1 11Facultad de Biología

Universidad de la Habana

Informe de Prácticas Laborales I

Estudiante: Hector A. Granela Gutierrez

Carrera: Bioquímica y Biología Molecular
Tutora: Lic. Aneisi Reyes Mogoyo

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

Julio 2017
Introducción

La soya, Glycine max es una planta originaria del Extremo Oriente. Este cultivo
ha sido extendido a diferentes regiones del mundo, desempeñando un papel
importante en el sector económico y alimentario de muchos países, debido a su
alto valor proteico y nutricional.
La planta de soya es atacada por diversas enfermedades que son tratadas con
producidos agroquímicos que pueden causar efectos negativos en la población
y daños serios sobre el equilibrio ecológico en las áreas de cultivo intenso. En
particular, el control efectivo de las malas hierbas, se logra en el cultivo
tradicional de la soya gran escala mediante la aplicación de herbicidas pre-
emergentes y selectivos que incluyen productos que implican altos riesgos de
toxicidad para las personas y el ambiente, y cuyo uso de forma efectiva es
costoso y técnicamente complejo
La introducción a gran escala en la industria de plantas transgénicas de soya
resistentes al herbicida glifosfato ha permitido una alta efectividad en el control
de las malas hierbas y una disminución significativa de los costos y de la carga
ambiental.
El glifosfato (N-fosfometil glicina) es un herbicida sistémico, post-emergente, de
amplio espectro, no selectivo y de menor impacto ambiental, ya que presenta
baja toxicidad para organismos no blancos, debido a que la ruta biosintética de
aminoácidos aromáticos no está presente en mamíferos, aves ni en especies
acuáticas. El glisfosfato actúa como inhibidor competitivo de la enzima 5-
enolpiruvylshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS)
Las plantas transgénicas de soya resistentes al herbicida glifosfato han sido
creadas mediante la introducción del gen que codifica para la enzima EPSPS
aislado de la cepa CP4 de una bacteria común del suela, Agrobacterium
tumefaciens. La proteína CP4EPSPS expresada en los eventos genéticamente
modificados aprobados es funcionalmente equivalentes las enzimas EPSPS
endógenas de la planta, a excepción de su afinidad reducida con la molécula
de glifosfato.
El proyecto de Biotecnología de la Soya del Centro de Ingeniería genética y
Biotecnología (CIGB) ha creado plantas transgénicas para su introducción en la
agricultura en Cuba. Para esto es preciso realizar una caracterización
molecular de estos eventos transgénico y evaluar su actividad, proceso en el
cual trabajamos durante este período de Prácticas Laborales 1.
Medidas de Bioseguridad para el trabajo en el laboratorio
Requerimientos para el trabajo en el laboratorio:
-No ingerir o guardar cualquier tipo de alimento en el local del laboratorio, sobre todo
en los refrigeradores donde se guardan muestras infecciosas, cultivos de
microorganismos, agentes químicos o soluciones
-No fumar
-No aplicar cosméticos
-No llevarse objetos a la boca
-Uso de guantes para manipular muestras o material infeccioso
-Al finalizar cualquier tipo de actividad, lavarse bien las manos así como el lavado
frecuente de las mismas durante su estancia en el laboratorio
-Utilizar siempre las prendas de vestir apropiadas para el trabajo que va a realizar
(batas, uniformes, gorros, nasobuco, guantes, etc)
-No extraer el vestuario del laboratorio sin antes descontaminarlo
-El uso de equipos de protección facial cuando el trabajo lo requiera(caretas, respirador,
gafas protectoras, etc).En este caso si es hombre debe estar rasurado para que esta quede
bien ajustada.

Durante el trabajo en el laboratorio:

-Desinfectar el puesto de trabajo antes de comenzar.
-Mantener el laboratorio limpio y aseado retirando del mismo cualquier material que no
tenga relación con el trabajo
-No se permitirán niños en las zonas de trabajos del laboratorio
-Evitar salpicaduras del asa de inoculación al introducirla caliente en un cultivo
-Estriar placas bien tiradas, las malas desecharlas
-No dejar caer gotas o derramar líquidos en superficies sólidas, (en caso de que suceda
poner papel de filtro , gasa, algodón o algo húmedo con desinfectante)
-Manipular con cuidado el tejido que se ha agitado o líquidos contaminados durante su
transportación .Esperar, antes de destaparlos para usaros, unos 15-20 min en
dependencia del volumen del mismo

Después de terminar el trabajo en el laboratorio:

-Descontaminar los materiales y el puesto de trabajo
-No dejar los materiales en sitios inapropiados
-No dejar materiales de un día para otro o durante mucho tiempo
-Desconectar los equipos
-Lavarse las manos o bañarse según el tipo de trabajo realizado
-Cambiarse de ropa y en determinados casos descontaminarla antes de enviarla a la
lavandería
-Apagar las luces

El laboratorio donde estuvimos trabajando durante este período de prácticas, cumple

con las normas de seguridad requeridas, así como el requerimiento para el trabajo en el
laboratorio.
Materiales y métodos
 Transformación de Echerichia coli con el plásmido
pCDEFEPSPS y posterior purificación.

Transformacion de E. coli
1- Poner células competentes en hielo hasta que se descongelen (10-20 min)
2- Añadir 1ng/μL de plásmido en 125μL de células
3- Incubar 30 min en hielo
4- Incubar 2 min en baño a 42 ºC
5- Incubar 2 min en hielo Añadir 1mL de LB
6- Incubar 1h en rolex a 3-4rpm a 37ºC
7- Plaquear en LB sólido más antibióticos
8- Incubar a 37 ºC

Purificación de plásmidos Minialcalino RNAsa

1- Inocular colonias en 5mL de LBA con antibióticos
2- Pelletear en centrífuga (Eppendorf,EUA) las células a 8000 rpm por 5 min.
3- Desechar sobrenadante y añadir 250μL de solución P1
4- Resuspender bien el pellet mediante vórtex (IKA)
5- Añadir 250 μL de solución P2 y mezclar gentilmente por inversión alrededor de
5 veces
6- Inocular a temperatura ambiente por 5 minutos
7- Añadir 350μL de solución P3 fría y mezclar gentilmente de 1-3 vecess
inmediatamente centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos
8- Tomar 750μL del sobrenadante y añadir igual volumen de isopropanol frío (-20º
C) (Spectrum Quimical, EUA)
9- Invertir varias veces y centrifugar a 10000rpm por 10 minutos
10- Desechar sobrenadante y al pellet añadir 500 μL de etanol al 80% (Qiagen,
Alemania). Reinvertir varias veces y centrifugar a 10000 rpm durante 15
minutos
11- Secar al vacío y añadir 20-50 μL de H2O miQ y resuspender con vórtex.

Buffer P1 (Buffer de resuspensión) 2-8 ºC

50mM Tris-Cl pH 8.0 (Sigma-Aldrich, Alemania)
10mM EDTA (Spectrum Quimical, EUA)
100 μg/ mL RNAsa A (Panreac Quim SA, España)

Buffer P2 (Buffer de lisis) 15-25 ºC

200mM NaOH (Spectrum Quimical, EUA)
1% SDS (w/v) (Emsure, EUA)

Buffer P3 (Buffer de neutralización) 2-8 ºC

3.0M Acetato de potasio pH 5.5 (Spectrum Quimical, EUA)

Una vez alcanzado este punto se procede a comprobar la correcta inserción del
plásmido pCDEFEPSPS en las células de E. coli. Para ello, primeramente se
procede a estimar la concentración de DNA plasmídico purificado para
entonces digerirlo con las enzimas de restricción EcoR1 y BanH1 que para este
plásmido cortarían el casete Defepsps demostrándose así la presencia de
dicho plásmido en el DNA purificado.

Estimación de la concentración de DNA plásmido

Preparación del buffer TBE 1X

400mlde TBE 10X. (Spectrum Quimical, EUA)
Añadir 4L de agua destilada.
Agitar
Confección del Gel de Agarosa
100 mL de TBE 1X (Spectrum Quimical, EUA)
0.8g de agarosa estándar (Panreac, EUA)
Agitar y calentar hasta disolver totalmente.

Para la aplicación de la muestra en el gel utilizar colorantes para la corrida

electroforética anaranjado de metilo (menor que 500 pares de bases) y
bromotimol azul (para mayores de 500pb), utilización del marcador de peso
molecular de 1Kb. Ver Figura 1
Realizar diluciones, se aplican al gel y se toma como acuerdo por el
investigador que aquella banda que casi no se observe es de 1ng por lo que se
determina la concentración 1x dilución g/L. Al terminarse la corrida se
observaron bandas bien definidas en las diluciones de 1/100 por tanto
estimamos que la concentración del plásmido es de 200η/mL. Una vez
obtenido este dato se procede a la digestión.

Digestión con enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son
enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del ADN a partir de una secuencia
que reconocen. Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde
actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético
extraño que entre en la célula. 
Se realizan en el laboratorio digestiones en 15 μL donde se adiciona 1,5 μL de
buffer específicos para cada enzima, en este caso como estamos en presencia
de una digestión simple utilizaremos buffer H para EcoR1 (Panreac, España) y
buffer E para BanH1 (Panreac, España), DNA en dependencia de la
concentración a que se encuentra, y las enzimas de restricción con una
cantidad menor del 10% del volumen total, y H 2O miQ completando el volumen
de la digestión. Se corren estas digestiones en gel de agarosa al 0.8%.

Resultados experimentales y discusión

La obtención de dos bandas, una de 1.9Kb y otra de 9.5Kb en la digestión con

EcoR1 y una banda con dos fragmentos de 1.4Kb y otra con 8.6Kb en la
digestión con BanH1 evidenció la presencia del plásmido pCDEFEPSPS en el
DNA purificado, demostrándose además la correcta inserción del casete
Defepsps Ver figura 2
Luego de esto se procede a la transformación de Agrobacterium tumefaciens.
Para luego purificar el plásmido de este y transformar nuevamente en E.coli,
puesto el rendimiento de la purificación de Agrobacterium es muy bajo, para
verificar la transformación de A. tumefaciens.

Transformacion de A. tumefaciens
1- Descongelar las células compatibles en hielo 200μL
2- Adicionar 10 μg del plásmido, mezclar con pipeta
3- Incubar en hielo por 5 min
4- Incubar en nitrógeno líquido 5 min
5- Baño a 37°C por 5 min
6- Repetir pasos 3, 4 y 5 tres veces
7- Poner en hielo
8- Añadir medio LBA
9- Incubar 4 h a 28ºC de 2-5 rpm
10- Plaquear con antibióticos

Una vez alcanzada la transformación de A. tumefaciens y corroborada la

presencia del plásmido pCDEFEPSPS se procede a la utilización de dicha cepa
de Agrobacterium como vehículo para insertar los genes presentes en el casete
Defepsps en las plantas de soya y así desarrollar organismos modificados
genéticamente resistentes al glifosfato y con actividad antifúngica.
Con esta técnica se han desarrollado varias líneas que expresan la proteína
EPSPS, dentro de ellas se encuentran Def1 y Def17, desarrolladas a partir de
la variedad cubana de soya I36 y la línea RP5 desarrollada a partir de DT84. A
continuación procedimos a cuantificar la expresión de la proteína EPSPS en
dichas líneas de soya a partir de un ensayo de inmunoadsorción ligado a
enzima que se describe a continuación.
ELISA
El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) forma parte de
aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados para poder visualizar
la reacción antígeno-anticuerpo. El ELISA se basa en el uso de anticuerpos
marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa o la fosfatasa alcalina),
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica
como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo)
inmovilizados sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará
inmovilizada y por tanto , podrá ser revelada fácilmente mediante la adición del
sustrato, que al actuar sobre la enzima, producirá un color observable a simple
vista o cuantificable mediante un colorímetro.
Existen diferentes tipos de ELISA tanto para la determinación de antígenos
como de anticuerpos. Uno de los más utilizados es el ELISA tipo sándwich,
siendo este el empleado en el presente trabajo.
En el método Elisa sándwich se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
monoclonal. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra
problema en la que se encuentra la proteína a determinar, que será retenida en
el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo
lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene gran
especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo. En nuestra práctica realizamos el ensayo del ELISA para
determinar la concentración de la proteína CP4EPSPS en hojas de las
siguientes líneas de soya: Def1, Def17, Inca36, RP5 y DT84
  Cuantificación mediante ELISA de la proteína CP4EPSPS
Extracción de las proteínas totales de las plantas de soja transgénicas
Se maceraron las hojas congeladas con nitrógeno líquido. Al macerado se le
añadió tampón de extracción (50mM fosfato de sodio pH7.0; 1.mM EDTA
disódico; 0.1%Lauril sarcosina y 0.1% de Tritón x-100). Se centrifugó el
extracto a 10000rpm durante 15 min a 40C, se tomó el sobrenadante y se
guardó hasta su uso a -200C

Protocolo del ELISA

1- Recubrir la placa (Greiner Bio-one) con 100μL/pozo de AcMc 5ª2, 10 μL/ml en

PBS. Incubar 2h a 370C en cámara húmeda
2- Lavar 4 veces con PBS+0.05% de Tween-20
3- Bloquear la placa con PBS-leche descremada 5%, 350 μL/pozo. Incubar 1h a
370C en cámara húmeda
4- Lavar 4 veces con PBS+0.05% de Tween-20
5- Aplicar muestras y estándar disueltos en PBS-leche descremada 3%
100μL/pozo. Incubar 1h a 370C en cámara húmeda
6- Lavar 4 veces con PBS+0.05% de Tween-20
7- Añadir conjugado a 1:500 (22 μL para 11ml PBS-leche descremada 3%).
Incubar 1h a 370C en cámara húmeda
8- Lavar 4 veces con PBS+0.05% de Tween-20
9- Desarrollar la reacción enzimática (0.6mg/ml de OPD y 0.015% de peróxido de
hidrógeno) Incubar 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente
10- Parar la reacción con 100 μL/pozo de 2.5M de Ácido sulfúrico
11- Leer absorbancia a 492nm en un lector de placas de ELISA (DIALAB, Austria)

Resultados experimentales y discusión

Curva de calibración
Una vez obtenida la curva de calibración y la ecuación de la recta se puede
determinar con los valores de absorbancia de la muestra la concentración
aproximada de la proteína Epsps en las hojas de soja transgénica.

Epsps ng/ml Absorbancia

1000 1,2224
500 0,6828
250 0,4425
125 0,3005
62,5 0,2285
31,25 0,2120
15,625 0,2114
Procesados los datos se obtuvieron los siguientes resultados
Absorbancia 492nm
Directo 1:10 1:50
def1 1,7446 0,2273 0,2183
def17 0,9007 0,1416 0,1596
I36 0,6145 0,1515 0,1493
RP5 1,8452 0,4931 0,2280
DT84 0,7805 0,1366 0,1426

2.0000

1.8000

1.6000

1.4000

1.2000
Directo
1.0000
1en10
0.8000 1en50

0.6000

0.4000

0.2000

0.0000
def1 def17 I36 RP5 DT84

De los cuales se puede concluir que

La línea Def1 presenta el mayor nivel de expresión de CP4EPSPS, en cual es
casi el doble que el control I36, la línea Def17 también presenta altos niveles de
expresión de dicha proteína pero no alcanza los niveles de Def1
La línea RP5 presenta los más altos niveles de expresión de EPSP pero no
puede ser seleccionada como clon debido a que no expresa adecuadamente la
Defensina, aspecto que no puede ser tratado en el presente trabajo por motivos
de seguridad a la propiedad intelectual.
Por tanto se escoge a la línea Def1 como clon para su secuenciación y
posterior investigación.

Consideraciones finales
Durante las prácticas laborales de segundo año de la carrera Bioquímica, en
nuestro laboratorio se pudo llevar a cabo la realización de técnicas
experimentales como cuantificación de proteínas y DNA, electroforesis,
purificación de DNA, centrifugación, entre otros procedimientos que exigían la
integración de los conocimientos adquiridos en las asignaturas de Técnicas de
Análisis Bioquímico y Biomoléculas, el adecuado uso de los equipos del
laboratorio y de la utilería en general y el conocimiento de las medidas de
seguridad requeridas. Se presentaron y resolvieron problemas bioquímicos de
acuerdo al proyecto que lleva a cabo nuestro equipo de trabajo. En base a esto
y a la variedad de técnicas realizadas se puede concluir que los objetivos de
las prácticas laborales has sido vencidos.
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