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Biosensores y bioelectrónica 28 (2011) 64–70

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Biosensores y bioelectrónica
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Película compuesta ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI funcionalizada con tri-enzima para la
determinación amperométrica de creatinina
Sandeep Yadav a,B, Rooma Devi a, Ashok Kumar B, CS Pundir a,∗
a Departamento de Bioquímica, Universidad Maharshi Dayanand, Rohtak 124001, Haryana, India
B Instituto de Biología Genómica y Integrada (IGIB), Mall Road, Delhi 110007, India

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Se ha sintetizado una nueva película compuesta de nanopartículas de óxido de zinc / quitosano / carbonanotubo
Recibido el 15 de abril de 2011 carboxilado de paredes múltiples / polianilina (ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI) sobre un electrodo de platino (Pt)
Recibido en forma revisada el 22 de junio de 2011
utilizando técnicas electroquímicas. Se inmovilizaron tres enzimas, creatinina amidohidrolasa (CA), creatina
Aceptado el 28 de junio de 2011
amidinohidrolasa (CI) y sarcosina oxidasa (SO) en el electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt para construir
On-line el 6 de julio de 2011
el biosensor de creatinina. El electrodo de enzima se caracterizó por microscopía electrónica de barrido (SEM),
espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). El
Palabras clave:
electrodo de enzima detecta un nivel de creatinina tan bajo como 0,5-M con una relación señal / ruido de 3 en 10 sa
Nanopartículas de óxido de zinc
c-MWCNT
pH 7,5 y 30◦C. El biosensor de creatinina fabricado mostró un rango de trabajo lineal de creatinina 10-650 -M con
Quitosano una sensibilidad de 0.030 -A -M−1 cm−2. El biosensor muestra solo un 15% de pérdida de su respuesta inicial durante
Polianilina un período de 120 días cuando se almacena a 4◦C. El biosensor fabricado se empleó con éxito para la determinación
Biosensor de creatinina de creatinina en suero sanguíneo humano.
© 2011 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción nación de interferencias y la estabilidad del sensor que aún deben

La determinación de creatinina en varios fluidos biológicos es útil para la
evaluación de disfunciones renales, musculares y tiroideas. También es útil para el
diagnóstico biomédico del infarto agudo de miocardio, así como para la terapia de
hemodiálisis cuantitativa. A diferencia de la urea, la concentración de creatinina en
estos líquidos corporales no está influenciada por la ingesta de proteínas y, por lo
tanto, es un indicador más confiable de la función renal (Kazmlerczak, 1991). La
creatinina se analiza principalmente colorimétricamente utilizando la reacción de
Jaffe (Jaffé, 1886) o enzimáticamente (Weber y Van Zenten, 1991). Sin embargo, los
métodos colorimétricos se ven afectados negativamente por numerosos
metabolitos y fármacos que se encuentran en muestras biológicas (Lo y Tsai, 1994
), mientras que los ensayos enzimáticos requieren mucho tiempo y son costosos.
El objetivo de la ingeniería de biosensores tiene muchas ventajas sobre otras
técnicas utilizadas para el análisis de creatinina en el laboratorio clínico, como la
reducción del tiempo, la complejidad y el costo de los análisis clínicos de rutina. Se
han informado diferentes tipos de biosensores para la determinación de
creatinina (Lad y col., 2008; Tiwari y Shukla, 2009). Desafortunadamente, los
biosensores potenciométricos sufren interferencias de cationes y amoníaco
endógeno que están presentes en la sangre y la orina (Shih y Huang, 1999). Sin
embargo, los biosensores amperométricos tienen problemas importantes que
involucran sensibilidad, selectividad, eliminación
∗ Autor correspondiente. Tel .: +91 1262 295480; fax: +91 1262 295480.
Correos electrónicos: pundircs@rediffmail.com, pundircs@gmail.com (CS Pundir).
mejorarse. Para superar estos problemas, se desea diseñar y preparar una
película funcional para la modificación del electrodo e inmovilizar la enzima
directamente sobre el electrodo revestido con película.
Nanotubos de carbono (CNT) descubiertos por Iijima (1991) se han utilizado en
biosensores, debido a su alta área de superficie efectiva, alta relación superficie /
volumen, buena conductividad eléctrica, fuerte capacidad de adsorción, excelente
bioconsistencia, alto efecto electrocatalítico y una rápida tasa de transferencia de
electrones (Zhang y col., 2004a, b; Lin y col., 2005; Tsai y col., 2005). Los CNT en
una suspensión individualmente pueden ser citotóxicos, pero la citotoxicidad se
evita inmovilizando los CNT en la superficie o dentro del composite (Hussain y col.,
2009). La adición de nanopartículas (NP) a las películas de CNT puede generar
nuevas nanoestructuras con excelente comportamiento en los campos de la
óptica, la electrónica y la electrocatálisis (Wang et al., 2007). Los electrodos
modificados con nanopartículas metálicas (NP) presentan ventajas inusuales en el
electroanálisis, como una catálisis mejorada, una mejora del transporte de
electrones, una alta superficie efectiva y un control sobre el microambiente de los
electrodos (Luo y col., 2004; Welch y Compton, 2006; Singh y col., 2007). Entre las
nanopartículas de óxidos metálicos, las ZnO-NP se han explotado como material
potencial para la biosensibilidad, debido a sus propiedades inusuales, es decir,
buena biocompatibilidad, estabilidad química, no toxicidad, alta comunicación
electrónica, alta área de superficie para una fuerte adsorción y alto punto
isoeléctrico ( IEP) (∼9,5) (Zhang y col., 2004a), lo que permite inmovilizar ADN o
proteínas con bajo IEP mediante adsorción electrostática en soluciones tampón
adecuadas (Topoglidis et al., 2001) que se carga positivamente en la superficie en
condiciones ácidas.

0956-5663 / $ - ver portada © 2011 Elsevier BV Todos los derechos reservados.doi:

10.1016 / j.bios.2011.06.044
 S. Yadav y col. / Biosensores y Bioelectrónica28 (2011) 64–70
El quitosano (CHIT) es un aminoazúcar polisacárido, con pKa valores de
6,3 para –NH2 grupo (Rinaudo et al., 1999). A pH por debajo de la pKa, la
mayoría de los grupos amino están protonados, lo que hace que CHIT sea un
polielectrolito catiónico soluble en agua. A pH por encima de la pKa, los
grupos amino de CHIT se desprotonan y, por tanto, se vuelven insolubles. La
solubilidad CHIT dependiente del pH es, por tanto, atractiva, ya que permite
el procesamiento a partir de soluciones acuosas (Ligler y col., 2001),
mientras que un modesto aumento del pH hasta la neutralidad permite que
CHIT adopte varias formas. CHIT se puede depositar electroquímicamente
sobre electrodos (Wu y col., 2002; Jiang y otros, 2006). El quitosano puede
acumular iones metálicos a través de varios mecanismos, como la quelación,
la atracción electrostática y el intercambio iónico, según la naturaleza del ión
metálico y el pH de la solución. Por lo tanto, la excelente capacidad de
formación de película, la buena adhesión, la biocompatibilidad y la alta
resistencia mecánica de la membrana CHIT han atraído a los científicos a
utilizarla para inmovilizar biomoléculas en los últimos años (Chen y Gorski,
2001; Miao y col., 2001; Okuma y Watanabe, 2002).
En vista de estas ventajas, se espera que un nanocompuesto de
ZnO-NPs / CHIT en una película híbrida MWCNT sea muy prometedor
para construir nuevos biosensores. El objetivo del presente trabajo fue
sintetizar electroquímicamente una nueva película compuesta ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI en un electrodo de Pt y luego inmovilizar
creatinina amidohidrolasa (CA), creatina amidinohidrolasa (CI) y
sarcosina oxidasa (SO) en película compuesta para la construcción de
un biosensor amperométrico de creatinina. Se evaluaron las
prestaciones analíticas del biosensor electroquímico de nuevo diseño.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales e instrumentos
Creatinina amidohidrolasa (CA, EC 3.5.2.10., De Pseudomonassp.),
creatina amidinohidrolasa (CI, EC 3.5.3.3, de Pseudomonassp.),
sarcosina oxidasa (SO, EC 1.5.3.1., de Bacilo sp.) y quitosano (CHIT) eran
de Sigma-Aldrich, EE. UU. Los nanotubos de carbono carboxilados de
paredes múltiples (c-MWCNT) eran de Intelligent Materials Pvt. Ltd.,
Panchkula (Haryana), India. La anilina (purificada mediante destilación
al vacío antes de su uso) y el nitrato de zinc fueron de SISCO Research
Lab., Mumbai, India. Todos los demás productos químicos eran de
grado reactivo analítico (AR). A lo largo de este trabajo se utilizó agua
bidestilada (DW).
Todos los experimentos electroquímicos se realizaron a temperatura
ambiente (25ºC). ± 1 ◦C) utilizando un potenciostato / galvanostato de
Autolab (Eco Chemie, Países Bajos). Se usó una celda convencional de tres
electrodos para experimentos electroquímicos en los que se usaron
enzimas / ZnO-NPs / c-MWCNT / PANI / Pt, Ag / AgCl y electrodo de Pt como
electrodo de trabajo, de referencia y auxiliar, respectivamente. Los espectros
UV-visible del espectrofotómetro Shimazdu y los espectros infrarrojos por
transformada de Fourier (FTIR) del espectrofotómetro Thermo FTIR se
llevaron a cabo en nuestro laboratorio. Se llevaron a cabo estudios de
microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de
transmisión (TEM) y difracción de rayos X (XRD) sobre una base comercial.
2.2. Construcción de enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI /
electrodo de Pt
2.2.1. Preparación del electrodo c-MWCNT / PANI / Pt
c-MWCNT (1 mg) se suspendió en 1,0 ml de mezcla de H concentrado2ASI
QUE4 y HNO3 en una proporción de 3: 1 y ultrasonidos durante 2 h para
obtener una mezcla homogénea. Después de la sonicación, los c-MWCNT se
lavaron minuciosamente con DW hasta que el pH del desecho de lavado fue
de 7,0. Se preparó una solución para electrodeposición añadiendo anilina (50
µl) y finalmente suspensión c-MWCNT dispersada (1 ml) en HCl 1 N (10 ml) en
una celda de vidrio. Película c-MWCNT / PANI
sesenta y cinco
se electrodepositó sobre un electrodo de Pt mediante electropolimerización
usando un potenciostato. Antes de la electrodeposición, el alambre de Pt
(1,85 cm× 1 mm) se sometió a ultrasonidos en 5.0 MHNO3 y acetona durante
15 min y luego se enjuaga con agua destilada. El sistema de tres electrodos
se sumergió en la solución y la exploración de potencial se cicló 20 veces
entre −0,6 y 1,0 V a una velocidad de exploración de 50 mV / s (Yadav et al.,
2011). Durante la polimerización electroquímica, la superficie del electrodo
de Pt se volvió negra gradualmente, lo que indica la deposición de la película
c-MWCNT / PANI sobre el alambre de Pt. El electrodo de Pt recubierto con
película de c-MWCNT / PANI se lavó con agua desionizada y se secó a
temperatura ambiente.
2.2.2. Preparación de electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / PtLos
ZnO-NP se prepararon como se describe (Moghaddam y otros, 2009)
utilizando una solución acuosa 0,45 M de nitrato de zinc (Zn (NO3)2·4H2O) y
una solución acuosa 0,9 M de hidróxido de sodio (NaOH). Se añadió gota a
gota lentamente solución de nitrato de zinc (50 ml) durante 40 min a la
solución de NaOH (100 ml) con agitación a alta velocidad. El vaso de
precipitados se selló durante este proceso durante 2 h. Las ZnO-NP
precipitadas se limpiaron con agua desionizada y etanol y se secaron al aire
a 60ºC.◦C. Las nanopartículas se recuperaron de la solución coloidal
mediante sucesivas precipitaciones con hexano. Se disolvieron copos de
CHIT (0,1 g) en 5 ml de ácido acético al 1% y se mantuvieron durante la
noche a temperatura ambiente. Se dispersaron ZnO-NP (5 mg) en una
solución transparente de CHIT y se mantuvieron en agitación magnética
durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente seguido de la
sonicación durante aproximadamente 1 h. La película híbrida de
nanocompuesto de solución ZnO-NPs / CHIT se electrodepositó en un
electrodo c-MWCNT / PANI / Pt mediante voltamperometría cíclica utilizando
un rango de potencial, −0,75 a 1,2 V a una velocidad de barrido de 50 mV / sy
posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente. El electrodo de ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt se lavó con agua desionizada.
2.2.3. Preparación del electrodo enzimático
El electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt se activó esparciendo
una solución de glutaraldehído al 2,5% sobre él y dejándolo reposar a
temperatura ambiente durante 2 h. El exceso de glutaraldehído se eliminó
lavándolo repetidamente con tampón fosfato (PB) 0,05 M, pH 7,5. El CA, CI y
SO se colocaron sobre la superficie activada con glutaraldehído del electrodo
ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt y se mantuvieron durante la noche
para inmovilización. El electrodo de enzima resultante se secó y luego se
almacenó en el refrigerador a 4ºC.◦C. El electrodo fabricado se caracterizó
por SEM, FTIR y EIS.
2.3. Medición y prueba voltamétrica cíclica del biosensor de
creatinina
Para evaluar la actividad catalítica de las enzimas / ZnO-NPs / CHIT /
c-MWCNT / PANI / electrodo de Pt, el electrodo modificado se
caracterizó por un voltamograma cíclico en presencia de creatinina en
el rango de potencial de −0,6 V a +1,2 V. Figura 1a muestra un
voltamograma cíclico de las enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT /
PANI / electrodo de Pt en tampón fosfato (PB) 0,05 M, pH 7,5 con
creatinina 1–300 -M. La respuesta máxima se observó a 0,5 V y, por
tanto, se llevaron a cabo estudios posteriores a este voltaje. Para
probar el funcionamiento del biosensor, se sumergió el sistema de tres
electrodos en 15 ml de tampón fosfato (PB) 0,05 M, pH 7,5. La reacción
se inició agregando solución de creatinina para alcanzar una
concentración final de 100 M y la corriente (mA) generada se registró a
0,5 V.
2.4. Aplicación y evaluación del biosensor de creatinina
El presente biosensor se utilizó para medir la creatinina en muestras
de suero. Se recolectaron muestras de suero de diferentes grupos de
edad y sexo de PGIMS, Rohtak en tubos y se almacenaron a 4ºC.◦C
66

Figura 1. (a) Voltamogramas cíclicos de estudios de respuesta amperométrica en función de enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / electrodo de Pt en concentración de creatinina de (a = 1 ag =
300 -M) usando 0.05 M PB, pH 7.5 . (b) Espectro UV de ZnO-NP. (c) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de ZnO-NP. (d) Patrón de difracción de rayos X (XRD) ZnO-NPs.

hasta su uso. Para determinar la creatinina sérica, se utilizó el mismo
procedimiento, como se describe anteriormente, para probar el biosensor
en sus condiciones óptimas de trabajo, excepto que la creatinina se
reemplazó por suero. Se estudiaron los siguientes criterios para evaluar el
rendimiento del biosensor mediante linealidad, recuperación analítica, límite
de detección, sensibilidad, precisión y correlación con métodos estándar.
3. Resultados y discusión
3.1. Caracterización de ZnO-NP
La caracterización de ZnO-NPs se realizó mediante espectros UV (Figura 1
b), TEM (Figura 1c) y XRD (Figura 1D). Encontramos que la morfología de las
ZnO-NP eran cristalitas en lugar de esféricas con un tamaño de 10 a 30 nm
de diámetro. En XRD, todos los picos fueron consistentes con los picos de
nanopartículas de ZnO con alta cristalinidad. Los estudios de XRD
confirmaron que los materiales sintetizados eran ZnO con fase de wurtzita y
todos los picos de difracción coincidían con los datos del comité conjunto
informado sobre el estándar de difracción de polvo (JCPDS) 15 y no se
observaron picos característicos distintos de ZnO. Un aumento definido de la
línea de los picos de difracción indicó que los materiales sintetizados
estaban en el rango nanométrico.
3.2. Construcción de enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI /
electrodo de Pt
La fabricación del biosensor de creatinina basado en enzimas / ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / electrodo modificado de Pt se resume
en Figura 2. En primer lugar, película compuesta c-MWCNT / PANI
se depositó sobre un electrodo de Pt usando voltamperometría cíclica.
Luego, la matriz de biopolímero de ZnO-NPs / CHIT se depositó
electroquímicamente sobre la superficie de la película compuesta PANI / c-
MWCNT. El método de electrodeposición se seleccionó para producir ZnO-NP
en las superficies de los electrodos, ya que este método es fácil de realizar y
se puede controlar el espesor de la capa. En segundo lugar, las enzimas CA,
CI y SO se inmovilizaron en una película compuesta de ZnO-NPs / CHIT / c-
MWCNT / PANI mediante acoplamiento de glutaraldehído y mediante
adsorción electrostática.
Los voltamogramas cíclicos de la película compuesta c-MWCNT / PANI y
ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI se muestran en Fig. 3. La película
compuesta ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI exhibe corrientes más altas
que la película compuesta c-MWCNT / PANI, lo que indica que la película
compuesta ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI tiene una gran superficie
efectiva que c -La película compuesta MWCNT / PANI y la película compuesta
ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI podrían proporcionar una ruta
conductora a través de la matriz compuesta para una cinética más rápida.
Por lo tanto, los ZnO-NP, que actúan como mediadores de transferencia de
electrones, ayudan a mejorar la respuesta del sensor del electrodo
enzimático y, por lo tanto, aumentan la sensibilidad del biosensor. Estas
observaciones sugieren la formación de una película compuesta de ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI que proporcionó una gran superficie para la
inmovilización de las enzimas.
Las reacciones electroquímicas involucradas en la medición de la respuesta del
biosensor de creatinina son las siguientes:
Creatinina + H2O CA creatina
-→
Creatina + H2O CI sarcosina + urea
-→
 Higo de enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / electrodo híbrido Pt.

Sarcosina + H2O + O2 ASI QUE formaldehído + glicina + H2O 2

-→

H2O2 0,5 V 2 H+ + O 2+ 2e-

---→

2e- → Electrodo de pt

3.3. Estudios SEM

los morfología de c-MWCNT / PANI / Pt electrodo,

Fig. 3. Voltamograma cíclico para la deposición electroquímica de (a) electrodo c-
MWCNT / PANI / Pt y (b) electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt.
El electrodo y enzimas ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt y el electrodo
ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt se caracterizaron mediante estudios
SEM. Las imágenes SEM muestran el electrodo c-MWCNTs / PANI / Pt (Figura
4a), presencia de ZnO-NP en el electrodo c-MWCNT / PANI / Pt (Figura 4b) en
forma de racimo y Figura 4c muestra la estructura globular que indica la
presencia de CA, CI y SO inmovilizados en el electrodo híbrido
nanocompuesto.
68
Figura 4. (a) Imágenes SEM del electrodo c-MWCNT / PANI / Pt. (b) Imágenes SEM de electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt. (c) Imágenes SEM de enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-
MWCNT / PANI / electrodo de Pt. (d) Espectros de impedancia de (i) electrodo c-MWCNT / PANI / Pt, (ii) electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt, y (iii) enzima / ZnO-NPs / CHIT / c-
Electrodo MWCNT / PANI / Pt K3Fe (CN) 6 / K4Fe (CN) 6 (1: 1) 5 mM que contiene PB 0,05 M, pH 7,5.
3.4. Espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS)
Los estudios EIS proporcionan información útil sobre los cambios de
impedancia de la superficie del electrodo durante el proceso de fabricación y
se llevaron a cabo para investigar la inmovilización de enzimas en el
electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt. El proceso de transferencia
de carga en enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / electrodo de Pt se
estudió monitoreando la resistencia de transferencia de carga (RConnecticut) en
la interfaz del electrodo y el electrolito. El diámetro de la porción de
semicírculo a frecuencias más altas de la gráfica de Nyquist era igual a la
resistencia de transferencia de carga (RConnecticut), que se puede utilizar para
describir las propiedades de la interfaz del electrodo. Mientras tanto, la parte
lineal a frecuencias más bajas corresponde al proceso de difusión.Figura 4d
muestra los espectros de impedancia electroquímica (EIS) de (i) c-MWCNTs /
PANI / electrodo de Pt, (ii) ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / electrodo de
Pt y (iii) enzimas / ZnO-NPs / CHIT / Electrodo c-MWCNT / PANI / Pt en 5 mM
K3Fe (CN)6/ K4Fe (CN)6 (1: 1) que contiene PB 0,05 M, pH 7,5. Se observó que
elRConnecticut del electrodo modificado de ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI
(ii) es menor que el electrodo modificado de c-MWCNT / PANI (i). Los
resultados muestran que el electrodo modificado ZnO-NPs / CHIT / c-
MWCNT / PANI disminuye la resistencia del electrodo y mantiene una alta
eficiencia de transferencia de electrones, mientras queRConnecticut de
enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI bioelectrodo (iii) aumenta a la
del electrodo modificado ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI. Este aumento
enRConnecticut se atribuye al hecho de que la mayoría de las moléculas
biológicas, incluidas las enzimas, son conductores eléctricos deficientes a
bajas frecuencias y obstaculizan la transferencia de electrones. Estos
resultados también indican la unión de enzimas sobre el compuesto ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI.
3.5. Espectros FTIR
El espectro FTIR del compuesto c-MWCNT / PANI depositado
electroquímicamente (Figura 5a) muestra bandas de estiramiento de
anillos bencenoides y quinoides presentes a 1459,1 y 1624 cm−1. Los
picos obtenidos a 1043,3 y 3419,9 cm−1 atribuido a B – N + = Q y
- Vibraciones de estiramiento N – H de PANI en el composite. En el
espectro FTIR de compuesto ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI (Figura
5b) mostró un pico de adición a 492 cm−1 debido a ZnO-NPs y un pico
ancho a 3421,3 cm−1 es una característica de las bandas de absorción
de quitosano debido a la superposición de –OH y –NH2 extensión. La
unión de enzimas en el electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI / Pt
se indicó por la aparición de bandas de absorción adicionales a 1652,9 y
1559,6 cm.−1 (Figura 5c) que se asignaron al estiramiento de carbonilo
(banda amida-1) y al enlace –N – H (banda amida-11), respectivamente.
3.6. Optimización de variables experimentales
Se estudió el efecto del pH sobre la respuesta electroquímica del
bioelectrodo en el rango de pH de 6,0 a 10,0. La respuesta de corriente
óptima se obtuvo entre pH 7,0 y 8,0. La temperatura óptima del
bioelectrodo se estudió midiendo la respuesta de la corriente a
diferentes temperaturas de 25◦C hasta 45 ◦C.La respuesta de corriente
óptima se obtuvo a 35 ◦C.Cuando se añadió creatinina a PB, pH 7,5, el
biosensor respondió rápidamente al sustrato y alcanzó el 95% de
corriente estable en un tiempo de respuesta de 10 s, que es mucho más
bajo que los reportados para el biosensor de creatinina basado en una
matriz de hidrogel PUR

Figura 5. Espectros FTIR obtenidos para (a) compuesto PANI / c-MWCNT. (b) Compuesto ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI. (c) Enzimas / ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / compuesto PANI.
(5 minutos) (Marcel y col., 1996), electrodo de pasta de carbón (90 s) (
Kim y col., 1999) y PbO2 película (118 s) (Shin y col., 2001). Esta
respuesta más rápida se atribuye a la influencia sinérgica de ZnO-NP,
CHIT y c-MWCNT. La respuesta amperométrica en estado estacionario
del biosensor se investigó aumentando la concentración de creatinina
de 0,5 M a 1000 M en condiciones óptimas. El gráfico de calibración
resultante para la creatinina, en el rango de concentración 10–650 -M
se muestra enFigura 6. La gráfica lineal revela que dicho electrodo
funcionó bien en una solución de creatinina con una sensibilidad de
0.030 -A -M−1 cm−2. La trama de Lineweaver-Burk dio unKmetro valor de
0.35 mM para enzimas inmovilizadas, que es menor que el del
biosensor de creatinina microfabricado (5.2 mM) (Marcel y col., 1996) y
biosensor de creatinina a base de electrodo de pasta de carbón (5,15
mM) (Kim y col., 1999). Estos resultados muestran que el biosensor
actual posee una mayor afinidad por la creatinina.
69
3.7. Aplicación de biosensor de creatinina
El presente biosensor se usó para investigar el nivel de creatinina en
suero humano y se encontró en el rango de 0.5 mg / dl a 1.9 mg / dl.
Cuando se compararon estos resultados con los obtenidos por el
método químico espectrofotométrico (Jaffé, 1886), hubo una buena
correlación (r = 0,989). Los resultados mostraron que los datos
obtenidos por el método actual y el método estándar informado
anteriormente son comparables. Demostró que el presente electrodo
modificado determinó la aplicación práctica del biosensor en el análisis
clínico.
3.8. Estudio de interferencia y selectividad
El estudio de interferencia del presente biosensor de creatinina se
llevó a cabo comparando la respuesta amperométrica antes y
70 S. Yadav y col. / Biosensores y Bioelectrónica28 (2011) 64–70
0,00525
0,00475
0,00425
Corriente (mA)
0,00375
0,00325
0,00275
0,00225
0,00175
0 100 200 300 400 500
Creatinina (µM)
Figura 6. Gráfico de calibración lineal correspondiente a las respuestas actuales para diferentes
concentraciones de creatinina por biosensor de creatinina basado en película compuesta ZnO-
NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI.
después de agregar algunos interferentes como ácido úrico, ácido
ascórbico, glicina, acetaminofén y creatina en su concentración
fisiológica en creatinina 100 M en PB 0.05 M, pH 7.5. Los resultados
mostraron que el ácido úrico, el ácido ascórbico, la glicina y el
acetaminofén no tienen un efecto significativo. Sin embargo, se
observó una interferencia obvia cuando la creatina coexistía con la
creatinina, lo cual es consistente con los resultados de los biosensores
mediadores anteriores (Marcel y col., 1996). Para evitar la interferencia
de la creatina, se determinó la creatinina total (creatinina + creatina)
utilizando el electrodo try-enzima (CA / Cl / SO) y luego se determinó la
concentración de creatina en la misma muestra mediante el electrodo
bienzyme (Cl / SO). La verdadera creatinina se calculó restando el valor
de creatina de la creatinina total.
3.9. Evaluación del biosensor de creatinina
El límite de detección del biosensor fue de 0,5-M con una relación
señal / ruido de 3, que es menor que los reportados para el biosensor
de creatinina basado en la matriz de hidrogel PUR (Marcel y col., 1996),
electrodo de pasta de carbón (Kim y col., 1999) y película de polímero
(polianión polipirrol) (Khan y Wernet, 1997) pero comparable al del
biosensor de creatinina basado en microchip que emplea una capa
oxidante (Shin y col., 2001). La recuperación analítica de creatinina
añadida exógenamente en suero (0,5 mg / dl y 1 mg / dl) fue del 98,87%
y 98,31%, respectivamente, lo que demuestra la fiabilidad del método.
Los resultados del coeficiente de variación (CV) dentro y entre lotes
para la determinación de la creatinina sérica fueron <4,6% y <5,1%, lo
que indica, respectivamente, la buena reproducibilidad y consistencia
del método.
3.10. Estabilidad del electrodo enzimático
La estabilidad del electrodo enzimático se investigó cada semana en
condiciones de almacenamiento a 4ºC. ◦C.Se observó que la respuesta
de corriente del sensor mantuvo el 85% de la respuesta de corriente
inicial incluso después de 120 días de 100 usos regulares, que es mejor
que la matriz de hidrogel PUR (90 días) (Marcel y col., 1996) y película de
polímero (polianión polipirrol) (<30 días) (Khan y Wernet, 1997). Esto
sugiere que la película compuesta ZnO-NPs / CHIT / c-MWCNT / PANI
asegura una buena estabilidad.
4. Conclusión
600 700
Se fabricó un nuevo biosensor amperométrico de creatinina
inmovilizando tres enzimas (CA, CI y SO) en el electrodo ZnO-NPs / CHIT / c-
MWCNT / PANI / Pt. El sensor mostró una alta sensibilidad, un tiempo de
respuesta rápido y una buena reproducibilidad. El estudio proporciona un
enfoque viable para desarrollar un nuevo tipo de biosensores
amperométricos basados en nanopartículas de ZnO para construir varios
biosensores de tipo híbrido.
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