de orina
2. Centrifuga por 3 minutos a 1000 rpm.
3. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el sedimento y se coloca una gota en una lamina
portaobjetos y se coloca una laminilla cubreobjetos para hacer un examen directo y en otra lamina
para hacer la coloración de Gram.
4. valorar los siguientes parámetros:

A) En el examen directo:
Examen macroscópico:
- Color:
- Aspecto:
- Nitritos:
- Esterasa leucocitaria:

Examen microscópico
- Leucocitos:
- Hematíes:
- Células epiteliales:
- Gérmenes:

B) Coloración de Gram.:
- Leucocitos:
- Gérmenes:

2. Muestra de Heces

Materiales:
- Laminas portaobjetos
- Laminilla cubreobjetos
- Muestra
- Mondadientes
- Set de coloración de Gram.
- Microscopio

Procedimiento:
1. colocamos una gota de suero fisiológico en dos laminas portaobjetos.
2. Con ayuda de un mondadientes sacamos una pequeña muestra de Heces y se coloca sobre
cada una de las gotas de SF y se hace una suspensión homogénea una lámina portaobjetos para
observar en el microscopio (examen directo) y la otra para hacer la coloración de Gram.
3. Valorar los siguientes parámetros:
A) En el examen directo:
Examen macroscópico
- Color : ………………………………………………………………………………….
- Consistencia : ………………………………………………………………………………….
- Moco : ………………………………………………………………………………….
- Sangre : ………………………………………………………………………………….

Examen microscópico
- Leucocitos : ………………………………………………………………………………….
- Hematíes : ………………………………………………………………………………….
- Gérmenes : ………………………………………………………………………………….

DESARROLLO 2da Parte

Materiales:
- Muestra
- Asa de siembra
- Mechero
- Medio de cultivo (Mc conkey)

Procedimiento:
1. En una placa de Agar Mc conkey dividirla y rotular con el número de muestra a cultivar.
2. Con ayuda del asa de siembra esterilizarla al mechero, y tomar la muestra (Sec. Vaginal, orina o
heces) y proceder a su cultivo en medio de Mc conkey.
3. LLevarla a la incubadora a 37ºC por 24 Hrs.
4. Hacer la lectura del crecimiento bacteriano en la placa de Mc conkey.
5. Si hay crecimiento identificar las colonias y proceder a su repique en los medios
correspondientes para poder identificar bioquímicamente a las colonias.

Agar TSI (Agar hierro Triple azúcar) medio empleado para ver la fermentación de hidratos de
carbono (lactosa, glucosa además tiene sulfuro ferroso para ver la producción de sulfuro de
hidrogeno)
Para su inoculación se hace una punción en el medio con un asa recta y luego se estría en la
superficie.
Interpretación:
- K/K no fermentación de los azucares. (Característico de las bacterias no fermentadores como la
Pseudomona)
- K/A fermentación de glucosa mas no de la lactosa y sacarosa, (característico de bacterias no
fermentadoras de lactosa como la Shigella.)
- A/A fermentación de los azucares glucosa y sacarosa, (característico de coniformes que
fermentan lactosa como Escherichia coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.
- la producción de gas se ve por el resquebrajamiento del medio o separación del fondo.
- La producción de sulfuro de hidrogeno se evidencia por el ennegrecimiento del medio.

Agar LIA (prueba de la lisina) se utiliza este medio para ver la utilización del aminoácido lisina.
Se inocula por punción triple en el medio y se estría en la superficie
Interpretación:
a) la intensificación del color azul- púrpura (morado) del medio es indicativo de una prueba positiva
debido a la liberación de aminas por la reacción de descarboxilación de aminoácido lisina a
cadaverina.
b) si el medio vira a amarillo es indicador que la bacteria es viable por el consumo de la glucosa,
pero no produce la descarboxilación de aminoácido lisina.

Agar Citrato: Esta prueba mide la utilización del citrato como fuente de carbono por las bacterias y
puede identificarse por el viraje del color del medio de verde a azul.
Se cultiva por punción en el medio y estría en la superficie
Interpretación:
Positivo. si vira el medio de verde a azul.
Negativo: si hay crecimiento bacteriano y este no cambia de color.

Agar Urea: Mide la capacidad de descomponer la urea por la enzima ureasa.

Se estría en la superficie
Interpretación:
Positivo: si el medio vira a rosado intenso
Negativo: si no cambia de color.

Agar SIM: este medio de cultivo permite comprobar la formación de sulfuro de hidrogeno, la
producción de indol y observar la movilidad de las bacterias.
Se cultiva por una puntura con asa recta en el medio.
Interpretación:
- Formación de sulfuro: por ennegrecimiento del medio
- Producción de indol si vira el reactivo de KOVACS de amarillo a rojo. Formación de un
anillo.
- Si el medio se enturbia la bacteria es móvil.