Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Producción de proteínas
farmacéuticas recombinantes 4

Abstracto
Las proteínas producidas en el cuerpo controlan y median los procesos metabólicos y ayudan en su funcionamiento rutinario. Cualquier

tipo de deterioro en la producción de proteínas, como la producción de proteína mutada o proteína mal plegada, conduce a la interrupción

de la vía controlada por esa proteína. Esto puede manifestarse en forma de enfermedad. Sin embargo, estas enfermedades pueden

tratarse suministrando la proteína desde el exterior o de forma exógena. El suministro de proteína exógena activa requiere su producción

a gran escala para satisfacer la creciente demanda. El proceso es complejo y requiere una mayor expresión, purificación y procesamiento

de proteínas. Cada producto necesita configuraciones o estandarizaciones únicas para la producción y purificación a gran escala. Dado que

solo la producción a gran escala puede satisfacer la creciente demanda, debe ser rentable. Las herramientas de la ingeniería genética se

utilizan para producir proteínas de origen humano en bacterias, hongos, insectos o mamíferos hospedadores. El uso de la tecnología de

ADN recombinante para la producción a gran escala de proteínas requiere una gran cantidad de tiempo, mano de obra y recursos, pero

también ofrece muchas oportunidades para el crecimiento económico. Después de leer este capítulo, los lectores podrán comprender los

conceptos básicos sobre la producción de proteínas recombinantes en varios huéspedes junto con las ventajas y limitaciones de cada

sistema huésped y las propiedades y producción de algunos de los compuestos farmacéuticos y factores de crecimiento importantes. pero

también ofrece muchas oportunidades de crecimiento económico. Después de leer este capítulo, los lectores podrán comprender los

conceptos básicos sobre la producción de proteínas recombinantes en varios huéspedes junto con las ventajas y limitaciones de cada

sistema huésped y las propiedades y producción de algunos de los compuestos farmacéuticos y factores de crecimiento importantes. pero

también ofrece muchas oportunidades de crecimiento económico. Después de leer este capítulo, los lectores podrán comprender los

conceptos básicos sobre la producción de proteínas recombinantes en varios huéspedes junto con las ventajas y limitaciones de cada

sistema huésped y las propiedades y producción de algunos de los compuestos farmacéuticos y factores de crecimiento importantes.

4.1 Introducción estas enfermedades pueden tratarse suministrando la proteína

Las proteínas producidas en el cuerpo controlan y median
los procesos metabólicos y ayudan en su funcionamiento
rutinario. Cualquier tipo de deterioro en la producción de
proteínas, como la producción de proteína mutada o
proteína mal plegada, conduce a la interrupción de la vía
controlada por esa proteína. Esto puede manifestarse en
forma de enfermedad. Sin embargo,
desde el exterior o de forma exógena. El suministro de proteína
exógena activa requiere su producción a gran escala para
satisfacer la creciente demanda. El proceso es complejo y
requiere una mayor expresión, purificación y procesamiento de
proteínas. Cada producto necesita configuraciones o
estandarizaciones únicas para la producción y purificación a
gran escala. Como solo la producción a gran escala puede
satisfacer la creciente

© Springer Science + Business Media Singapur 2017 77

V. Gupta y col., Aspectos básicos y aplicados de la biotecnología, DOI 10.1007 / 978-981-10-0875-7_4
78
demanda, por lo que debe ser rentable. Las herramientas
de la ingeniería genética se utilizan para producir proteínas
de origen humano en bacterias, hongos, insectos o
mamíferos hospederos (Fig.4.1). El uso de la tecnología de
ADN recombinante para la producción a gran escala de
proteínas requiere una gran cantidad de tiempo, mano de
obra y recursos, pero también ofrece muchas
oportunidades para el crecimiento económico. Después de
leer este capítulo, los lectores podrán comprender los
conceptos básicos sobre la producción de proteínas
recombinantes en varios huéspedes junto con las ventajas y
limitaciones de cada sistema huésped y las propiedades y
producción de algunos de los compuestos farmacéuticos y
factores de crecimiento importantes.
4.2 Expresión de gen extraño
En todas las células vivas, la expresión de genes se
produce cuando la información genética contenida en
el ADN se transmite al ARN en el proceso de
transcripción y del ARN a la proteína en el proceso de
traducción. Por lo tanto, el cuerpo sintetiza ARN y luego
proteínas de acuerdo con las instrucciones del ADN. La
ARN polimerasa o ARN polimerasa dependiente de ADN
lleva la transcripción. Eucariotas
Figura 4.1 El gen de interés se
clona en un vector adecuado.
Para la expresión del gen Gen selectivo
clonado, el gen tiene todos los
DHFR (metabolismo de nucleósidos)
elementos reguladores
esenciales necesarios para la Glutamina sintasa (síntesis de
transcripción del gen. El gen está glutamina)
unido al gen selectivo, que ayuda
en la selección de los clones con
el gen de interés. Las células se
criban para la síntesis del
producto deseable y luego se
procesan para
producción a gran escala en el
biorreactor con condiciones
óptimas para altos rendimientos
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
tienen tres ARN polimerasas: la polimerasa I transcribe los
genes de ARN ribosómico (18S, 5.8S y 28SrRNA), la
polimerasa II transcribe todos los genes de codificación
proteica (ARNm y ARN pequeño) y la polimerasa III
transcribe los genes de 5SrARN y ARNt. En células
procariotas (E. coli), La ARN polimerasa consta de cinco
subunidades: dos subunidades α idénticas y una subunidad
de β, β′, y subunidad σ. La subunidad σ se disocia después
de que se produce la polimerización. Por tanto, el término
"holoenzima" se usa para enzima completa y "enzima
central" se usa sin subunidad σ. El proceso de transcripción
se inicia mediante la unión de la ARN polimerasa a la
molécula de ADN en un sitio muy específico llamado
"promotores". Los promotores son fundamentales para el
inicio de la transcripción. Los sitios del promotor tienen casi
40 pb de largo y se ubican principalmente antes de la
primera base, que se copia en el ARN (Fig.4.2a). Esta
primera base se denomina punto de inicio de la
transcripción y se denota con +1.
4.2.1 Promotores
Los promotores de RNApol II permiten la expresión
diferencial de genes y determinan la velocidad a la
que se transcriben los genes. Hay algunos
Gen de interés
Elementos reguladores
transcripcionales esenciales
Selección
Mantenido en celda única
Detección de la producción
de proteína recombinante
Se elige una / pocas células /
línea celular para la producción
y se cultiva a gran escala en un
biorreactor
4.2 Expresión de gen extraño
a
E. coli promotor
TTGACAT
- 35 caja
Promotor eucariota
GGGCGG
Varios
otro Caja GC
señales ~ 100
B Transcripción y traducción eucariotas
Exón1 Exón2 Exón3
Intron Intron Intron
Empalme para la eliminación de intrones
y unión de exones
ARNm
C Sesgo de codón
Codón del gen humano para la prolina
CCA CCA CCA
E. coli codón del gen para la prolina
CCG CCG
Figura 4.2 La figura muestra los problemas encontrados por
E. coli debido a la secuencia de un gen extraño, cuando se
clona y se expresa en él. (a) Muestra el promotor de E. coliy
eucariotas. Como existen diferencias en el promotor deE.
coli y eucariotas, por lo que el promotor eucariota puede no
funcionar en E. coli, y el gen se coloca bajo el control de E.
coli promotor. (B) En los eucariotas, la maquinaria de
empalme elimina los intrones del gen diana. Mientras que
elE. coli no tiene tal sistema, por lo tanto, el
promotores que hacen que los genes insertados se
expresen todo el tiempo; en todas las partes del
sistema, se les conoce como promotores
"constitutivos". Otros permiten la expresión solo en
ciertas etapas / ciertos tejidos / órganos de individuos y
en ciertos momentos. La expresión génica está
sometida a regulación temporal y espacial.
En procariotas, la posición antes del sitio de inicio en
- 10 y -35 pueden interactuar con la subunidad σ de la
holoenzima de la ARN polimerasa. En eucariotas el
secuencia (análoga a -10: consenso aguas arriba, aguas abajo o en el medio de la secuencia de
procariotas), TATAAAA, está presente gene. Los promotores de genes domésticos o genes
en la posición -30 en la región promotora. Se muestra el
promotor eucariota (Fig.4.2a) con la caja TATA
formando el promotor central en la posición -30 (de -30
a -100), corriente arriba del sitio de inicio de la
transcripción. La caja CAAT y la caja GC están en
79
TATAAT Transcripción Gen estructural
- Caja de 10 sitio de inicio
Transcripción
start sitio
Exón 1 Exón2
Intron
CCAAT TATAAAT 59 UTR 39 UTR
Caja CAAT - Caja de 30
~ 70 hasta -90
Exón4 ARN heterogéneo
Traducción
CCA
CCG
La versión sin intrones del gen se utiliza en E. coli. (C) muestra sesgo
de codones en sistemas bacterianos y humanos. Como un
aminoácido está codificado por más de un codón, por ejemplo,
prolina, donde los codones preferenciales en humanos son CCA
mientras queE. coli prefiere CCG, si el gen que contiene los codones
preferenciales para humanos se utiliza en E. coli, entonces podría
resultar en una traducción ineficaz. Por lo tanto, estos problemas
deben solucionarse mientras se usaE. coli como anfitrión
aproximadamente −70–90 y −100, respectivamente. La
ubicación del promotor siempre está en la misma
molécula de ADN que regulan. Se denominan
elementos que actúan en cis. El espaciamiento de
varios elementos es más importante y mucho depende
de activadores específicos de locus, ya sea en el
promotor central o en sitios distantes. También están
implicadas varias otras señales como potenciadores
que están muy alejadas del gen diana. Ejercen efectos
estimulantes sobre la actividad promotora y pueden ser
con patrones de expresión complejos tienen islas
CpG en lugar de caja TATA. El gen que se va a
transcribir tiene 5'-región no traducida (5'UTR),
exones (región codificante) separados por intrones
(región no codificante). El final tiene 3ʹ sin traducir
80
región (3ʹ UTR). En la clonación para la expresión
génica, normalmente se utiliza una versión del gen sin
intrones. En eucariotas, la transcripción se ve reforzada
por potenciadores, que pueden estar a 2.000 a 3.000
bases de distancia de la región promotora, pero que
pueden afectar la velocidad de transcripción.
4.2.2 Consideraciones generales
para la producción de proteínas
El huésped más simple para el trabajo de la
tecnología del ADN recombinante es el sistema
bacteriano procariota. A principios de la década de
1980, el primer fármaco recombinante aprobado
por la FDA, la insulina humana (Humulin-US /
Humuline-EU), se obtuvo deEscherichia coli (E. coli)
para el tratamiento de la diabetes.
Debido a la creciente demanda, se están diseñando
muchas cepas de especies microbianas con un mayor
rendimiento y una mejor recuperación de la proteína
terapéutica de cultivos a gran escala. Las proteínas
recombinantes aprobadas por la FDA se obtienen de
Escherichia coli u otros procariotas; deSaccharomyces
cerevisiae u otras especies de hongos; de células de
insectos, células de mamíferos o células humanas; o de
plantas o animales transgénicos. La clonación y
producción de proteína en un sistema huésped
particular dependen de una propiedad del huésped
para clonar y expresar el tamaño deseable de genes
que codifican proteínas; producción de proteína
correctamente modificada, plegada y funcional; alto
rendimiento de la proteína; y requisitos de bajo costo.
La elección de los sistemas de host requiere el mejor
sistema, que puede cumplir con los requisitos [17].
Las ventajas de producir proteínas mediante
tecnología de ADN recombinante son:
• Como el gen humano puede ser clonado y expresado,
minimiza el riesgo de reacción inmunológica y la
actividad específica de la proteína es alta.
• La proteína terapéutica se puede producir de
manera eficiente, manteniendo su rentabilidad.
• Minimiza el riesgo de transmisión de patógenos
desconocidos presentes en fuentes animales y
humanas.
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
• Modificación apropiada con mayor especificidad,
vida media aumentada y funcionalidad mejorada.
• Permitir crear cambios críticos para una mejor
especificidad y actividad.
4.2.3 Expresión de alto contenido de proteínas
en el huésped
La expresión y producción de proteína eucariota
requiere la clonación de su ADNc en un vector de
expresión y la posterior transferencia del vector en un
huésped adecuado. El ADN se modifica, clona y expresa
en otro huésped para la producción de la proteína; por
lo tanto, se requieren condiciones óptimas de
producción en cada huésped. Sin embargo, existen
variaciones de rendimiento en diferentes sistemas de
expresión, pero se puede lograr una expresión de alto
nivel de la proteína considerando los siguientes puntos:
• El gen recombinante debe tener todos los
elementos necesarios para el inicio de la
transcripción eficaz.
• Se hace uso de un potente promotor / potenciador
viral o celular para la conducción eficaz de la
transcripción. El uso del promotor viral T7 en
bacterias puede resultar en un mayor rendimiento
de proteínas recombinantes. El transgén puede
expresarse bajo el control del promotor de
polihedrina de baculovirus, el promotor E1 de
adenovirus o el promotor p7.5 deVirus vaccinia.
Estos son adecuados para una amplia gama de tipos
de células. Las células de mamífero pueden usar el
promotor y potenciador de SV40 o el promotor y
potenciador de repetición terminal larga de laVirus
del sarcoma de Rous o promotor temprano del
citomegalovirus humano (consultar el Cap. 2 para
promotores y vectores de expresión).
• Las señales de poliadenilación son útiles en genes
eucariotas. Estos terminadores son necesarios para
3′ terminan con el ARNm que se extiende mediante
la adición de una cola de poli A aumentando
finalmente la estabilidad del ARN y facilitando su
exportación al citoplasma.
• Eliminación de 3′ y 5′ Las UTR (repeticiones no
traducidas) pueden influir en la expresión génica.
Pueden interferir con el inicio de la traducción y
4.3 Sistema microbiano para la producción de proteína terapéutica
su estructura secundaria impide una
traducción eficaz.
• Consenso de Kozak 5′ -CCRCCAUGG-3′ con purina
en la posición -3 y guanina en la posición +4
afecta la expresión del transgén.
• Inclusión de una secuencia de intrón, que se encuentra
entre el promotor y la codificación del cDNA.
secuencia, da mejor rendimiento; por tanto, la mayoría de las expresiones, ya que la producción es rápida, barata y los vectores
siónicos incluyen al menos una secuencia de intrones.
La presencia de intrones es importante cuando el transgén
necesita expresarse en células de mamífero.
• Para eliminar las lentas velocidades de traducción
debidas al sesgo de codones, el gen puede
convertirse en un gen de alta expresión cambiando
los codones de t-RNA por los más abundantes.
• El sitio de integración tiene un efecto importante
sobre la velocidad de transcripción del gen
recombinante (efecto de posición).
• Se incorporan algunos genes selectivos como el gen
de la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la glutamina
sintetasa (GS). Los genes están involucrados en la
biosíntesis de nucleótidos y la glutamina sintetasa,
respectivamente; la selección se produce cuando
falta el metabolito apropiado, lo que impide el
crecimiento de células no transformadas.
• Para aumentar el rendimiento de la proteína
recombinante, la proteína a menudo se fusiona con la
secuencia de la proteína endógena (ver Cap. 5 para
marcadores seleccionables, reporteros).
• Para ayudar a la purificación, el ADN que codifica la
proteína contiene ADN que codifica proteínas o
péptidos específicos que pueden ser un objetivo para la
cromatografía de afinidad.
• Para la purificación por afinidad, se emplean fácilmente
dos sistemas, (1) afinidad glutatión S-transferasa (GST)-
glutatión y (2) afinidad polihistidina-ion níquel. GST
tiene una alta afinidad por el glutatión y la proteína con
cadenas laterales de histidina tiene una alta afinidad
por los iones de níquel.
• La transfección estable proporciona un alto
rendimiento de proteínas. Una vez que el ADN
recombinante se transfecta en células animales,
puede integrarse (expresión estable) en el genoma
del huésped o mantenerse en forma episomal
(expresión transitoria). En los sistemas de expresión
estables, el gen extraño se transmite a los
siguientes descendientes y la expresión se mantiene
generación tras generación.
81
4.3 Sistema microbiano
para la producción
de proteína terapéutica
Aunque hay varios sistemas de hospedadores disponibles para
la producción de proteínas recombinantes, los hospedadores
microbianos ofrecen varias ventajas sobre otros sistemas.
económico:
1. La biología y fisiología molecular está bien
caracterizada y documentada.
2. Fácil de mantener y manipular.
3. Utiliza fuentes de nutrición económicas.
4. Rápido crecimiento y acumulación de biomasa para
lograr altas densidades celulares.
5. La ampliación es fácil y conveniente.
6. Su maquinaria de expresión puede ser con una variedad
de promotores inducibles fuertes.
Promotores Inducibles
El promotor inducible puede requerir un
inductor, o el agotamiento o la adición de un
nutriente específico, o un cambio de pH o
cambios en los factores fisicoquímicos para
iniciar el proceso de expresión génica. Los
sistemas inducibles adolecen de la desventaja de
que los inductores químicos pueden ser costosos
y tóxicos y requerirían su eliminación durante el
procesamiento posterior cuando el producto
está destinado a uso humano. Por tanto, se ha
utilizado el uso de sistemas termorregulados
para la producción de proteínas farmacéuticas
recombinantes, ya que la expresión depende de
un promotor fuerte regulado por calor que
minimiza los riesgos de cualquier adición de
agente químico.
Al igual que con la estructura celular de las bacterias, puede
adaptarse rápidamente a las condiciones de cultivo con un
tiempo de replicación muy corto (20 min). El requerimiento de
medio de la célula bacteriana es simple y consiste en una fuente
simple de carbono y nitrógeno. Por lo tanto, los aportes totales
de las bacterias son un 90% más bajos que los de las células de
los mamíferos. Algunos de los
82
Las terapias derivadas de bacterias aprobadas (por la
Unión Europea o la FDA, EE. UU.) incluyen hormonas
(insulina humana y análogos de insulina, calcitonina,
hormona del crecimiento humano, glucagones,
hormona paratiroidea, somatropina y factor de
crecimiento similar a la insulina 1), interferones (alfa -1,
alfa-2a, alfa-2b y gamma-1b), interleucinas 11 y 2,
cadenas ligeras y pesadas contra el factor de
crecimiento endotelial vascular A, factor de necrosis
tumoral alfa, proteína de la subunidad B del cólera,
factor estimulante de colonias de granulocitos , y
activador de plasminógeno [3].
El microbio de primera elección para la producción de
proteína recombinante es la enterobacteria. E. coli. El
sistema ofrece modificaciones rápidas y fáciles, facilidad de
cultivo en condiciones ambientales manejables y un ciclo de
vida corto. La célula bacteriana puede tolerar y adaptarse
rápidamente a los cambios en el medio ambiente, por lo
que la ampliación es más fácil.
Sin embargo, el sistema adolece de algunas de las desventajas de 6. Falta de modificaciones
postraduccionales [11,dieciséis].
1. Los genes humanos o de mamíferos clonados en bacterias no
pueden someterse a empalme debido a la falta de maquinaria de
empalme, por lo que se clona la versión sin intrones del gen para
obtener resultados óptimos (Fig. 4.2b).
2. Las señales involucradas en la transcripción de genes
pueden variar; así, el gen de interés se fusiona
habitualmente con el gen bacteriano bajo el control de
su promotor, y la proteína se obtiene como un producto
de fusión, que posteriormente se puede escindir,
purificar y utilizar.
3. El promotor Lac es uno de los promotores bacterianos
más populares. Sin embargo, para una expresión de
alto nivel, también se prefiere el promotor T7 (presente
en los vectores pET). Puede impulsar la expresión de la
proteína objetivo a casi el 50% de la proteína celular
total. El gen de interés se puede colocar bajo el control
de un promotor regulado del fago.
4. Para la traducción, la abundancia de t-RNA está relacionada
con la frecuencia de aparición de diferentes codones (codón
sesgado). Por lo tanto, los codones raros paraE. coli puede
causar una incorporación incorrecta de aminoácidos o una
terminación prematura que afecte el rendimiento de la
proteína terapéutica. Esto se puede resolver mediante el
reemplazo dirigido al sitio de codones raros a los codones
(para el mismo aminoácido) preferido porE. coli. Otro
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
enfoque puede ser la coexpresión de t-RNAs
raros en E. coli (cepas de E. coli, BL21 codon plus
y Rosetta se diseñaron para este propósito). Para
la adición de aminoácidos durante el proceso de
traducción, ya que hay más de un codón para
varios aminoácidos, se produce un sesgo de
codón, que es la preferencia de un codón
particular de aminoácido en una especie
particular (Fig.4.2c).
5. Complejidad: las células eucariotas tienen la ventaja de
producir proteínas completamente funcionales y
correctamente plegadas. Los anticuerpos con cuatro
subunidades pueden ser secretados por células
eucariotas en forma completamente funcional. Por otro
lado, es muy difícil obtener proteína multidominio a
partir deE. coli. Incluso si se obtiene proteína, la
renaturalización y el plegamiento en condiciones de
laboratorio pueden ser muy costosos o la proteína
puede carecer de su actividad.
(PTM) es el problema, que no se puede resolver, y es
obligatorio para la actividad de muchas proteínas
terapéuticas. La glicosilación son las modificaciones
más comunes, y otras son la fosforilación y la formación
de enlaces disulfuro, que son esencialmente necesarios
para la capacidad funcional completa de muchas
proteínas humanas. Los PTM desempeñan un papel
importante en el plegamiento, el procesamiento, la
estabilidad, la focalización de tejidos, la actividad, la
reactividad inmunitaria y la vida media de la proteína
adecuados. La falta de estos resulta en un producto
insoluble, inestable o inactivo.
Sin embargo, el sistema de glicosilación
ligado a N de Campylobacter jejuni se ha
transferido con éxito a E. coli, abriendo así una
posibilidad para la producción de proteína
glicosilada en él. Cierto mutanteE. coli se están
desarrollando para promover la formación de
enlaces disulfuro (AD494, Origami, Rosetta-gami)
con actividad de proteasa reducida (BLZ1).
7. La sobreproducción de proteína recombinante en bacterias
puede resultar en la pérdida de solubilidad y el depósito de
muchas especies de proteínas como agregados de
proteínas o cuerpos de inclusión. La alteración de las
condiciones de crecimiento puede convertir el producto en
insoluble. Muchas proteínas eucariotas se encuentran
atrapadas en cuerpos de inclusión con resistencia a un
procesamiento posterior. El éxito tiene
4.3 Sistema microbiano para la producción de proteína terapéutica
obtenido en la purificación de insulina y betaferón a
partir de cuerpos de inclusión. La recuperación de
proteínas utilizando condiciones de desnaturalización
con posterior replegamiento y renaturalización no
siempre puede ser fácil y resultar extremadamente
costosa.
8. Con el E. coli huésped, es muy difícil obtener
proteínas mayores de 60 kDa en forma
soluble.
Debido a ciertas limitaciones para la producción de productos
teins en E. coli, se están discutiendo otros sistemas
hospedadores para la producción de proteínas.
Glicosilación
La unión covalente del grupo carbohidrato a la
proteína para formar glicoproteína se llama
glicosilación. En las glicoproteínas, las proteínas
constituyen una fracción importante. Estos juegan
un papel importante en varios procesos fisiológicos
y son componentes de las membranas celulares.
Los carbohidratos comúnmente unidos a
las proteínas pueden ser fucosa (Fuc),
galactosa (Gal), N-acetilgalactosamina
(GalNAc), glucosa (Glc), N-acetilglucosamina
(GlcNAc), manosa (Man) y ácido siálico (Sia).
Estos restos de azúcar pueden asociarse a
través del átomo de nitrógeno amida de la
cadena lateral de asparagina (Asn) denominada
glicosilación ligada a N o al átomo de oxígeno en
la cadena lateral de serina (Ser) o treonina (Thr)
denominada glicosilación ligada a O.
No toda la asparagina (Asn) presente en el
polipéptido puede aceptar el resto de
carbohidrato. Los residuos con la secuencia
Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier
aminoácido excepto prolina, son dianas para
la glicosilación. No solo la secuencia residual,
sino otros aspectos de la estructura de la
proteína y el tipo de célula determinan el sitio
de glicosilación.
Todos los residuos de azúcar ligados a N
tienen un núcleo común de pentasacáridos.
Estos pentasacáridos constan de tres manosa
(continuado)
83
y dos residuos de N-acetilglucosamina. El núcleo
puede unirse a diferentes oligosacáridos para
formar diferentes glicoproteínas.
Hombre Hombre
Hombre
GlcNAc
GlcNAc
- - Asn—
Núcleo de pentasacárido
La glicosilación es una de las modificaciones
postraduccionales importantes, que se produce
dentro de la luz del retículo endoplásmico (RE) y
en el complejo de Golgi. El ER y el complejo de
Golgi son importantes en la selección y el
transporte de proteínas. La glicosilación ligada a
N comienza en el retículo endoplásmico y
continúa en el complejo de Golgi después de que
el polipéptido se sintetiza en los ribosomas. Sin
embargo, la glicosilación ligada a O se produce
exclusivamente en el complejo de Golgi.
En el proceso, el oligosacárido que se unirá a
la proteína se asocia con un lípido especializado
presente en el RE, el fosfato de dolicol, que
consta de aproximadamente 20 unidades de
isopreno (C5). A través del fosfato de dolicol
fosfato, el oligosacárido se transfiere a un
residuo de asparagina específico de la cadena
polipeptídica en los ribosomas. La enzima
responsable de la glicosilación de la proteína y el
oligosacárido activado se encuentran en el lado
de la luz del RE.
Luego, estos se transportan al complejo de
Golgi, donde se modifican y finalizan las
unidades de carbohidratos. El complejo de
Golgi es responsable de la unión del azúcar
ligado a O y la modificación del azúcar ligado
a N. Luego, las proteínas se dirigen y se
transportan a su destino.
84
- Asn- - Asn-
HUMANO MAMÍFERO
Glc / Hombre
Figura 4.3 Muchas de las proteínas humanas están glicosiladas
(glicosilación ligada a O o ligada a N). La glicosilación es una de
las modificaciones postraduccionales importantes. losE. colino
puede realizar la glicosilación. Los hongos son los sistemas
eucariotas más simples que pueden realizar la glicosilación. El
uso de hospedante fúngico (Pichia pastoris y Saccharomyces
4.4 Producción de proteína recombinante
en hospedadores fúngicos
Debido a los problemas encontrados en E. coli para la
producción de proteínas más grandes o proteínas modificadas,
el siguiente sistema rentable, rápido, de alta densidad y fácil de
manejar es el de los hongos. Saccharomyces cerevisiae (
levadura) fue el sistema de elección cuando fue difícil obtener
proteína terapéutica en forma soluble y con modificaciones
postraduccionales apropiadas en el hospedador bacteriano. En
la levadura, se encuentran disponibles mutantes que pueden
dar un alto rendimiento. Los productos aprobados obtenidos de
la levadura son hormonas, vacunas, factores estimulantes de
colonias de granulocitos y macrófagos recombinantes (GM-CSF),
albúmina, hirudina y factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF).
Las ventajas de S. cerevisiae son los siguientes: (1)
secreta proteína recombinante en el cultivo, (2) la
proteína está correctamente plegada y (3) realiza la
mayoría de las modificaciones postraduccionales. Con
el sistema de levadura, se obtienen altas cantidades de
proteína recombinante, y la levadura también es capaz
de realizar modificaciones postraduccionales como
glicosilación, fosforilación, acetilación y acilación ligadas
a O, pero difiere drásticamente en los patrones de
glicosilación ligada a N (Fig.4.3).
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
- Asn- - Asn-
Pichia pastoris Sacharomyces cerevisiae
(Hongos)
(Hongos)
cerevisiae) para la producción de proteínas recombinantes da como
resultado una hiperglicosilación. La figura muestra el patrón de
glicosilación en humanos, mamíferos,Pichia, y Saccharomyces
sistemas. Las hiperglicosilaciones o glicosilaciones anormales pueden
hacer que la proteína sea altamente inmunogénica, haciéndola
inadecuada para fines terapéuticos.
Chaperones moleculares y plegables de proteínas
Las chaperonas son una familia de proteínas diferentes
altamente conservadas. Las funciones importantes de
los acompañantes son:
• Prevención de la agregación y el plegamiento incorrecto de
la cadena polipeptídica recién sintetizada.
• Previenen la agregación irreversible de
conformación no nativa y mantienen la
proteína en la vía de plegamiento productiva.
• Evitan interacciones no productivas con
otros componentes de la célula.
• Ayudan y guían el ensamblaje directo de complejos de
proteínas de múltiples subunidades y proteínas más
grandes.
• Las chaperonas involucradas en el plegamiento reconocen
las proteínas de sustrato no nativas principalmente a
través de sus residuos hidrófobos expuestos.
Las principales clases de chaperonas
moleculares son:
Las proteínas de choque térmico están presentes en una variedad
de los sistemas y prevenir el daño a las
proteínas a altas temperaturas.
(continuado)
4.5 Producción de proteína recombinante en células de insectos
HSP60
• Es chaperonina mitocondrial
tetradecamérica.
• Está implicado en la importación de proteínas y el
ensamblaje macromolecular.
• Requerido para el plegamiento de polipéptidos
precursores de manera dependiente de ATP.
• Previene la agregación y media el replegamiento
de proteínas después del choque térmico.
HSP70
• Son componentes centrales de la red celular
de catalizadores de plegamiento y
chaperonas moleculares.
• Ayudan en diferentes tipos de procesos de
plegamiento de proteínas en la célula mediante
la asociación transitoria de su dominio de unión
al sustrato con péptido hidrofóbico corto.
• Se unen y liberan su sustrato cambiando al
estado de unión a ATP de baja afinidad y al
estado de unión a ADP de alta afinidad.
• Forman una compleja red de
plegadoras [15].
HSP90
• Es acompañante muy abundante.
• Desempeña un papel importante en muchos
procesos celulares, por ejemplo, el control del
ciclo celular, la supervivencia celular y las
hormonas y otras vías de señalización.
• Es un actor clave en el mantenimiento de la
homeostasis celular durante el estrés.
• Tiene actividad ATPasa, cuya unión e
hidrólisis afecta la dinámica
conformacional de la proteína.
• Se ha convertido en un objetivo terapéutico importante
para el cáncer y se está explorando su papel en los
trastornos neurodegenerativos y las enfermedades
infecciosas [10].
CCT: Chaperonina que contiene TCP1
• Este es el complejo anular del polipéptido 1
(TCP1) del complejo sin cola de chaperonina
eucariota (TRiC).
• Facilita el correcto plegamiento de muchas
proteínas celulares.
(continuado)
85
GroEL
• Es un acompañante bacteriano.
• Se une a proteínas parcialmente plegadas y
mal plegadas.
• Para su funcionalidad GroEL requiere su
cofactor GroES.
Las diferencias en la N-glicosilación en levaduras
son altas o hipermanosa, que es altamente
inmunogénica. Las proteínas no modificadas son
adecuadas para la producción en levadura.
Otros miembros de los hongos son Pichia pastoris,
Pichia methanolica, Candida boidinii, y Pichia angusta,
que son levaduras metilotróficas facultativas que tienen
un gran potencial. Pichia pastoris se favorece ya que se
pueden obtener altas densidades de células; la proteína
se secreta en alta concentración (1 g / l), menos
hipermanosilación en comparación con la levadura y,
por tanto, menos inmunogénica.
Sin embargo, la desventaja es que requiere metanol
para inducir la expresión génica, ya que el transgén está
bajo el control del promotor del gen de la alcohol oxidasa 1
(AOX1). El metanol puede ser inflamable y tóxico para las
células y los seres humanos si no se elimina por completo.
Debido a la glicosilación del tipo hipermanosetio, los
hongos tampoco son adecuados para la producción de
muchas proteínas recombinantes.
4.5 Producción de proteína recombinante
en células de insectos
Células de insectos: las células de insectos pueden
infectarse con baculovirus, que son virus de ADN circular de
doble hebra con artrópodos como hospedadores. La
expresión de genes mediada por baculovirus en insectos es
un método de elección y es rentable, dando un rendimiento
mucho mayor de proteína recombinante en comparación
con otros sistemas. Es posible producir proteínas grandes
que dan como resultado la producción de proteínas
biológicamente activas y correctamente procesadas.
Un baculovirus Virus de la poliedrosis nuclear de
Autographa californica (AcMNPV) se usa como vector de
clonación para líneas celulares de insectos. En este poliedro
viral se utiliza la proteína, que se requiere en su hábitat
normal y presenta una alta tasa de transcripción.
86
ción, pero no se necesita en cultivo celular. Por tanto, la
secuencia codificante del gen se reemplaza con ADN
extraño. El gen se transcribe bajo el control de un
potente promotor poliedro con altos rendimientos (~
30% de la proteína celular total). El rendimiento
observado puede variar debido al curso de la infección
viral y al título viral.
La producción de proteína recombinante en células de
insectos requiere mucho tiempo (en comparación con el sistema
bacteriano) ya que el crecimiento celular es lento y el costo del
medio es alto. Cada vez que se requieren células frescas, la
infección viral es letal para las células. También tiene
limitaciones en la realización postraduccional
modificaciones, ya que realiza células de ovario de hámster no siladas (CHO) y glicosilación ligada a N de
crías de hámster. Todas las demás optimizaciones
Las dosis deben ser perfectas, ya que el rendimiento depende
del título del virus y del tiempo transcurrido desde la infección
hasta la expresión. Se prefieren las células de insectos cuando la
proteína activa es difícil de obtener enE. coli sistema.
Se ha utilizado la ingeniería genética para seleccionar
MIMIC ™ (Invitrogen) y SfSWT-3, que son líneas de células
transgénicas que expresan todas las enzimas necesarias
para obtener un patrón de glicosilación complejo unido a N
humanizado. El sistema se ha utilizado ampliamente para
estudios estructurales ya que se pueden obtener proteínas
eucariotas correctamente plegadas en forma secretada
simplificando los protocolos de purificación. Algunos de los
biofarmacéuticos aprobados de la línea celular de insectos
infectados Hi Five son Cervarix (proteína L1 de la cápside
principal truncada C-terminal del papilomavirus
recombinante tipos 16 y 18, utilizada como vacuna contra el
cáncer).
La glicosilación es un problema que se encuentra cuando se
utilizan células de insectos para la producción de proteínas
glicosiladas humanas recombinantes. Se requiere mucha
ingeniería genética para producir una glicosilación similar a la
humana en células de insectos. Por tanto, el sistema preferido
para la producción terapéutica de proteínas humanas es el
sistema de mamíferos (línea celular de ovario de hámster chino).
Debido al tiempo y la dificultad para mantener las células de
insectos, se exploraron las células de mamíferos para la
producción de proteína recombinante. Las células de
mamíferos, debido a sus propiedades de plegamiento,
ensamblaje y modificaciones postraduccionales de proteínas, se
han convertido en el sistema preferido para la producción de
proteínas y ahora representan la principal producción de
proteínas recombinantes.
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
4.6 Producción de proteína recombinante
en células de mamíferos
Células de mamífero: la producción de proteínas complejas
requiere un procesamiento extenso y modificaciones
postraduccionales. Las células de mamíferos tienen la
ventaja de realizar PTM (Fig.4.3) correctamente; secretan
proteína recombinante en el medio en su forma natural,
saltándose así los pasos críticos de renaturalización y
replegamiento que a veces conduce a proteínas inactivas.
Por lo tanto, las principales proteínas terapéuticas (60-70%)
se producen en células de mamíferos principalmente
chinas.
células renales (BHK). Las células CHO son relativamente
fáciles de manipular y sus propiedades favorecen la
producción a gran escala en ellas [24]. Las proteínas
producidas son seguras para su uso en humanos sin
reacciones adversas debido a un patrón de glicosilación
similar. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y
riñón de hámster bebé (BHK) son los productores
prominentes de proteínas recombinantes (Fig.4.4).
Botella de rodillo
Medio
Células CHO
Rotación lenta con humectación
regular y suministro de oxígeno.
Las células se adhieren haciendo un cultivo confluente.
Cosecha de producto
Ampliado por número de
botellas de rodillos en paralelo
Rendimiento hasta 50-200 mg / l
Figura 4.4 La figura muestra el cultivo de células de mamíferos
utilizando botellas rotativas. Estas celdas se mantienen en varias
botellas rotativas. Para las células adherentes, se utilizan perlas
microportadoras. Las células se adhieren a las perlas y las perlas
se mantienen en cultivo en suspensión.
4.6 Producción de proteína recombinante en células de mamífero
En células de mamíferos, los genes se pueden
expresar de forma transitoria o estable. La obtención
de líneas celulares transformadas de forma estable
requiere el uso de algún marcador seleccionable. Otra
ventaja importante de estas células es que se pueden
cultivar en suspensión, en medios sin suero (SF), sin
proteínas y químicamente definidos. El producto es
seguro sin el riesgo de priones de encefalopatía
espongiforme bovina (EEB) de la albúmina de suero
bovino e infecciones de la variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD) del suero humano.
Actualmente, debido a los virus y priones en el plasma
del donante o en las muestras de sangre, los fabricantes
están optando por un medio de crecimiento libre de
plasma / suero para cultivar las líneas celulares. Las células
requieren algunos de estos componentes (albúmina,
transferencia) para su crecimiento. Hoy en día, la albúmina
humana recombinante está disponible como insulina
humana (producida enE. coli y levadura) y transferrina
humana recombinante libre de animales derivada de
levadura está disponible. Estos apoyan el cultivo de células
de mamíferos sin plasma. De lo contrario, las células CHO
pueden diseñarse para producir su propio factor de
crecimiento de transferencia o similar a la insulina. La
proteína terapéutica obtenida por células de mamífero se
trata y prueba para detectar la presencia de agentes
patógenos o virus como contaminantes. Los productos
terapéuticos obtenidos durante el procesamiento se tratan
con varios agentes para eliminar virus inactivos, pero la
presencia de virus asintomáticos presenta un riesgo grave.
La técnica común de inactivación de virus es usar solvente /
detergente, que es efectivo contra virus desarrollados en
lípidos comovirus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus
de la hepatitis B y C (VHB y VHC), humano T-virus
linfotrópico celular(HTLV) y virus del Nilo Occidental (WNV).
Los virus no desarrollados en lípidos, como los parvovirus,
enterovirus y circovirus, son resistentes a la inactivación
mediante el tratamiento con detergente solvente. Se ha
demostrado que el virus del herpes humano 8, responsable
del sarcoma de Kaposi, se transmite a través de la sangre y
los productos sanguíneos. Tras los brotes, se impusieron
requisitos estrictos a los fabricantes de productos
biológicos y dispositivos médicos. Tales preocupaciones
llevaron a los fabricantes a cambiar a formulaciones finales
a base de azúcar y desarrollar albúmina recombinante libre
de plasma producida en levadura para su uso en la
fabricación biofarmacéutica.
87
La fabricación sin plasma implica la eliminación de
derivados del plasma en cada paso (como el desarrollo
de la línea celular, el procesamiento anterior, el
procesamiento posterior y las formulaciones finales) del
proceso con controles de posproducción adecuados.
Los fabricantes pasaron del uso de suero a medios de
cultivo celular sin suero con medios sin productos de
origen animal y, en última instancia, a medios sin
proteínas, completamente sintéticos definidos
químicamente. El medio consiste en hidrolizados de
proteínas derivados de levadura, soja y trigo con
aminoácidos, péptidos, carbohidratos, vitaminas y
elementos esenciales, que se ultrafiltran para eliminar
cualquier contaminante no deseado [8].
Caso de estudio
El producto terapéutico recombinante utilizado para
aplicaciones clínicas se produjo a partir de células de
mamífero. Las células de mamífero se mantuvieron
en un medio basado en suero / sangre / plasma; por
lo tanto, la presencia de cualquier agente infeccioso
en el producto puede ser perjudicial si no se elimina
correctamente. Las infecciones pueden variar desde
el VIH,coronavirus (síndrome respiratorio agudo
severo (SARS), virus sin envoltura lipídica (NLE) como
circovirus (Torque tenovirus (TTV) y Torque
tenominivirus (TTMV)), VHB, VHC, HTLV (virus
linfotrópico de células T humanas), al Nilo
Occidental virus. También pueden estar presentes
priones que son proteínas infecciosas
autorreplicantes que pueden conducir a una
variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(vCJD).
La transmisión de patógenos fue una preocupación
importante en la fabricación de factor de coagulación
derivado de la sangre. A principios de la década de 1980,
se descubrió que los productos de reemplazo de
factores derivados del plasma, que se usaban para
tratar la hemofilia, estaban contaminados con los virus
del VIH, VHB y VHC. En el año 1984, hasta el 78% de los
pacientes hemofílicos de EE. UU. Estaban infectados por
el VIH y entre el 74 y el 90% estaban infectados por el
VHC. Los parvovirus, B19 (B19V) y PARV4, estaban
presentes como con-
(continuado)
88
manipulador en derivado de plasma factor
VIII. Por lo tanto, la producción requería
urgentemente medidas regulatorias.
Luego vino el primer factor recombinante
VIII, Advate (Baxter), en EE.UU. en 2003.
Advate se produjo en células CHO cultivadas
en medio sin suero y sin proteínas con
péptidos de soja ultrafiltrados con posterior
purificación por cromatografía de
inmunoafinidad. El uso de Advate ayudó a
eliminar el riesgo de transmitir patógenos
sanguíneos emergentes.
Los priones presentan un riesgo grave, ya que son
muy resistentes a la inactivación físico-química.
La etapa inicial de la infección por priones es casi
imposible de detectar en un donante de plasma. Se
ha producido transmisión iatrogénica de priones en
pacientes que recibieron hormonas hipofisarias de
origen humano como hormona del crecimiento
humano (hGH) y gonadotropinas. La ECJ se
transmitió a más de 160 receptores de hGH
pituitaria cadavérica antes de su retirada. Las
gonadotropinas derivadas de la pituitaria cadavérica
para la infertilidad se asociaron con la transmisión
iatrogénica de la ECJ. Más tarde, la hGH y las
gonadotropinas de la pituitaria cadavérica se han
reemplazado por GH recombinante (producida en el
sistema microbiano) y gonadotropinas
recombinantes (producidas en las líneas celulares
CHO).
4.7 Uso de células humanas para la
producción de proteínas
Líneas celulares humanas: la dinepoeritropoyetina
derivada de la línea celular humana (eritropoyetina con
mayor vida útil), elaprasa-irudonato-2-sulfatasa (enzima
lisosomal) y Replagal-alfa-galactosidasa A (hidrolasa
lisosomal) han sido aprobadas por la Unión Europea
(UE). ) o la Administración de Alimentos y
Medicamentos (FDA, EE. UU.). Dado que estos
productos están completamente glicosilados cuando se
expresan en líneas celulares humanas y se utilizan
como terapéuticos en seres humanos.
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
4.8 Transgénicos para la
producción de proteínas
4.8.1 Animales transgénicos
Los animales transgénicos se utilizan con éxito para la
producción de proteínas recombinantes (para más detalles,
consulte el Cap. 5). La producción de proteínas presenta un gran
riesgo en términos de seguridad, ya que podría producirse la
transmisión de agentes infecciosos, respuestas alérgicas,
reactividad inmune y respuestas autoinmunes.
ATryn fue el único biofarmacéutico recombinante
aprobado (aprobado en 2006 por la agencia médica
europea y en 2009 por la FDA) que utiliza animales
transgénicos. Contiene antitrombina humana (432AA)
con 15% de restos glicosilados y se secreta en la leche
de cabras transgénicas.
Se negó la aprobación a la rhucina destinada a los
ataques agudos de angioedema en pacientes con
deficiencia congénita de la actividad del inhibidor de C1,
obtenida de un conejo transgénico. Se están explorando
plantas transgénicas como productoras de proteínas
recombinantes para usos de investigación y diagnóstico.
4.8.2 Plantas transgénicas
La obtención de proteínas terapéuticas de su fuente natural
representa una amenaza para la propagación de enfermedades.
Por tanto, los sistemas alternativos para la producción de
agentes terapéuticos tienen sus propios beneficios. La
agricultura molecular en plantas se ha explorado ampliamente
para la producción de proteínas farmacéuticas recombinantes.
Sus ventajas son el bajo costo, la alta producción en masa, la
ampliación, la falta de patógenos humanos y la adición de PTM
eucariotas. La primera proteína recombinante obtenida en 1986
a partir de plantas de tabaco fue la hormona del crecimiento
humana. Sin embargo, a veces los PTM específicos de plantas
pueden provocar una reactividad inmunitaria adversa.
La producción de proteínas heterólogas recombinantes en
plantas es simple y se utiliza para la producción de proteínas no
naturales como fragmentos Fv de cadena sencilla (ScFv). El alto
rendimiento de proteína recombinante es el objetivo principal
del sistema de producción en plantas transgénicas. Por lo tanto,
se diseñan construcciones y vectores de expresión apropiados
para lograr altos rendimientos de los productos génicos
modificados [7, 12].
4.9 Desafíos de la producción de proteínas terapéuticas
Producción de proteínas en el sistema vegetal
El transgén en la construcción de expresión es
una estructura quimérica ya que está rodeado
por varios elementos reguladores activos. Los
sitios de poliadenilación juegan un papel
importante para el alto nivel de expresión del
transgén.Virus del mosaico de la coliflor(CaMV) El
promotor 35S funciona bien con dicotiledóneas.
Es un promotor constitutivo fuerte que se vuelve
más activo duplicando la región potenciadora.
Sin embargo, en las monocotiledóneas el
promotor de ubiquitina-1 de maíz es el promotor
preferido. La presencia de un intrón en el 5′ -
región sin traducir (5′ -UTR) mejora la
transcripción en monocotiledóneas.
Para obtener un alto rendimiento de la
proteína, se pueden considerar adecuadamente
varios factores:
• La incorporación de sitios de poliadenilación
puede ser de transcripciones de CaMV 35S
o del Agrobacterium tumefaciens nos gen
o el gen pea ssu.
• El rendimiento se puede controlar colocando
el gen bajo el control del promotor que
está activo en un tejido particular o etapa
de desarrollo o ambiente particular (por
ejemplo, glutelina de arroz, legumina de
guisante).
• Uso de promotor inducible (p. Ej., Hidroxil-3-
metilglutaril CoA reductasa-2 de tomate
(HMGR2)) que tiene un sistema de
activación genética mecánica desarrollado
por Cramer (Crop Tech Corp., Virginia, EE.
UU.). La transcripción comienza cuando las
hojas de tabaco recolectadas se cortan
durante el procesamiento.
• El sesgo de codones en la planta huésped puede
superarse mediante la ingeniería del transgén
en posiciones, lo que podría provocar el
truncamiento y / o incorporación incorrecta, o
ralentizar el proceso.
(continuado)
89
• El direccionamiento subcelular también es un
factor muy importante que afecta el proceso
de plegado, ensamblaje y modificación
postraduccional y se puede lograr de manera
eficiente mediante la inclusión de un péptido
señal N-terminal.
• Posición de integración transgénica.
• Estructura del locus transgénico.
• Número de copia del gen.
• Presencia de copias transgénicas truncadas
o reorganizadas.
• Pueden usarse etiquetas de afinidad como los
epítopos His o FLAG para facilitar el proceso
de purificación; sin embargo, estas
modificaciones no solo afectan la estructura
primaria sino también las propiedades de la
proteína.
Figura 4.5 muestra el vector general
pCAMBIA (es de tamaño pequeño (7-12 kb)
mantenido en un alto número de copias con
replicón pVS1 que imparte resistencia al
cloranfenicol o kanamicina y alta estabilidad
en Agrobacterium) que se utiliza para la
expresión transgénica en las plantas. El vector
modificado ha mostrado éxito en la
producción de insulina.
Hoy en día, el sistema vegetal está diseñado de manera
eficiente para producir hormona de crecimiento humana,
albúmina de suero humano, eritropoyetina, interferón α,
anticuerpos y ScFv, toxinas, vacunas de subunidades e
insulina [20].
4.9 Desafíos de la producción de
proteínas terapéuticas
Con la creciente demanda del consumidor, las
empresas están tratando de aumentar la productividad
[17]. Algunos desafíos con la producción de proteínas a
gran escala son:
90
Promotor CaMV 35S
Lac Z alpha
Sitio de clonación múltiple
Promotor CaMV 35S
Gen de selección de plantas
Estructura general de
CaMV 35S poliA
Borde en T (izquierda)
Gen de selección bacteriana
pBR322 ori
Figura 4.5 La figura muestra la estructura del vector pCAMBIA
(cambia.org) utilizado para la transformación de plantas. El
vector tiene promotor CaMV35S, sitio de clonación múltiple y
1. Pérdida de expresión: para un alto rendimiento, es muy
importante que el gen de interés proporcione una
producción adecuada de proteínas. Sin embargo, la
expresión puede perderse debido a muchos factores, como
si hay cambios estructurales en el gen recombinante o la
inactivación o desaparición del gen de la célula huésped.
Otros factores que influyen en el rendimiento pueden ser el
aumento del número de copias del inserto, el
mantenimiento de la temperatura óptima y la toxicidad de
la proteína expresada para el hospedador. La integración
cromosómica del gen extraño podría superar el problema
de la estabilidad de la expresión, pero en un sistema basado
en plásmidos, un alto número de copias conduce a un
mayor rendimiento.
2. Procesamiento postraduccional: el plegamiento de
proteínas requiere foldasas (acelera el plegamiento de
proteínas) y chaperonas (previene la formación de
proteínas de intermedios de plegamiento insolubles no
nativos). La glicosilación es una PTM compleja que
requiere pasos y enzimas consecutivos. La glicosilación
es importante ya que determina la estabilidad,
solubilidad, antigenicidad, plegamiento, localización,
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
Nco yo Gen reportero
Bgl I
Spe I
Nhe yo
Etiqueta de histidina
Pml I
Bst EII
Nos Poly-A
Borde en T (derecha)
pVS1 sta
Vectores de pCAMBIA
representante de pVS1
pBR322 bom
gen informador (se pueden utilizar GUS o GFP). El vector se puede
modificar para expresar genes para insulina (tomate) o antígeno de
superficie Hep-B (HBsAg) para terapias recombinantes.
actividad biológica y vida media de circulación. Es
necesario obtener proteínas correctamente glicosiladas
y plegadas para uso terapéutico. En procariotas, con el
descubrimiento del sistema de N-glicosilación en
Campylobacter jejuni, se desentrañaron varios otros
sistemas de O-glicosilación en bacterias patógenas y
simbióticas. La producción de proteínas recombinantes
se realiza comúnmente mediante el uso deE. coli,
levadura o líneas celulares derivadas de insectos (SF9),
ratones (SP2 / 0) o CHO, pero obtener PTM
completamente humanos es una tarea desafiante. Las
líneas celulares de mamíferos de origen roedor de uso
común (tales como SP2 / 0, CHO o BHK) pueden realizar
una glicosilación similar a la humana. Sin embargo,
faltan algunos componentes humanos (como la
sialilación con enlaces 2,6) y se ha encontrado que
varios componentes no humanos aumentan
significativamente (galactosa terminal unida a otra
galactosa o ácidos siálicos terminales), lo que aumenta
el alto riesgo de inmunogenicidad. reacciones. Por esta
razón, las líneas celulares humanas
4.10 Algunos biofarmacéuticos importantes
proporcionar un patrón de glicosilación humano ha
aumentado la atención, y se están haciendo esfuerzos
para el desarrollo de nuevas líneas celulares de
glicoingeniería para la producción de proteínas
terapéuticas completamente glicosiladas.
3. La sobreexpresión de proteína terapéutica podría
resultar en la formación de cuerpos de inclusión en el
sistema procariota. La rápida acumulación de proteínas
intracelulares y la expresión de proteínas grandes
aumentan la probabilidad de agregación. La agregación
protege a las proteínas de la proteólisis y puede facilitar
la recuperación de proteínas. Cuando la proteína
expresada es tóxica para el huésped, la presencia de
proteína en el cuerpo de inclusión tiende a protegerlo.
Precauciones La producción de proteínas recombinantes
requiere algunas precauciones que resultan en una pérdida de
rendimiento y / o producto:
1. Contaminación: En cualquier etapa, la contaminación
puede ocurrir de cualquier fuente. Representa un
gran desafío y puede ser adverso cuando el material
contaminado se destina al uso humano.
2. Respuesta inmune: Para el agente terapéutico, el cuerpo
puede generar reacciones inmunes que conducen a la
deposición de complejos inmunes en varios tejidos, y
puede ocurrir una condición de choque anafiláctico (por
ejemplo, cuando se pierde algún agente esencial desde
el nacimiento como el factor VIII, entonces el paciente
puede generar una respuesta de anticuerpos contra el
tratamiento). Esto también ocurre cuando se usan
anticuerpos como agentes terapéuticos en el
tratamiento de una variedad de cánceres.
3. Agregación de proteínas: cualquier condición no
funcional puede resultar en agregación o pérdida de
actividad de la proteína recombinante.
4. Modificaciones postraduccionales y plegamiento: después de
la purificación, se requieren las modificaciones y el
replegamiento adecuados para la terapéutica.
5. Formación de enlaces disulfuro: estabiliza la estructura de las
proteínas; por lo tanto, se requieren estrategias para una
vía de excreción extracelular específica o sobreexpresión de
chaperonas para una producción óptima.
6. Degradación: A veces, las proteínas, que son activas en las
células huésped, como las proteasas o las sustancias
químicas que modifican las proteínas, pueden degradar la
proteína recombinante (p. Ej., El interferón PEG se modifica
91
tener polietilenglicol con presencia prolongada y
reducción de la degradación enzimática y
aclaramiento renal, extendiendo así su presencia
con menor inmunogenicidad) [17].
4.10 Algunos importantes
Biofarmacéuticos
4.10.1 Activador de plasminógeno tisular
(tPA)
El accidente cerebrovascular isquémico y el infarto de
miocardio son una de las principales causas de morbilidad y
mortalidad cardiovascular en el mundo. Los agentes
trombolíticos importantes son la uroquinasa (obtenida de la
orina), el activador del plasminógeno tisular (tPA) y la
estreptoquinasa (obtenida de bacterias). Entre estos, el t-PA
se utiliza en gran medida comercialmente. Los activadores
del plasminógeno son serina proteasas, que son
responsables de la conversión de la proenzima
plasminógena inactiva (Plg-una glicoproteína de cadena
sencilla) en serina proteasa llamada plasmina (Plm). La
plasmina degrada la red de fibrina de los coágulos
sanguíneos (Fig.4.6a). Hay dos grupos de activadores del
plasminógeno no relacionados inmunológicamente, el PA
de tipo uroquinasa de 55 kDa (u-PA) y el PA de tipo tisular
de 72 kDa (t-PA) (EC 3.4.21.68). El t-PA es el activador
vascular fisiológico que consta de una sola cadena
polipeptídica de 72 kDa que consta de 527 aminoácidos.
Muestra una fuerte actividad en presencia de fibrina [23].
Los inhibidores potenciales de la cascada
trombolítica son el inhibidor del activador del
plasminógeno tipo I (PAI-1 o serpina E1) y el PAI-2
(secretado por la placenta y presente en una cantidad
significativa durante el embarazo). Actúan compitiendo
con t-PA por los sitios de unión a la fibrina, evitando así
la cascada fibrinolítica. PAI-1 se compleja con t-PA para
unirse a la fibrina. Por lo tanto, t-PA truncado en el que
los residuos responsables de interactuar con PAI-1
(296-299) se reemplazan con cuatro aminoácidos de
alanina y tres dominios (dedo, factor de crecimiento
epidérmico (EGF) y dominios kringle 1)) se eliminan. y se
añadió tetrapéptido quimérico Gly-His-Arg-Pro (GHRP)
con alta afinidad por la fibrina. Reteplasa es el mutante
de deleción con un
92 4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes

B Líneas celulares CHO transfectadas para

el gen del plasminógeno tisular Hámster chino
activador líneas de células de ovario

Clones seleccionados

con antibiótico

a
Plasminógeno
Transfectado

plasminógeno tisular Celda CHO Antiespumante

Activador (-tPA) líneas

expresando sonda de pH Oxígeno disuelto
Plasmina
truncado Investigacion

Hechos t-PA
mutante
sobre
en CHO- Impulsores
Fibrina DG44 en
suero gratis Medio
Fibrina medio en
degradado biorreactor
Biorreactor de tanque agitado
Coágulo de sangre eliminado

Purificación

Alto rendimiento de activador

de plasminógeno tisular

Figura 4.6 La figura muestra la función y producción del activador del plasmina. (B) Esta figura muestra la producción de t-PA
plasminógeno tisular. (a) Esta figura muestra la función del t-PA que truncado en la línea celular CHO DG44. La forma mutada de t-PA
ayuda en la degradación del coágulo de sangre al degradar la fibrina es resistente a la inhibición por el inhibidor del activador del
mediante la activación del plasminógeno en plasminógeno y tiene una mejor eficacia en el uso clínico.

semivida prolongada, en la que se eliminan los
dominios finger, EGF y kringle 1 de la molécula de
longitud completa; por tanto, no se inhibe.
La deficiencia de PAI conduce a una fibrinólisis excesiva
y diátesis hemorrágica (como la deficiencia de factores de
coagulación). La tiplaxtinina es el inhibidor y se utiliza para
remodelar los vasos sanguíneos [2].
4.10.1.1 Producción
El activador del plasminógeno tiene una gran relevancia
clínica para el tratamiento de accidentes cerebrovasculares
e infartos de miocardio. Para la producción de t-PA,E. coliy
el sistema de levadura no funcionó correctamente debido a
la falta de modificación postraduccional y
sobreglicosilación, respectivamente.
Una nueva forma truncada de t-PA con una afinidad
de fibrina mejorada y una mayor resistencia
La tancia a PAI-1 se expresó en un sistema de expresión
CHO DG44. La proteína terapéutica se produjo en líneas
celulares CHO DG44 transfectadas de forma estable.
Estas líneas celulares se mantuvieron en medio sin
suero, con glutamina, hipoxantina y timina en un
biorreactor de tanque agitado. Las células se cultivaron
a 37 ° C, 140 rpm con 5% de CO2 y 85% de humedad.
Luego se purificó la proteína, con mayor rendimiento
(Fig.4.6b).
4.10.2 Factor VIII
El factor VIII es uno de los factores importantes de todos los
factores de coagulación de la sangre. La deficiencia de factor
VIII causa un trastorno hemorrágico llamado hemofilia A. La
hemofilia puede ser de dependencia leve a grave.
4.10 Algunos biofarmacéuticos importantes
dependiendo de la concentración de factor VIII en el
cuerpo. En la deficiencia moderada y grave de factor
VIII, puede haber episodios de hemorragia espontánea
en las articulaciones. La hemofilia A afecta a 1 de cada
5.000 a 10.000 hombres. La terapia de reemplazo es la
opción de tratamiento para los hemofílicos, ya sea con
factor VIII derivado de plasma humano (pdFVIII) o FVIII
recombinante (rFVIII) [21].
Se está probando la transfección de cultivos de células
HEK 293 en suspensión sin suero para obtener un
rendimiento óptimo. El factor VIII recombinante (rFVIII) se
produce cultivando células de mamíferos como riñón de
hámster bebé (BHK) o células de ovario de hámster chino
(CHO), utilizando biorreactores a gran escala. Se realizan
estandarizaciones para maximizar los rendimientos.
4.10.3 Insulina
La insulina es una hormona peptídica que consta de 51
aminoácidos. Es secretado por las células β de los
islotes de Langerhans del páncreas. La hormona es
responsable de mantener un nivel normal de glucosa
en sangre en sangre. La insulina se almacena en forma
de proinsulina que contiene dos cadenas polipeptídicas,
A y B, y está conectada con un tercer péptido (cadena
C), que antes de la secreción se escinde con la
producción de insulina y cadena C. La escisión da como
resultado la eliminación de la cadena C, y la cadena A
(21 aminoácidos) y la cadena B (30 aminoácidos) se
unen mediante un enlace disulfuro para formar insulina
madura.
Al principio, se hicieron esfuerzos para aislar el ARNm
de preinsulina y proinsulina de islotes de ratas de
Langerhans de páncreas y para sintetizar úlceras sangrantes y SIDA. ADNc.
Posteriormente, se insertó en un plásmido. La hormona del crecimiento humana recombinante
Los plásmidos recombinantes se transfirieron al
E. coli células, que secretaban proinsulina [4, 5, 6, 19]. Los
científicos han sintetizado químicamente secuencias de
ADN para dos cadenas, A y B, de insulina y se han insertado
por separado en dos plásmidos pBR322 junto al gen de la
β-galactosidasa. Los plásmidos recombinantes se
transfirieron por separado aE. coli células que secretaron la
cadena de β-galactosidasa-A fusionada y la cadena de β-
galactosidasa-B por separado. Estas cadenas se aislaron en
forma pura separándolas de la β-galactosidasa con
rendimientos de
93
aproximadamente 10 mg / 24 g de células sanas y
transformadas. La producción de insulina recombinante se
muestra en (Fig.4.7a, b).
4.10.4 Hormona de crecimiento humano
(HGH)
La hormona del crecimiento es producida por el lóbulo
anterior de la glándula pituitaria y se libera en múltiples
pulsos. La hGH está codificada por el grupo de genes
GHN (una matriz de cinco genes estrechamente
relacionados), que se localiza en el cromosoma 17.
Pertenece a una familia de genes diversa que ha
evolucionado por eventos de duplicación de genes y
tiene mucha similitud estructural y algunas funciones
comunes. De las diversas formas, la forma
predominante de hGH es la proteína de 22 kDa de 191
aminoácidos con dos enlaces disulfuro.
La GH no controla las funciones directamente, pero actúa
sobre ciertas hormonas o somatomedinas por su actividad, por
ejemplo, el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1).
Tiene un amplio espectro de funciones que desempeñar como
promoción del crecimiento de huesos largos, promoción del
desarrollo normal de los órganos sexuales durante la pubertad,
regulación del metabolismo, estimulación del crecimiento y
reparación de tejidos, efecto anabólico / anti-catabólico a través
de una mejor retención de nitrógeno, modulación de los huesos
densidad mineral y metabolismo a lo largo de la vida,
proliferación de algunos tipos de células del sistema
inmunológico, estimulación del apetito y descomposición de las
grasas (lipólisis). En condiciones clínicas, la terapia de la
hormona del crecimiento se administra en el tratamiento del
enanismo, fracturas óseas, quemaduras de la piel,
(rhGH) es de 22 kDa y consta de una cadena larga de
aminoácidos. Se utiliza en los trastornos por deficiencia de
la hormona del crecimiento. En niños, se usa para
anomalías del crecimiento como baja estatura y se usa en
insuficiencia renal crónica. La terapia de la hormona del
crecimiento también está aprobada para la deficiencia de la
hormona del crecimiento en adultos. La GH es una de las
hormonas más utilizadas con un mercado estimado de más
de 1.700 millones de dólares. Una larga experiencia en su
administración ha demostrado que la terapia es segura y
eficaz en diversas condiciones de anomalía del crecimiento.
94
a B
Cadena de insulina A Cadena de insulina B
con B-galactosidasa con B-galactosidasa
E. coli transformada
Selección y expresión de fusión recombinante
proteína
Escisión por bromuro de cianógeno de la proteína de fusión
en ácido fórmico al 70% a temperatura ambiente
Renaturalización y plegamiento en condiciones adecuadas
Una cadena
(21 aminoácidos) Cadenas de insulina A y
B con puentes dislfuro
Cadena B
(30 aminoácidos)
Figura 4.7 La figura muestra la producción de insulina. (a) Las
cadenas A y B de la insulina se clonan por separado en el vector. Se
realiza la transformación y, después de la selección, se obtiene la
proteína recombinante para los genes de las cadenas A y B. La
escisión mediante el uso de bromuro de cianógeno elimina la
Anteriormente se utilizó hGH derivada de la
hipófisis, pero posteriormente se prohibió cuando se
encontró asociada con la enfermedad de Creutzfeldt-
Jakob. Debido a la tecnología del ADN recombinante, se
produjo hGH recombinante segura y abundante en
varios sistemas heterólogos. Como la hormona del
crecimiento humana no glicosilada era biológicamente
activa, el sistema preferido para su producción esE. coli,
lo que permite su producción rápida y económica en
grandes cantidades [14].
La hGH recombinante (rhGH) ahora se usa para
tratar:
• Niños de baja estatura con deficiencia de GH (GHD).
• Aceleración de la cicatrización de heridas.
• Aumento de los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)
-1.
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
Gen de la proinsulina
clonado en vector
Transformación, selección y expresión
de proteína recombinante
La proinsulina humana auténtica se
divide para producir insulina y cadena C
Insulina humana biosintética
Genentech en acuerdo con Eli Lilly Inc. produjo
HUMULIN o insulina humana biosintética (BHI)
proteína bacteriana. La proteína se renaturaliza y proporciona las
condiciones adecuadas para el plegado. (B) Esta figura muestra la
producción de insulina a partir del gen de la proinsulina que produce
insulina y péptido C. Este es el método preferido para la producción
de insulina humana biosintética.
• La rhGH aumenta el IGF-1, la osteocalcina, el propéptido
de procolágeno tipo I (PICP) y la densidad ósea cuando
se administra a niños con GHD.
Para una productividad óptima, se prefieren
promotores inducibles fuertes como IPL, IPR, trc y T7 en
E. coli. Son ventajosas ya que impulsan la sobreproducción
de proteínas recombinantes. Aparte deE. coli, se probó la
expresión de somatotropina humana (hST) en una forma
ligada por enlaces disulfuro, biológicamente activa, en
cloroplastos de tabaco. La hormona se usa para el
tratamiento del enanismo hipopituitario en niños; otras
indicaciones son el tratamiento del síndrome de Turner, la
insuficiencia renal crónica, el síndrome de emaciación por
VIH y posiblemente el tratamiento de los ancianos. La
deficiencia de la hormona del crecimiento en humanos
ocurre tanto en niños como en adultos [18, 22].
4.10 Algunos biofarmacéuticos importantes
4.10.5 Interferones
Los interferones son un grupo de proteínas que se
secretan en respuesta a infecciones virales. La
resistencia impartida por los INF es de corta duración y
no dura para siempre. Son una familia de proteínas
naturales que son producidas y secretadas por todas
las células (INF-α e INF-β) y linfocitos (INFγ). Todos estos
modulan la respuesta de las células y el sistema
inmunológico a virus, bacterias y cáncer.
Los interferones son producidos por una línea
celular establecida (linfoblastoide) o por células frescas
aisladas de la sangre. La producción implica inducción
con virus y cebado (incubación con algo de interferón)
con interferón, lo que da como resultado un mejor
rendimiento. La cromatografía de afinidad con
anticuerpos monoclonales empaquetados en la
columna ha ayudado en la purificación de interferones.
Pero antes del uso clínico, la eliminación o inactivación
del virus es muy importante. La terapia con interferón
se usa para cánceres e infecciones virales (INF-α),
esclerosis múltiple (INF-β) y enfermedad
granulomatosa crónica (INF-γ). Multiferon es interferón-
α natural, que consta de varios subtipos. En algunos de
los cánceres como el carcinoma de células de Merkel,
los interferones de tipo I (multiferón, que es una mezcla
de varios subtipos de INF-α e INF-β) son muy eficaces.
En el Cap.11, los interferones se mencionan en la
terapéutica de proteínas. El interferón se comercializa
como Roferon-A, Infergen, Intron A, etc.
4.10.6 Eritropoyetina
Los factores de crecimiento hematopoyéticos consisten
en citocinas y hormonas proteicas producidas por el
cuerpo que gobiernan la producción y maduración de
las diversas células producidas durante el proceso de
hematopoyesis en la médula ósea a partir de células
madre hematopoyéticas. Las células precursoras en
presencia de un factor de crecimiento particular se
diferencian y se convierten en un tipo de célula
especializado como monocitos, macrófagos, linfocitos o
glóbulos rojos.
Uno de los factores de crecimiento importantes es la
eritropoyetina, que es una hormona proteica producida por
un tipo específico de células en el riñón. En la presencia
95
de eritropoyetina, las células progenitoras se estimulan en
la médula ósea para formar eritrocitos maduros (glóbulos
rojos). Por tanto, los pacientes con enfermedad renal
crónica son incapaces de mantener una cantidad adecuada
de eritropoyetina para el desarrollo normal de eritrocitos
en sangre, lo que da como resultado un bajo número de
glóbulos rojos y la consiguiente anemia. Estos pacientes
requieren transfusión de sangre o eritropoyetina del
exterior. Como el suministro está limitado a partir de la
fuente natural que son las células renales, se comercializa
una eritropoyetina humana recombinante EPOGEN®, que
es el nombre comercial de Amgen para la epoyetina alfa,
para la enfermedad anémica que involucra a la
eritropoyetina. El gen humano que codifica la
eritropoyetina se clonó en la línea celular de ovario de
hámster chino para la producción de la proteína humana.
Esta línea celular se sigue utilizando hoy en día para la
producción de EPOGEN®.
La vida media de la eritropoyetina se puede
incrementar incorporando la glicosilación del factor de
crecimiento proteico. Por tanto, la darbepoetina-α es un
análogo que está diseñado para dos aminoácidos
adicionales que son sustratos para la glicosilación. Por
tanto, la producción se realiza en líneas celulares CHO; el
producto tiene cinco cadenas de azúcar unidas a N y tiene
una vida casi tres veces más larga que la eritropoyetina.
4.10.7 Factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF)
El PDGF regula el crecimiento y la división celular y desempeña
un papel importante en la formación de vasos sanguíneos
(angiogénesis), el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de
vasos sanguíneos ya existentes en el tejido, y puede actuar en la
estimulación autocrina y paracrina del crecimiento celular in
vivo. El PDGF desempeña un papel en el desarrollo, la
proliferación celular, la migración celular y la angiogénesis y se
ha relacionado con la aterosclerosis, la fibrosis y las
enfermedades malignas.
El PDGF tiene cinco isoformas diferentes: PDGFA,
PDGFB, PDGFC, PDGFD y heterodímero AB. PDGF-A
y PDGF-B tienen un 60% de similitud en la secuencia
de aminoácidos, pero los experimentos sugieren
diferentes funciones biológicas para las dos cadenas
y diferentes ubicaciones de estas bajo diferentes
controles transcripcionales. PGDF-AA se libera en el
medio y PDGF-BB son insuficientemente
96
secretados y permanecen unidos a la membrana
plasmática, y de estos PGDF-BB y PDGF-AB son
mitógenos fuertes y probablemente son
responsables de las funciones biológicas de PDGF. El
receptor de PDGF (PDGFR) es el receptor de tirosina
quinasa (RTK) (tipo alfa y beta). Tras la activación por
PDGF, estos receptores se dimerizan, lo que lleva a
la autofosforilación de varios sitios en su dominio
citosólico. El PDGF es un mitógeno que promueve la
proliferación de fibroblastos y células de músculo
liso in vitro.
El PDGF muestra una heterogeneidad considerable con
tamaños de 27 a 31 kDa; sin embargo, el PDGF purificado
es una proteína catiónica de 30 kDa. El factor de
crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante
(rh-PDGF) fue la primera proteína recombinante aprobada
por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados
Unidos para el tratamiento de úlceras crónicas del pie en
pacientes diabéticos (Regranex, Ethicon Inc. Somerville, NJ).
Tiene el potencial de usarse en la regeneración ósea y
aumentar la densidad ósea en huesos largos y columna
vertebral. El PDGF se produce comercialmente utilizandoE.
coliy células de mamíferos.
4.10.8 Factor de crecimiento epidérmico
(EGF)
La proteína EGF humana tiene 53AA y tres enlaces
disulfuro intracelulares y desempeña un papel
importante en la regulación del crecimiento y la
proliferación celular. Muestra una fuerte homología
secuencial y funcional con el factor de crecimiento
transformante de tipo alfa humano (hTGF alfa), que es
un competidor del sitio del receptor de EGF. El EGF
actúa uniéndose con alta afinidad al EGFR en la
superficie celular y estimula la actividad intrínseca de la
proteína tirosina quinasa. EGF tiene muchas actividades
biológicas. Las observaciones iniciales se centraron en
sus efectos proliferativos sobre fibroblastos,
queratinocitos y células epiteliales. EGF modula la
hormona luteinizante y la hormona tiroidea. EGF se
produce comercialmente por ingenieríaE. coli. También
se están estudiando los otros sistemas para una
producción óptima de EGF [9].
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
4.10.9 Factor de crecimiento de fibroblastos
(FGF)
Los FGF son comúnmente mitógenos con proteínas
multifuncionales con una amplia variedad de efectos
reguladores, morfológicos y endocrinos. Hay 18 FGF de
mamíferos (1-10 y 16-23) que afectan el crecimiento y las
funciones de una amplia variedad de células
mesenquimales, endocrinas y nerviosas. Las funciones de
los FGF en los procesos de desarrollo incluyen la inducción
del mesodermo, el patrón anteroposterior, la formación de
extremidades, la inducción del tubo neural y el desarrollo
del cerebro, y en los tejidos / sistemas maduros, la
angiogénesis, la organización de los queratinocitos y los
procesos de cicatrización de heridas. El FGF es muy
importante durante el desarrollo normal de vertebrados e
invertebrados, y cualquier irregularidad en su función
conduce a una variedad de defectos del desarrollo [1].
FGF1 y FGF2 muestran fuertes propiedades angiogénicas con la
promoción de la proliferación de células endoteliales y la organización física
de células endoteliales en estructuras tubulares y el crecimiento de nuevos
vasos sanguíneos de la vasculatura preexistente. FGF7 y FGF10 (también
conocidos como factores de crecimiento de queratinocitos (KGF) y KGF2,
respectivamente) estimulan la reparación de los tejidos de la piel y las
mucosas lesionados al estimular la proliferación, migración y diferenciación
de las células epiteliales, y tienen efectos quimiotácticos directos sobre la
remodelación tisular. La mayoría de los FGF son proteínas secretadas que
se unen a los heparán sulfatos y, por tanto, pueden quedar atrapados en la
matriz extracelular de los tejidos que contienen proteoglicanos de heparán
sulfato. Esto les permite actuar localmente de forma paracrina. Sin
embargo, la subfamilia FGF19 (incluyendo FGF19, FGF21, y FGF23), que se
une menos estrechamente a los heparán sulfatos, puede actuar de forma
endocrina en tejidos lejanos, como el intestino, el hígado, el riñón, el tejido
adiposo y el hueso. Por ejemplo, el FGF19 es producido por las células
intestinales pero actúa sobre las células hepáticas que expresan FGFR4 para
regular a la baja genes clave en la vía de la sintasa de ácidos biliares; El
FGF23 es producido por el hueso pero actúa sobre las células renales que
expresan FGFR1 para regular la síntesis de vitamina D y, a su vez, afectar la
homeostasis del calcio. El FGF se puede sintetizar usando El FGF23 es
producido por el hueso pero actúa sobre las células renales que expresan
FGFR1 para regular la síntesis de vitamina D y, a su vez, afectar la
homeostasis del calcio. El FGF se puede sintetizar usando El FGF23 es
producido por el hueso pero actúa sobre las células renales que expresan
FGFR1 para regular la síntesis de vitamina D y, a su vez, afectar la
homeostasis del calcio. El FGF se puede sintetizar usandoE. coli como
sistema anfitrión.
4.10 Algunos biofarmacéuticos importantes
4.10.9.1 Potencial Terapéutico
de FGFR
El FGF participa en la estimulación de la vascularización
colateral y la recuperación de la isquemia, así como en la
mejora de la cicatrización de heridas, la regeneración
nerviosa y la reparación del cartílago, y se le ha
denominado alternativamente como factores de
crecimiento "pluripotentes" (capaces de convertirse en más
de un tipo de célula o tejido). y como "promiscuo" (concepto
bioquímico y farmacológico de cómo una variedad de
moléculas pueden unirse y provocar una respuesta de un
solo receptor) factores de crecimiento debido a sus
múltiples acciones en múltiples tipos de células. Los FGF y
el inhibidor de la cinasa del receptor de FGF de molécula
pequeña se utilizan en el tratamiento del cáncer y las
enfermedades cardiovasculares y tienen potencial en el
tratamiento del síndrome metabólico y las enfermedades
hipofosfatémicas:
• El inhibidor de la tirosina quinasa del receptor (Sunitinib)
está aprobado para indicaciones en carcinoma de
células renales y tumores del estroma gastrointestinal.
• Los inhibidores pequeños de FGFR, SU5402, PD173074 y
ácido nordihidroguaiarético, son eficaces en líneas
celulares de mieloma múltiple.
• PD173074 puede inducir la detención del ciclo celular en la administración de NGF recombinante a células
cancerosas de endometrio con FGFR2 mutado.
• Se ha demostrado que el anticuerpo contra
FGFR3 causa apoptosis en modelos de ratón
de mieloma múltiple y cáncer de vejiga.
Por tanto, la inhibición de FGFR puede ser muy eficaz en
el tratamiento del cáncer.
4.10.10 Factor de crecimiento nervioso (NGF)
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es un miembro
importante de la familia de las neurotrofinas. Son importantes
cinco factores proteicos de crecimiento nervioso de la familia de
las neurotrofinas. Regulan el desarrollo del sistema nervioso y
juegan un papel importante en el mantenimiento de la
estructura, plasticidad y reparación del sistema nervioso adulto.
Todas las neurotrofinas son proteínas básicas de
aproximadamente 120AA, comparten una homología de
secuencia del 50% y están muy conservadas en especies de
mamíferos.
97
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una pequeña
proteína secretada que induce la diferenciación y
supervivencia de determinadas neuronas diana (células
nerviosas). Se sabe poco de la acción biológica de la
neurotrofina aparte del NGF. La secuencia de nucleótidos
del ADNc predice que NGF se sintetiza como pre-pro-NGF.
Tras la eliminación de la señal hidrófoba, se genera pro-
NGF de 34 kDa o 27 kDa dependiendo del tamaño del
transcrito. Sin embargo, no se comprende bien el
procesamiento de los precursores en diferentes tejidos. Son
esenciales para el desarrollo normal, el crecimiento y la
diferenciación de las neuronas simpáticas y sensoriales y
también son esenciales para mantener la función normal
de estas células en los adultos. Por tanto, es importante
para la maduración y supervivencia de las neuronas y
previene la degeneración de las neuronas adultas. Aparte
de su importante papel en el sistema nervioso, Se ha
demostrado que posee una acción protectora de la úlcera
por presión humana, la úlcera corneal y el glaucoma. Se
puede observar una reducción de la sensibilidad en la lepra,
la cicatrización de heridas, las lesiones nerviosas y la
diabetes. El NGF puede ayudar a regular la sensibilidad de
las fibras sensoriales y funcionar directa o indirectamente
estimulando otros efectores.
mejorar la sensación y el dolor [13].
Las neuronas colinérgicas del prosencéfalo
basal muestran receptores para NGF; Se han
identificado ARNm específicos para varios NGF
en diferentes áreas del cerebro. La pérdida de
neuronas colinérgicas es una característica
fundamental de la enfermedad de Alzheimer. El
factor de crecimiento nervioso (NGF) estimula la
función colinérgica, mejora la memoria y
previene la degeneración colinérgica en modelos
animales de lesión, sobreexpresión de amiloide y
envejecimiento. El NGF actúa sobre el calcio
intracelular a través del mecanismo del receptor
de tirosina quinasa. El factor de crecimiento
nervioso mejora la regeneración temprana de
exones cortados y también es importante para
mantener el fenotipo bioquímico y morfológico
de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo
basal maduras (BFCNL) después de lesiones o
lesiones del sistema nervioso central (SNC). Por
lo tanto,E. coli.
98
4.10.11 Transformando el crecimiento
Factor alfa (TGF-α)
TGF-α ejerce su función de forma autocrina y endocrina
para varios tipos de células de origen ectodérmico,
incluidas la mayoría de las células epiteliales. Normalmente
es una proteína transmembrana y funciona en la
comunicación celular a través de su capacidad para activar
un receptor tirosina quinasa. El ectodominio de TGF-α se
escinde de una manera altamente regulada, liberando TGF-
α soluble que activa la señalización paracrina. El receptor es
el receptor alfa EGF / TGF; por lo tanto, la atención se centra
en comprender las funciones importantes de la
señalización del receptor de TGF-α y EGF en el desarrollo
del carcinoma.
4.10.12 Transformando el crecimiento
Factor beta (TGF-β)
TGF-β es un gran grupo de proteínas relacionadas. Algunos de
sus miembros familiares incluyen proteína morfogenética ósea
(BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDP). Afecta la
remodelación de tejidos, la reparación de heridas, la
hematopoyesis, la morfogénesis, el desarrollo embrionario, la
diferenciación de células madre adultas, la regulación
inmunitaria (es el factor de cambio de IgA) y la inflamación.
Existe en múltiples formas como TGF-β1, TGF-β2 y TGF-β3. Actúa
a través de la cinasa del receptor de serina / treonina
transmembrana que conduce a la activación de Smads. Actúa
como supresor de tumores durante el inicio del cáncer pero
como promotor durante la progresión del tumor. Tiene un papel
en el control del desarrollo embrionario, la diferenciación
celular, la secreción de hormonas y la función inmunológica. Su
papel como factor de diferenciación mesenquimatosa, con
especial atención a las células musculares, grasas y óseas,
podría proporcionar información sobre su desregulación en
enfermedades del esqueleto y del desarrollo y es el área de
investigación activa. Se produce utilizando líneas celulares CHO.
4.11 Perspectivas futuras
Existe un enorme potencial para futuras terapias que
utilicen proteínas como agentes terapéuticos. Las proteínas
recombinantes no solo son beneficiosas, sino que los
investigadores pueden diseñarlas aún más para mejorar su
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
actividad y permanencia prolongada en el cuerpo, por
ejemplo, ingeniería de anticuerpos monoclonales para que
tengan toxina o radioisótopo o generación de anticuerpos
biespecíficos. Aún así, la tecnología está luchando duro
para convertir las enfermedades completamente en un
texto de libros y tener una sociedad libre de enfermedades
y patógenos.
4.12 Resumen del final del capítulo
• La producción de proteínas con fines
terapéuticos es muy importante no solo por
su acción específica con efectos secundarios
mínimos, sino también por su forma y
funciones únicas.
• En la actualidad, las terapias (enzimas pancreáticas de
páncreas de cerdo o de páncreas de cerdo o inhibidor
de a-1-proteinasa de plasma humano combinado) no se
extraen de sus fuentes nativas (de humanos, animales)
debido al riesgo de transmisión de patógenos. Otros
problemas enfrentados para la extracción de fuentes
nativas fueron la escasa disponibilidad de tejido animal
para la producción, el alto costo de purificación con
menor rendimiento y las reacciones inmunológicas en
los receptores. La mayoría de los agentes terapéuticos
• biológicos se producen mediante el uso de diversas
herramientas y tecnologías avanzadas como la
clonación, la selección, la purificación y el control de la
estabilidad. También es muy importante controlar los
riesgos y los efectos secundarios de la terapéutica
(análisis de seguridad) obtenidos de una amplia gama
de células.
• Los diversos sistemas biológicos están disponibles para
la producción de proteínas recombinantes como
bacterias, sistema fúngico (levadura), células de
insectos, células de mamíferos, células humanas y
plantas y animales transgénicos.
• El sistema de elección depende del costo total de
producción y de la obtención de proteína
completamente funcional y apropiadamente
modificada (PTM) (glicosilación, fosforilación o
correctamente plegada). Todos estos son esenciales
para la actividad biológica de la proteína.
• El sistema bacteriano es el más simple con tiempos
de división celular cortos, fácil mantenimiento, fácil
de modificar y producción rentable. Las bacterias
tienen limitación en la producción de
4.12 Resumen del final del capítulo 99

proteína de gran tamaño y son incapaces de realizar
modificaciones postraduccionales como
glicosilación. La glicosilación es muy importante ya
que afecta la actividad, la vida media y la
inmunogenicidad de la proteína recombinante.
• Debido a las limitaciones, los otros sistemas hospedantes
se utilizaron para la producción, que podrían dar un
mejor producto con reacciones inmunes mínimas y son
rentables. Los sistemas de hongos e insectos se utilizan
para la producción de proteínas, pero a veces dan como
resultado una glicosilación inapropiada. La glicosilación
incorrecta puede resultar en una proteína no funcional
y altamente inmunogénica. Las células de mamífero son
el sistema más preferido para la producción de estas
proteínas. El sistema CHO es el sistema de elección para
(b) Puede realizar fácilmente el empalme de ADN
extraño
(c) Produce proteínas procesadas y debidamente
modificadas.
(Todo lo anterior
4. La limitación de E. coli lo que plantea un problema para la
producción de proteínas recombinantes es: (a) Desviación
de codones
(b) Empalme
(c) Modificación postraduccional
(d) Ninguno de estos
5. El ser eucariota fúngico ofrece enormes
ventajas en la producción de proteínas
recombinantes, pero:
(a) Plegado adecuado de proteínas

la producción de proteínas terapéuticas. Representa (b) Modificación postraduccional

casi el 70% de la producción de todos los productos (c) Hipermanosilación
disponibles en el mercado. (d) Fácil ampliación
6. ¿Con qué vector viral se pueden infectar las células de
• Los productos proteicos están teniendo un papel insectos para la producción de proteína recombinante?
terapéutico importante. Están aprobados para su (a) Retrovirus
comercialización y uso por varias agencias (B) Coronavirus
gubernamentales como la Administración de (c) Baculovirus
Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Unión Europea (d) Parvovirus
(UE). Los medicamentos de biotecnología 7. La línea celular de mamíferos más utilizada es:
recombinante aprobados incluyen productos de (a) BHK
reemplazo, anticuerpos monoclonales, interferones, (b) CHO
vacunas, hormonas, productos naturales (c) HeLa
modificados y muchos otros. Muchos de ellos están (d) Todos estos
en uso y ayudan a aliviar los síntomas o la causa de 8. ¿Por qué se necesita un medio libre de suero o
las enfermedades. plasma en la producción de proteína
terapéutica?
(a) Como su costo es alto, el costo del
Preguntas de respuestas múltiples producto es alto
(b) Riesgo de transmisión de patógenos desconocidos que
1. La función de las proteínas en el cuerpo es: conducen a enfermedades
(a) Inicio de la transcripción (c) La variación en cada lote da como resultado un rendimiento

(b) Mediadores de procesos metabólicos diferente

(c) Actúa como enzimas (d) Ninguno de estos

(Todo lo anterior 9. La primera proteína recombinante lanzada al
2. El propósito de la tecnología del ADN recombinante es: mercado fue:
(a) Los genes se pueden clonar en E. coli (a) Activasa
(b) El producto es rentable (b) Humulina
(c) Pueden usarse células de mamíferos para la (c) Trastuzumab
producción (d) Todos estos
(re. Ninguna de las anteriores 10. Los inhibidores del factor de crecimiento están encontrando un

3. Las ventajas de usar E. coli como hospedante para la lugar en la terapéutica porque:

producción de proteína recombinante son: (a) Los factores de crecimiento son dañinos

(a) Fácil ampliación y requisitos de medios (b) La desactivación del factor de crecimiento conduce a
sencillos un cuerpo sano
100
(c) Se requieren factores de crecimiento para la
progresión de los tumores
(Todo lo anterior
11. La darbepoetina se utiliza para el tratamiento de:
(a) Baja estatura
(b) Anemia
(c) Coagulación de la sangre
(d) Ninguno de estos
Respuestas
1. (d); 2. (b); 3. (a); 4. (c); 5. (c); 6. (c); 7. (b);
8. (b); 9. (b); 10. (c); 11. (b)
Preguntas de revisión
Q1. Cuáles son las ventajas y desventajas
de uso E. coli como huésped para la producción de
proteínas recombinantes?
Q2. ¿Cuál es el papel del sesgo de codones en la expresión
sión de gen extraño?
Q3. ¿Cuáles son las modificaciones postraduccionales? Q4. Escriba
una nota sobre el hospedador fúngico para la producción de
proteínas.
Q5. ¿Cuándo se prefieren las células de insectos para
producción de proteína recombinante?
Q6. Escriba una nota sobre (a) insulina, (b) factor VIII, (c)
GH, y (d) activador del plasminógeno tisular. Q7.
Escriba los nombres comerciales de insulina, tPA y
GH.
Referencias
1. Beenken A, Mohammadi M (2009) La familia FGF:
biología, fisiopatología y terapia Nature reviews.
Drug Discov 8: 235–253
2. Fatemeh D, Barkhordari F, Alebouyeh M, Adeli A,
Mahboudi F (2011) Expresión combinada de TGE-SGE
del nuevo t-PA resistente a PAI-1 en células CHO DG44
utilizando biorreactores desechables con agitación
orbital. J Microbiol Biotechnol 21: 1299–1305
3. Ferrer MN, Domingo EJ, Corchero JL, Vazquez E,
Villaverde A (2009) Fábricas de microbios para fármacos
recombinantes. Hecho de la célula microbiana 8:17
4. Frank BH, Chance RE (1985) La preparación y
caracterización de insulina humana de origen ADN
recombinante. En: Joyeaux A, Leygue G, Morre M,
4 Producción de proteínas farmacéuticas recombinantes
Roncucci R, Schmelck PH (eds) Agentes terapéuticos
producidos por ingeniería genética “Quo Vadis”.
Toulouse-Labege, Simposio Sanofi Group, París
MEDSI, págs. 137–46
5. Galloway JA (1988) Química y uso clínico de la
insulina. En: Galloway JA, Potwin JH, Shuman CR
(eds) Diabetes Mellitus, 9ª ed. Lilly, Indianápolis,
págs. 106-137
6. Galloway JA, Hooper SA, Spradlin CT, Howey DC,
Frank BH, Bowsher RR, Anderson JH (1992)
Proinsulina humana biosintética: revisión de la
química, unión al receptor in vitro e in vivo, estudios
de farmacología animal y humana y ensayo clínico
experiencia. Diabetes Care 15: 666–692
7. Goldstein DA, Thomas JA (2004) Productos biofarmacéuticos
derivados de plantas modificadas genéticamente. QJ Med
97: 705–716
8. Grillberger L, Kreil TR, Nasr S, Reiter M (2009)
Tendencias emergentes en la fabricación sin plasma de
terapias de proteínas recombinantes expresadas en
células de mamíferos. Biotechnol J 4: 186–201
9. Guglietta A, Sullivan PB (1995) Aplicaciones clínicas del
factor de crecimiento epidérmico. Eur J Gastroenterol
Hepatol 7: 945–950
10. Jackson SE (2013) Hsp90: estructura y función. Top Curr
Chem 328: 155-240
11. Kamionka M (2011) Ingeniería de la producción de
proteínas terapéuticas en Escherichia coli. Curr Pharm
Biotechnol 12: 268–274
12. Ma JK, Drake PMW, Christou P (2003) La producción de
proteínas farmacéuticas recombinantes en plantas.
Nat Rev Genet 4: 794–805
13. Manni L, Rocco ML, Bianchi P, Soligo M, Guaragna
M, Barbaro SP, Aloe L (2013) Factor de crecimiento nervioso:
estudios básicos y posibles aplicaciones terapéuticas. Factores
de crecimiento 31: 115-122
14. Martínez JAA, Saldaña HAB (2012) Ingeniería genética y
biotecnología de hormonas de crecimiento, ingeniería
genética - fundamentos, nuevas aplicaciones y
responsabilidades, Prof. Hugo A. Barrera-Saldaña (Ed.),
ISBN: 978-953-307-790 -1, InTech, disponible en: http: //
www.intechopen.com/books/genetic-
engineeringbasics-new-applications-and-
responssibility/ geneticaengineering-and-
biotechnology-of-growthhormones
15. Mayer MP, Bukau B (2005) Chaperones Hsp70:
funciones celulares y mecanismo molecular. Cell
Mol Life Sci 62: 670–684
16. Miralles (2009) Fábricas de microbios para fármacos
recombinantes. Hecho de la célula microbiana 8:17
17. Palomares LA, Mondaca SE, Ramirez OT (2004)
Producción de proteínas recombinantes. En: Balbas P,
Lorence A (eds) De métodos en biología molecular.
Humana Press, Totowa 267: 15–51.
18. Rezaei M, Esfahani SHZ (2012) Optimización de la producción
de hormona de crecimiento humana recombinante en
Escherichia coli. J Res Med Sci 17: 681–685
Referencias 101

19. Riggs AD (1981) Producción bacteriana de insulina humana. Relación de las estructuras de intrones y exones con los
Diabetes Care 4: 65–68 dominios funcionales y estructurales. Proc Natl Acad Sci
20. Soltanmohammadi B et al (2014) Clonación, USA 81: 5355–5359
transformación y expresión del gen de la proinsulina en 24. Wurm FM (2004) Producción de terapias de proteínas
tomate (Lycopersicum esculentum Mill). Jun J Nat recombinantes en células de mamíferos cultivadas. Nat
Pharma Prod 9: 9–15 Biotechnol 22: 1393-1398
21. Swiech K, Kamen A et al (2011) Transfección transitoria
de cultivo de células HEK 293 en suspensión sin suero
para la producción eficiente de rFVIII humano. BMC
Biotechnol 11: 11-114 Algunos recursos seleccionados
22. Tabandeh F, Shojaosadati SA, Zomorodipour A,
Khodabandeh M, Sanati MH, Yakhchali B (2004) Producción www.ibclifesciences.com
de hormona de crecimiento humana inducida por calor www.link.springer.com
mediante cultivo de alta densidad celular de Escherichia coli www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
recombinante. Biotechnol Lett 26: 245-250 www.qjmed.oxfordjournals.org
23. Tor NY, Fredrik E, Lund B (1984) La estructura del gen www.sciencedaily.com
activador del plasminógeno de tipo tisular humano: cor-