UNIVERSIDAD LIBRE
Pereira - Barranquilla - Socorro
IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA
Y MOLECULAR DE LEVADURAS DEL GÉNERO
SACCHAROMYCES PARA LA ELABORACIÓN DE CERVEZA.
Arias Ochoa Andrés, Barrios Rodríguez Alexis, Simonsen Cavanzo Emilio,
Tejeda Santamaría Sebastián.1
Resumen
Se busco reconocer pautas clave al mo-
mento de identificar morfológica, fisiológi-
ca y molecularmente levaduras del género
Saccharomyces para la elaboración de
cerveza mediante la búsqueda bibliográ-
fica en bases de datos (FEMS: Yeast re-
search, PMC-NCBI y Google académico).
La cerveza es una bebida alcohólica no
destilada, espumosa, resultante de un pro-
ceso de fermentación usando levaduras.
Las levaduras como organismos micros-
cópicos unicelulares son pertenecientes al
dominio Eukarya y están clasificadas den-
tro del reino Fungi. El conocimiento de las
levaduras es importante en la industria de
los alimentos por la capacidad que poseen
de convertir carbohidratos en etanol y
CO2 mediante el proceso de fermentación
alcohólica. Las levaduras pueden identifi-
carse de forma morfológica, fisiológica y
molecular por medio de técnicas de PCR,
ARN de bajo peso molecular (LMW-RNA),
análisis de microsatélites, Polimorfismo de
longitud en los fragmentos de restricción
del ADNr/ARNr(RFLP).
Palabras Clave
Saccharomyces, Fermentación alcohólica,
Cerveza Ale, Cerveza Lager.
1 Estudiantes programa de Microbiología. Universidad Libre Barranquilla.
andresf0512@hotmail.com,
albarcok11@hotmail.com,
eesimonsen@hotmail.com,
sebastiantejeda95@gmail.com
Abstract
We sought to recognize key patterns to
identifying morphologically, physiologically
and molecularly yeasts of the genus Sac-
charomyces through bibliographic search
in databases (FEMS: Yeast research,
PMC-NCBI and Google academic). Beer
is a non-distilled, frothy alcoholic beverage
resulting from a fermentation process using
yeasts. Yeasts are unicellular microscopic
organisms belong to the Eukarya domain
and there are classified within the Fungi
kingdom. The knowledge of yeasts is im-
portant in the food industry because of the
ability to convert carbohydrates into etha-
nol and CO2 through the process of alco-
holic fermentation. Yeasts can be morpho-
logically, physiologically and molecularly
identified by PCR techniques, low molecu-
lar weight RNA (LMW-RNA), microsatellite
analysis, Length polymorphism in the res-
triction fragments of rDNA / rRNA (RFLP).
Key Words
Saccharomyces, Alcoholic Fermentation,
Ale Beer, Lager Beer.
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 MENTE JOVEN
Introducción
La cerveza es una bebida alcohólica no
destilada, espumosa, resultante de un pro-
ceso de fermentación usando levaduras.
Se obtiene a partir de mostos de malta de
cebada, la cual puede estar acompañada
de otros cereales amiláceos y cuyo aro-
ma se obtiene de las flores de lúpulo(1,2).
Entre las bebidas más antiguas del mun-
do encontramos la cerveza. Su historia se
remonta entre 5.000 a 8.000 años atrás,
pero no se sabe con seguridad quienes
fueron los pioneros en producirla. Sin em-
bargo, existen registros que muestran que
los sumerios, procedentes de Sudan, del
área de Mesopotamia, elaboraban una be-
bida alcohólica llamada Sikariu, esta era
elaborada a partir de pan y agua.
Hace 4.000 años atrás en China se produ-
jo una cerveza llamada Kiu, hecha a base
de mijo, arroz, trigo y cebada, indicando
así que las civilizaciones mesopotámicas
no fueron las únicas en descubrir la “fór-
mula” de la cerveza. El Duque Guillermo
IV de Baviera decretó en el año 1516 una
ley en la cual se definieron los ingredien-
tes de la cerveza: malta de cebada, agua
y lúpulo, de aquí en adelante los últimos
detalles definitivos fueron dados por el
mercantilismo, la revolución industrial, el
capitalismo y la globalización. Desde la
primera vez que se hizo cerveza se han
desarrollado múltiples estilos determina-
dos por su sabor y por las características
propias del país de donde fueron elabora-
das (1,3,4).
De acuerdo con la forma cómo se compor-
ta la levadura en la fermentación, la cer-
veza puede ser clasificada en dos tipos:
Ale y Lager. Las cervezas de tipo Ale (fer-
mentación alta) tienen la característica de
fermentar a temperaturas cercanas a los
20°C, y forman una densa capa de levadu-
ras en la superficie del fermentador. En las
56 cervezas tipo Lager (fermentación baja)
las levaduras se encuentran en el fondo
del fermentador, y se caracterizan por rea-
lizar este proceso a temperaturas bajas (5,
6).
Se define a las levaduras como organis-
mos microscópicos unicelulares pertene-
cientes al dominio Eukarya y están clasifi-
cadas dentro del reino Fungi. Su reproduc-
ción puede presentarse sexual (por espo-
ras) y asexual (gemación). Son muy cono-
cidas por su gran capacidad de convertir
carbohidratos en etanol y CO2 mediante el
proceso de fermentación alcohólica el cual
es un proceso de mucha importancia en la
industria de los alimentos (7).
La fermentación alcohólica para la elabo-
ración de cerveza se presenta mediante
el uso de levaduras del género Saccha-
romyces (29). El género Saccharomyces
se encuentra clasificado en el phylum As-
comycota, clase Hemiascomycetes, orden
Saccharomycetales y la familia Saccha-
romycetaceae, dividida en 12 clados(8,9).
Hasta entonces se han descrito 10 espe-
cies dentro del género Saccharomyces: S.
cerevisiae, S. eubayanus, S. arboricolus,
S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae,
S. paradoxus, S. pastorianus, S. bayanus
y S. uvarum (38). Otros autores denomi-
nan a S. uvarum como S. bayanus varie-
dad uvarum y a S. bayanus como S. ba-
yanus variedad bayanus ya que estas son
variaciones de un mismo taxón (35,36, 37,
39).
Goddard Matthew, Greig Duncan(45) men-
cionan a S. cerevisiae como una levadura
nómada que tiene la capacidad de poder
vivir y crecer en una gran variedad de am-
bientes y condiciones. Se ha demostrado
las variaciones que existe entre las cepas
salvajes de S. cerevisiae y su distribución
alrededor del mundo (46,47,48,49). Entre
las características importantes podemos
encontrar la tolerancia al etanol, creci-
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miento a pH bajo, producción de enzimas, rencias (14, 15, 16)

etc.(29, 51) y las características organo- Microscópicamente Saccharomyces se
lépticas como el sabor y el aroma(50) se observa en racimos laxos formados por
pueden obtener de cepas salvajes de S. levaduras grandes, con forma ovalada y
cerevisiae (49, 52). cuando son cultivados en agar harina de
maíz pueden presentar brotes (12). Gene-
Identificación Morfológica ralmente podemos observar a S. cerevi-
La identificación morfológica de las leva- siae de forma ovalada, cilíndrica o elíptica.
duras del género Saccharomyces es reali- Su tamaño se encuentra entre 2-7 micras
zada por medio de la observación macros- de largo dependiendo la edad de la célu-
cópica y microscópica de estos microor- la, estando aislada o en colonias (15). La
ganismos. Estas características pueden presencia de estructuras de reproducción
cambiar de acuerdo con el medio en el sexual como ascosporas en medios de
que haya crecido el microorganismo. cultivos que contengan acetato de potasio,
extracto de levadura, glucosa y agua, con-
La textura y elevación de las colonias son firman la identificación microscópica de le-
las principales características en las que vaduras de género Saccharomyces (12).
se basa la identificación macroscópica, en
la cual que se pueden observar colonias La levadura Saccharomyces uvarum mi-
planas, lisas, cremosas o húmedas(10). croscópicamente produce un pseudomi-
En el caso de S. cerevisiae el color varía celio. Según Giusiano, un pseudomicelio
dependiendo del medio de cultivo en el se define como el alargamiento de la cé-
que se encuentre la levadura, pudiéndose lula con puntos de constricción entre las
encontrar colonias de color blanco, crema, mismas y producción secuencial de gema-
verde pálido o azul verdosas, con forma ciones manteniéndose unidas sin separar-
plana y textura húmeda o cremosa (tabla se(16). S. bayanus se puede apreciar mi-
1)(11). croscópicamente de forma globosa, ovoi-
dal o elipsoide y/o alargada, no produce
TABLA 1. Características morfológicas pseudohifas, presentando una longitud de
del género Saccharomyces (2,2-6,0) x (3,5-10,5) micras y macroscópi-
camente forma colonias lisas (13,14).
Medio de Características Características
cultivo microscópicas macroscópicas Identificación Fisiológica
Las levaduras del género Saccharomyces
Colonias color
Globosas, crema, lisas, están caracterizadas por su crecimiento
Agar
malta 5%
ovoidales o se generalmente en ambientes con anaerobiosis, presen-
alargan planas, algunas tando un crecimiento lento, la fuente de
veces levantada
energía más utilizada son los azucares,
Blastoconidias principalmente la glucosa, fructosa, saca-
alargadas, Colonias color
Agar globosas o blanco, planas, rosa, manosa(18) y también tienen la ca-
dextrosa elipsoidales húmedas o pacidad de fermentar biopolímeros como
con gemación cremosas la celulosa(17).
multilateral
Colonias de color
Elipsoidales o
WL blanco, lisas y
alargadas
cremosas
Fuente: Tabla adaptada de varias refe- 57
 MENTE JOVEN

TABLA 2. Fermentación y crecimiento de dos especies del género Saccharomyces

Fermentación Crecimiento

Especie

Cychx 10000
Galactosa

Trehalosa
D-Gluctiol
Sacarosa

Rafinosa

Vit-Libre
Glucosa

Maltosa
Lactosa

30°C
37°C

Frc
S. cerevisiae

Variable

Variable

Variable
+

+
+

-
-

-
-
S. pastorianus

Variable
Variable
+

+
-

-
-

-
-

Fuente: Tabla adaptada de varias referencias(14,19)

S. carlsbergensis se caracteriza por cre- para observar fermentación, crecimiento y

cer óptimamente entre los 25-30ºC y pue- asimilación (tabla 2 y 3).
de crecer a una temperatura máxima de
35-47ºC con un pH de 4 a 4,519. La tem-
peratura óptima de crecimiento de S. ce- Identificación Molecular
revisiae está en un rango de 22-30°C pero El uso del género Saccharomyces ha sido
no tiene la capacidad de soportar tempe- de mucha importancia en la industria de
raturas de más de 53°C. El pH para una las bebidas alcohólicas como la cerveza,
actividad fermentativa está entre 4,5 y 6 vinos y destilados. Esto ha conducido al
y si la fermentación es directa el pH es de estudio de las características genéticas
5,2 a 5,7(20). y los perfiles específicos de expresión, y
así, poder entender de una mejor mane-
S. diastaticus se desarrolla a una tempe- ra el proceso biológico de la fermentación
ratura óptima de 25-30°C, se puede alma- a nivel molecular y la expresión de genes
cenar a una temperatura de -80°C y liofili- relacionados a los cambios en las carac-
zar a 2-8°C (42,43). S. pastorianus crece terísticas físicas y químicas del medio de
óptimamente entre 25-30°C (44). Para cultivo (40,41).
la identificación se realizan una serie de
58 pruebas con distintas fuentes de carbono
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TABLA 3. Reacciones de asimilación de dos especies del género Saccharomyces

Molécula / Especie S. cerevisiae S. pastorianus

Glucosa + +
Galactosa Variable +
L-Sorbosa - -
Sacarosa + +
Maltosa + +
Celobiosa - -
Trehalosa + +
Lactosa - -
Melibiosa Variable -
Rafinosa + +
Melesitosa Variable Variable
Inulina - -
Almidón - -
D-Xylosa - -
L-Rabinosa - -
D-Rabinosa - -
D-Ribosa - -
Ramnosa - -
D-Samina - -
N-acetil D-glucosamina - -
Metanol - -
Etanol + +
Glicerol - Variable
Eritritol - -
Ribitol - -
Galactitol - -
D-manitol - -

Fuente: Tabla adaptada de varias referencias (14, 19)

PCR: Es una reacción enzimática in vitro
en la cual se obtienen millones de copias
de una secuencia de ADN durante un nu-
mero de ciclos establecidos. Para obtener
nuevo material genético a partir de una se-
cuencia inicial este proceso utiliza la enzi-
ma ADN polimerasa (21, 22, 23).
Capello M.S, et al. (24) tomaron genes mi-
tocondriales de la subunidad pequeña del
ADNr, citocromo oxidasa II, en un estudio
de caracterización de cepas de S. cerevi-
siae que fueron aisladas a partir de uvas,
con los cebadores d1: 5’-CAA AAT TCA
CCT ATA TTC TCA-3’ y d2: 5’-GTG GAT
TTT TAT TCC A ACA-3’, para determinar
la autenticidad de las levaduras. 59
 MENTE JOVEN
Damas L. y Pereyra B.(25) describen unos
genes que codifican para unas proteínas
conocidas como zimolectínas llamados
flo, estos genes pueden encontrarse de
manera dominante como FLO1 (FLO4),
FLO2, FLO5, FLO8, FLO9, FLO10, FLO11
y Lg-FLO1; y recesivos o semidominantes
como flo3, flo6, flo7, fsu1, fsu2 y fsu3.
ARN de bajo peso molecular (LMW-
RNA): Es un método de identificación
molecular basado en los patrones de elec-
troforesis de ARN de bajo peso molecu-
lar como los genes ARNr 5S, ARNr 5,8S,
ARNt clase 1 y ARNt clase 2. Por medio de
los patrones LMW-rRNA se ha dado la po-
sibilidad de llegar hasta la diferenciación
de género, mientras que por los patrones
de LMW-tRNA ha sido posible diferenciar
hasta el nivel de especie en levaduras de
interés industrial (26).
Análisis de microsatélites: Los micro-
satélites o “secuencias simples repetidas”
(SSRs) son secuencias de ADN confroma-
das por repeticiones de nucleótidos de 1 a
6 pares de bases. Esta técnica basada en
PCR consiste en la amplificación de SSRs
presentes en el DNA26. Estas pueden
presentarse por varias repeticiones de un
solo nucleótido (AAAAAA = A6) se les de-
nomina como puros o perfectos. También
se presentan de dos o más nucleótidos
diferentes los cuales son considerados
como compuestos (AAAATTTT= A4 T4)
(27). Esta técnica se ha usado en la iden-
tificación de especies del género Zygosa-
ccharomyces (26, 28).
Polimorfismo del DNA mitocondrial
(mtDNA): Esta técnica se fundamenta en
las diferencias que pueden encontrarse en
el contenido de G+C entre el ADN nuclear
(nDNA) y el ADN mitocondrial (mtDNA)
(26). Cuando se hace un aislamiento de
DNA total, se usan enzimas de restricción
60 específicas que tengan la capacidad de
poder reconocer regiones ricas en G+C, el
nDNA sufre una digestión lo que permite
generar muchos fragmentos de tamaño
muy pequeño. Estos fragmentos no pue-
den ser detectados en el gel de agarosa
por lo cual solo se logran apreciar los frag-
mentos que corresponden al mtDNA (26,
30). También se usan métodos basados
en el uso del genoma ribosomal.
Polimorfismo de Longitud en los Frag-
mentos de Restricción del NA/ARNr
(RFLP): El polimorfismo es determina-
do por la diferencia entre los organismos
dado el análisis de los patrones de ruptura
que se producen en un lugar específico
del genoma en el momento que es corta-
do por enzimas de restricción. En un gel
de electroforesis se puede observar un
patrón de bandas polimórficas que corres-
ponden a los fragmentos de diferentes ta-
maños, que se originaron con el corte de
cada endonucleasa. La similitud de los
patrones que fueron generados da la ca-
pacidad de determinar correlaciones entre
especies y cepas, junto a la presencia de
patrones únicos que permiten dicha iden-
tificación (31).
La técnica de RFLP ha sido ampliamen-
te utilizada en estudios de identificación
y filogenia de levaduras de interés indus-
trial, en la cual se tomaron las regiones del
ADNr 5,8S y los Espaciadores Transcritos
Internos (Internal Transcribed Spacers)
conocidos por sus siglas en ingles ITS 1 e
ITS 2 (5,8S – ITS)(32,33). La región 5,8S
es codificadora, conservada y muestra una
baja variabilidad intraespecífica haciendo
que la delimitación entre las cepas de una
misma especie no sea permitida. Aun así,
la zona de los ITS, que es una región no
codificadora e hipervariable, a nivel inte-
respecífico, permite el reconocimiento de
la región. Este método se ha utilizado en la
identificación de especies del género Klu-
yveromyces (34).

Conclusiones y Recomendaciones
Los medios de cultivo para el aislamien-
to de levaduras tipo Saccharomyces de-
ben contener glucosa, maltosa o saca-
rosa como fuente de carbono y extracto
de levadura, también es posible agregar
antibióticos para evitar el crecimiento de
bacterias. Algunos de los agares más utili-
zados son el papa dextrosa (PDA), Sabou-
raud dextrosa o agar dextrosa, Sabouraud
maltosa o agar malta, WL.
Para identificar a las levaduras aisladas
se deberá empezar por la observación de
las características macroscópicas y/o mi-
croscópicas seguidas de la confirmación
por pruebas fisiológicas o técnicas mole-
culares. Los métodos moleculares por su
alta especificidad, sensibilidad y rapidez
son recomendables. S. cerevisiae tiene la
gran ventaja de ser un organismo modelo
completamente secuenciado y por lo tanto
es más sencillo encontrar material de re-
ferencia. A nivel molecular la utilización de
sondas y primers basados en secuencias
de los genes de floculación flo1 y flo11, los
cuales codifican para la producción de las
proteínas llamadas zimolectínas, constitu-
yen los más frecuentes marcadores para
la identificación.
Entre las principales características fisio-
lógicas de las levaduras del género Sac-
charomyces utilizadas en la elaboración
de cerveza se encuentran la tolerancia al
etanol, crecimiento a pH bajo, producción
de enzimas, el sabor y el aroma. Morfoló-
gicamente las características macroscópi-
cas son el color, la textura y elevación de
las colonias. Microscópicamente las leva-
duras del género Saccharomyces pueden
observarse como racimos laxos de leva-
duras grandes, ovales y la identificación
es confirmada por la estructura de repro-
ducción sexual como ascosporas.
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