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Agricultura abierta. 2019; 4: 400-409

Artículo de investigación

Akbar Hossain *, Sunil Kumar Gunri, Manashi Barman, Ayman EL Sabagh, Jaime A. Teixeira da
Silva

Aislamiento, caracterización y depuración de

Rhizobium cepa para enriquecer la
productividad del maní (Arachis hypogaea L.)
https://doi.org/10.1515/opag-2019-0040
Palabras clave: Cacahuete, nitrógeno, nodulación, Rhizobium
recibido el 16 de noviembre de 2018; aceptado el 18 de mayo de 2019

Abstracto: Maní (Arachis hypogaea L.) es una leguminosa alimenticia

importante en áreas tropicales y subtropicales debido a su capacidad
1. Introducción
para adaptarse a una amplia gama de regiones agroclimáticas. El maní
se cultiva generalmente en suelos pobres en nutrientes y en
Maní, también conocido como maní (Arachis hypogaea
condiciones de secano, por lo que el rendimiento promedio tiende a ser
L.), es una leguminosa alimentaria importante en áreas
muy bajo en relación con el rendimiento potencial. A pesar de que el
tropicales y subtropicales y se cultiva en 94 países en
requerimiento de nitrógeno (N) del maní es mucho mayor que el de los
diferentes regiones agroclimáticas (Tabla
cereales debido a su alto contenido de proteínas, tiene la capacidad de
1). El maní puede crecer en condiciones poco fértiles y de secano. Esto
cumplir con el 60-80% de los requerimientos basados en N a través de
puede explicar por qué el rendimiento en algunos países, como India y
la fijación simbiótica de N a través de sus nódulos radiculares. En su
Nigeria, es más bajo que en Brasil o Argentina, a pesar de que se cultiva
relación simbiótica con las legumbres,Rhizobium fija N, lo que impacta
en un área más grande en los primeros países (FAO 2018). Como
positivamente en el contenido de este nutriente. Este estudio tuvo
resultado, en países donde el maní se cultiva en condiciones pobres en
como objetivo aislar, caracterizar y purificar cepas microbianas de
nutrientes, los agricultores no pueden aumentar el rendimiento (Gunri
Rhizobium específicas del maní en un intento por aumentar la
et al. 2017). Por separado, el requerimiento de nitrógeno (N) del maní
productividad de esta leguminosa. La investigación se llevó a cabo en el
es mucho mayor (150-200 kg ha-1) que los cereales, debido a su alto
laboratorio e invernadero AICRP-Groundnut de la Dirección de
contenido en proteínas; a pesar de esto, el maní es capaz de satisfacer
Investigación, BCKV, en Kalyani, India, durante octubre de 2016 a marzo
el 60-80% de sus requerimientos de N mediante la fijación simbiótica de
de 2017. DosRhizobium los aislados (RhBC y NRA1) se aislaron y
N a través de los nódulos de las raíces y solo el 20-40% del N del suelo,
seleccionaron de cultivos en macetas de maní. Después de 45 días,
lo que afecta el rendimiento (Singh et al. 2003). La alta fertilización a
NRA1 produjo una mayor biomasa vegetal, raíces y brotes más largos,
base de N de los cultivos en algunos países puede explicar la alta
más nódulos y un peso seco de nódulos más alto que el RhBC. NRA1 fue
relación rendimiento / superficie que se muestra en el Cuadro 1.
seleccionado para una futura prueba de campo. Las dos cepas
microbianas aisladas ayudarán en la selección de aislamientos locales
Varios estudios han demostrado que Rhizobium, un Gram-
adicionales para probar su efectividad cuando se cultivan
La bacteria del suelo fijadora de N negativa tiene un impacto
conjuntamente con cultivares de maní locales para aumentar el
positivo en las leguminosas (Gouda et al. 2018), incluido el maní,
rendimiento en suelos con baja fertilidad.
aumentando su productividad y reduciendo los costos de
producción (Lamas et al. 2000). Sin embargo, la leguminosa
Rhizobiumla simbiosis es muy específica (Andrews y Andrews
* Autor para correspondencia: Akbar Hossain, Bangladesh Trigo y Mai- 2017). El-Ghandour y col. (1997) señaló que la inoculación con
ze Research Institute (BWMRI), Dinajpur-5200, Bangladesh, correo Bradyrhizobium aumento de la nodulación y el contenido de N en
electrónico: tanjimar2003@yahoo.com , akbarhossainwrc@gmail.comSunil
las plantas de maní, ahorrando> 50% del fertilizante N
Kumar Gunri, Manashi Barman, Bidhan Chandra Krishi Viswavidyalaya,
recomendado. Bhuiyan y col. (1998) observaron, en comparación
Mohanpur, Nadia, Bengala Occidental, India
Ayman EL Sabagh, Departamento de Agronomía, Facultad de Agricultura, con el control, una mayor nodulación, producción de materia seca
Universidad Kafrelsheikh, 33156 Kafrelsheikh, Egipto y rendimiento de frutos secos en inoculados (conRhizobium sp.)
Jaime A. Teixeira da Silva, Apartado de correos 7, oficina de correos de Miki-cho, cacahuete. Pulatova y col. (1999) informaron que la inoculación de
Ikenobe 3011-2, Kagawa-ken, 761-0799, Japón
tres variedades de maní con la cepa industrial

Acceso abierto. © 2019 Akbar Hossain et al. publicado por De Gruyter. Este trabajo tiene licencia de Creative Commons Attribution 4.0 Li-
incensar.
 Aislamiento, caracterización y depuración de Rhizobium cepa para enriquecer la productividad del maní 401

CIAM0104 Bradyrhizobium sp. (Arachis) aumentó la masa seca de cepa de maní para enriquecer su productividad en suelos de baja
plantas y 1000 semillas, el rendimiento de semillas y el número total de fertilidad.
nódulos. Deshwal y col. (2003) encontraron que las semillas de
cacahuete recubiertas con uno de tresBradyrhizobiumLas cepas (AHR-2,
AHR-5 y AHR-6) mostraron una germinación significativamente
mejorada (hasta un aumento del 26%) y una mayor biomasa de
2. Materiales y métodos
plántulas (principalmente aumentos del 80-90%), número de nódulos
(más de tres -incremento), el peso fresco del nódulo (hasta un aumento 2.1 Ubicación de la investigación
de 10 veces) y el peso promedio del nódulo (aproximadamente un
aumento de tres veces) en comparación con Este estudio fue parte de una formación de investigación avanzada
el control no inoculado. Biswas y col. (2003) señaló que el programa titulado “Aislamiento, caracterización yBradyrhizobium aumentó
significativamente el número de nódulos de maní, el peso de los nódulos, la altura de
purificación de cepas
la planta, el peso de
microbianas los leguminosas
para Arachis
brotes, el peso de las
raíces, el rendimiento de las vainas y el contenido de N. Rahman (2006)hypogaea
encontróL.que mientras
para Bradyrhizobium
enriquecer La inoculación
la productividad mejoró se
”. La investigación
significativamente el rendimiento del maní, la mayoría de los demás atributos del rendimiento
llevó a cabo no sede
en el laboratorio vieron afectados
AICRP-Maní y ensignificativamente.
el invernadero de
Brahmaprakash y col. (2007) encontraron que la planta de nódulos-1 y el
la rendimiento
Dirección dede grano mejoró
Investigación, después
BCKV, de la
Kalyani, inoculación
Nadia, Bengalacon
líquido Rhizobium inoculantes en comparación con los basados en portadores Rhizobium
Occidental, inoculantes
India entre en2016
octubre de maní. In vitrode
y marzo ensayos
2017. Los
realizados por Badawi et al. (2011) mostró queBradyrhizobium fue incapaz de producirexperimentales
procedimientos ácido indol-3-acético (IAA) a diferencia
relacionados de otros
con el aislamiento,
dos rizo-simbiontes, Serratia marcescens y Trichoderma harzianum. Un pakistaní localeRhizobium
caracterización cepade
identificación Rhizobium
mejoró los parámetros
aislados y lade
prueba de
crecimiento vegetativo y rendimiento del maní cv. 'Chakori' en ausencia de fertilizante
eficiencia (Sajidseleccionados
de aislados et al. 2011). Ensecontraste,
describenun malayo local .
a continuación.
Rhizobium La cepa mejoró el crecimiento vegetativo y los parámetros de rendimiento del maní, pero solo cuando se suplementó con
fósforo y fertilizantes nitrogenados (Hasan y Sahid, 2016). En todos estos estudios previos, la producción de cacahuete se incrementó si
unRhizobium o Bradyrhizobium Se aplicó inóculo al suelo.
2.2 Materiales experimentales

Aislar Rhizobium, una variedad de maní de alto rendimiento TG 51

La aplicación de fertilizantes químicos afecta
negativamente al medio ambiente y aumenta los costos de
producción, por lo que se requieren agrotécnicas ecológicas y
rentables para aumentar la producción de maní, incluidas
intervenciones microbianas a través de biofertilizantes como
un Rhizobium inóculo. Aunque varios estudios, como se
documentó anteriormente, han evaluado el efecto de
Rhizobiuminoculación sobre la capacidad de mejorar el
crecimiento y la productividad del maní, existe una necesidad
constante de cribar aislamientos locales y probar su
efectividad contra variedades locales (de Rosália e Silva Santos
et al.2017). Con esto en mente, y considerando la baja
productividad de la producción de maní en la India (Tabla 1), y
los intentos fallidos anteriores de Sharma et al. (2011) y
Pandeeswari y Kalaiarasu (2017) para aumentar el rendimiento
del maní después de la inoculación conRhizobium, nuestro
objetivo fue aislar, caracterizar y purificar un microbiano local
y una línea avanzada TG 71 se cultivaron en macetas separadas
(Figura 1A) y no se inocularon. TG 51 es una nueva variedad de
maní de Trombay (TG), que fue lanzada en 2008 por el Subcomité
Central de Normas de Cultivos, Liberación y Notificación de
Variedades, Ministerio de Agricultura, Gobierno de la India para el
cultivo en ambosrabi y la temporada de verano (octubre-mayo) en
Odisha, Bengala Occidental, Bihar y los estados del noreste de la
India (zona IV). TG 51 es un grupo español (Arachis hypogaea ssp.
fastigiatavar. vulgaris) variedad obtenida en el Centro de
Investigaciones Atómicas de Bhabha (BARC), Trombay mediante el
cruce de TG 26 con Chico en 1998 (Kale et al. 2009). TG 26 es una
variedad de maduración temprana, semienana, erecta con alto
rendimiento de descascarado, alta tasa de crecimiento de la vaina,
alto índice de cosecha y gran eficiencia de partición (Kale et al.
1997; Badigannavar et al. 2002) mientras que Chico es una línea de
germoplasma de maduración temprana seleccionada de PI 268661
(Bailey y Hammons 1975). TG 71 es una línea BARC avanzada.
También es una variedad de maduración temprana, semienana,
erecta con alto rendimiento de descascarado, alta tasa de
crecimiento de la vaina, alto índice de cosecha y línea avanzada de
gran eficiencia de partición para ambosrabi y temporadas de
verano (octubre-mayo) en Odisha, Bengala Occidental, Bihar y los
estados del noreste de la India (BCKV 2016).
402 A. Hossain et al.

2.3 Aislamiento de eficientes Rhizobium aisla
Rhizobium se aisló de los nódulos de las raíces de dos plantas sanas y
en crecimiento activo de cada cultivar mediante el desarraigo con
cuidado de las plantas enteras a los 45 días después de la emergencia,
que se caracteriza por una máxima nodulación, para obtener raíces
intactas con nódulos radiculares contiguos. Los nódulos desprendidos
se lavaron con agua corriente hasta que las partículas de tierra
adheridas se eliminaron por completo, seguido de un lavado en agua
destilada. Los nódulos se sumergieron en una solución de cloruro de
mercurio al 0,1% durante 30 s, seguido de etanol al 70% durante otros
30 sy se enjuagaron minuciosamente (10 veces) con agua destilada
esterilizada (Russell et al. 1982). Nódulos de superficie desinfectada
se transfirieron a tubos de ensayo que contenían 5 mL de agua
destilada esterilizada donde se trituraron con una varilla de vidrio
esterilizada para obtener una suspensión lechosa. Una alícuota de
0,1 ml de esta suspensión se sembró en placas de medio agar
manitol de extracto de levadura (YEMA) (HiMedia, Mumbai, India)
que contenían rojo Congo siguiendo la técnica de la placa de
vertido (Kenasa et al. 2014). El medio YEMA contiene 10,0 g L–1
manitol, 1 g L–1 extracto de levadura, 0,5 g L–1 K2 HPO,4 0,2 g L–1
MgSO 4· 7H 2O, 0,1 g L–1 NaCl, 0,025 g L–1 Rojo congo y 20,0 g L–1
polvo de agar (Kenasa et al.2014). El pH del medio de cultivo se
ajustó a 6,8 ± 0,2 a 25 ° C (Pelczar et al. 1977), luego se
autoclavó. Se vertió medio YEMA esterilizado en placas de Petri
conRhizobium suspensión. Después de medio

Figura 1: (A) Cacahuete (Arachis hypogaea L.) las variedades TG 51 (izquierda) y TG 71 (derecha) se cultivaron en macetas separadas para aislar Rhizobiumaislamientos. (B) puroRhizobium

aislado cultivado en placa con medio YEMA. (C) Prueba de catalasa: la aparición de burbujas de gas indicó la presencia de catalasa en los aislados bacterianos. (D) Prueba de citrato:

después de la incubación durante 24 h, el verde se volvió azul, lo que indica un resultado positivo (es decir, utilización de citrato). (E) Prueba de indol: la formación de un anillo rojo indicó

un resultado positivo (es decir, producción de indol) pero un anillo amarillo indicó un resultado negativo. (F) Prueba del rojo Congo:Rhizobium las colonias formadas en el medio YEMA

rojo Congo son blancas y carecen de la capacidad de absorber rojo Congo del medio YEMA. Los contaminantes comunes sonAgrobacterium colonias en los medios de YEMA.

Agrobacterium absorbe rápidamente el rojo Congo y se vuelve rosa inicialmente y luego se vuelve negro oscuro (arriba a la derecha de la placa de Petri). (G) Prueba de azul de
bromotimol: las muestras positivas son amarillas, lo que indica producción de ácido, después de la incubación durante 48 ha 28 ° C. (H)Rhizobium los aislados (RhBC, NRA1) se

transfirieron a matraces cónicos de 250 ml que contenían manitol de extracto de levadura de 40 ml y se incubaron durante tres días. (I) Semillas preparadas esterilizadas en superficie

para sembrar en macetas. (J1, J2) Semillas secadas al aire conRhizobium los aislados se sembraron en macetas que contenían suelo esterilizado y se colocaron en un invernadero. (K)

Procedimiento de muestreo: las plantas de cada maceta se arrancaron de raíz y se limpiaron a los 45 días después de la inoculación conRhizobium aisla
 Aislamiento, caracterización y depuración de Rhizobium cepa para enriquecer la productividad del maní 403

Tabla 1: Países de todo el mundo que producen maní (con cáscara), enumerados alfabéticamente en términos de área cosechada y rendimiento, incluidas
cifras oficiales, calculadas y no oficiales (FAO, 2018). Los datos presentados son los datos más recientes.

Producir Cosechado Producir

País Superficie cosechada (ha) País
(hg ha-1) área (ha) (hg ha-1)

Argelia 3.391 20,914 Irán (IR) 3.364 43.881

Angola 343.127 7.123 Irak 1.125 33.705
Argentina 341.838 29.286 Israel 3.100 51.613
Australia 6,932 28.250 Jamaica 2.332 12.453
Bangladesh 35.726 17.428 Japón 6.550 23.664
Barbados 9.00 18.440 Kazajstán 30 14.341
Belice 133 10.752 Kenia 13.442 24.516
Benin 159.414 8.607 Kirguistán 190 12.089
Bolivia 19.207 10.823 República Democrática Popular Lao) 26.680 23.688
Botswana 1,145 3.924 Líbano 1,689 33.065
Brasil 154.556 36.542 Liberia 8.009 7.764
Bulgaria 181 21.313 Libia 9.123 18.018
Burkina Faso 420.000 7,993 Madagascar 82.694 7.050
Burundi 13.657 5.378 Malawi 369,987 7.435
Cabo Verde 368 5.236 Malasia 79 29.401
Camboya 18.000 15.873 Mali 432.354 8.658
Camerún 453.826 16.475 México 56.273 17.057
República Centroafricana 112.426 12.020 Marruecos 15.345 23.729
Chad 971.303 10,708 Mozambique 396.644 2.853
China (incluido Taiwán) * 4.541.541 36.741 Myanmar 989.174 15.896
Colombia 1.766 11.264 Namibia 657 3.212
Comoras 1,135 8.426 Nicaragua 42.280 44.081
Congo 52.612 4.995 Níger 771.075 5.882
Congo (RD) 495.000 8.514 Nigeria 2.680.000 11.301
Costa Rica 197 11.366 Pakistán 89.469 9.755
Costa de Marfil 83.019 13.459 Perú 4.089 17.065
Cuba 6.492 10.501 Filipinas 23.522 11.870
Chipre 76 34.474 Ruanda 26.065 4.320
República Dominicana 4.370 13.398 Arabia Saudita 422 40.476
Ecuador 17.966 12.187 Senegal 880.000 8.170
Egipto 58.000 32.908 Somalia 8.199 10.507
Eritrea 3.156 7.253 Sudáfrica 22.600 7.823
Eswatini 5.660 3.951 España 456 29.804
Etiopía 74.861 17.317 República de Corea 4.334 26.293
Gabón 18.012 10.346 Sri Lanka 13.679 20.655
Gambia 118.452 9.274 Sudán 2.315.040 7.888
Georgia 211 9.912 Siria 5.261 26.865
Ghana 336.450 12.400 Tayikistán 2.891 30.001
Grecia 512 35.597 Tanzania (UR) 780.000 7.051
Guatemala 2.027 49.168 Tailandia 19.335 16.574
Guinea 271.242 13.853 Uganda 420.000 5.000
Guinea-Bissau 38.767 11.540 Estados Unidos 626.060 41.186
Guayana 300 6.433 Uzbekistan 1.634 42.984
Haití 42.232 8.810 Venezuela 483 30.455
Hungría 1 9,998 Vietnam 184.792 23.117
India 5.800.000 11.822 Zambia 216.569 7.333
Indonesia 366.256 13.786 Zimbabue 200.000 2.900

* Los valores para Taiwán son 19,562 y 31,608, respectivamente.

404 A. Hossain et al.

solidificadas, las placas de Petri se sellaron con Parafilm (Praxor 2.5.3 Prueba de citrato

Instruments and Scientific Co. (Proxor Group), Porur, Chennai, India)

para evitar la contaminación y se incubaron a 28 ± 1 ° C durante 24-48
h. Blanco, translúcido, elevado y mucilaginosoRhizobium las colonias se
formaron después de 24-48 h de incubación, y las colonias individuales
típicas se volvieron a sembrar 3-4 veces en placas YEMA frescas para
obtener cultivos puros (Figura 1B). La reacción de Gram de los
aislamientos se probó mediante tinción de Gram (Arora 2003) y se
realizaron pruebas bioquímicas en los aislamientos, como se indica a
continuación.
La capacidad para usar citrato se determinó reemplazando el
manitol en agar YEM con una cantidad igual de citrato de sodio
(Ranbaxy Lab. Ltd., SAS Nagar, India) y azul de bromotimol
(Fisher Scientific, Thermo Electron LLS India Pvt. Ltd., Kolkata,
India) (25 mg L–1). Los cultivos frescos en medios modificados
se incubaron durante 48 h (Koser 1923). Después de la
incubación, se indicó un resultado positivo cuando el verde se
volvió azul (Figura 1D).

2.4 Caracterización morfológica de 2.5.4 Prueba de gelatinasa

aislados Rhizobium aisla

Circular Rhizobium Se observaron colonias con un borde liso
elevado y olor a almizcle bajo un microscopio biológico
Olympus CH20i (Vision Micro Systems, Kolkata, India) después
de la tinción de Gram. Los bastones rosados se caracterizaron
como gramnegativos.
Los cultivos en fase logarítmica del caldo YEM se aplicaron con hisopo
sobre la superficie de placas de agar YEM que contenían 0,4% (w/v)
gelatina (India Gelatine & Chemicals Ltd., Vapi, India) para examinar la
actividad de la gelatinasa. Las placas se incubaron a 28 ± 1 ° C durante 7
días (Sadowsky et al. 1983). La formación de una zona clara alrededor
de la cultura indica un resultado positivo.

2.5 Caracterización bioquímica cualitativa de 2.5.5 Prueba de indol

aislados Rhizobium aisla

La prueba de indol siguió el procedimiento de MacFaddin
(2000) y Hemraj et al. (2013). Se preparó medio de caldo de
triptona (Jeevan Chemicals & Pharmaceuticals, Mumbai, India)
2.5.1 Prueba de oxidasa y se vertió en tubos de ensayo de 10 ml (4 ml / tubo de ensayo;
Garg Process Glass India Pvt.Ltd., Mumbai, India) y luego se
esterilizó
Actividad oxidasa de Rhizobium se determinó mediante la prueba de oxidasa en autoclave
(Steel (121 ° de
1961). El reactivo C; 15 psi; 15
oxidasa semin). Rhizobium
preparó se
disolviendo
inoculó
al 1%norte, norte, norte, norte-tetrametil-pag-fenilendiamina (HiMedia) entibia
en agua caldo y se incubóen
y almacenada a 30
una± botella
2 ° C durante
oscura ados días.
25-30 El
° C.
caldo sin inocular
Una tira de papel de filtro (IndiaMART, Kolkata,paraca-dimetilaminobenzaldehído sirvió como control.
e India concentrada) Después
se sumergió de reactivo
en este la y
incubación,
luego se mantuvo 24 Rhizobiumlas colonias (una colonia / tira) se transfirieron a la 1 mlde
tira depapel
reactivo de Kovac
de filtro (alcohol
con una isoamílico,
aguja estéril (es decir, el
método del papel de filtro húmedo). Las colonias positivas para oxidasa se volvieron lavanda, luego de color púrpura oscuro a negro en 5
min. ácido clorhídrico) a cada tubo de ensayo, incluido el control. Los
tubos se agitaron suavemente cada 10-15 minutos y se dejaron
reposar hasta que el reactivo emergió a la superficie. La formación
de un anillo rojo indicó un resultado positivo, pero un anillo
amarillo indicó un resultado negativo (Figura 1E).

2.5.2 Prueba de catalasa 2.5.6 Prueba del rojo Congo

Actividad catalasa (CAT; EC 1.11.1.6) de Rhizobium se
determinó mediante la prueba CAT colocando colonias de 24 h
en un portaobjetos de vidrio y agregando una 2gota
2
de HO al
30% (Merck Life Science Private Limited, Mumbai, India) (Figura
1G). La aparición de burbujas de gas indicó la presencia de CAT
(MacFaddin 1980).
Rhizobium Las colonias que se forman en el medio YEMA rojo
Congo son blancas, translúcidas, brillantes, elevadas y pequeñas.
Los contaminantes comunes sonAgrobacterium colonias en los
medios de YEMA. La mayoríaRizobios, incluyendo Bradyrhizobium,
carecen de la capacidad de absorber rojo Congo, añadido a una
concentración final de 0,0025% (w/v), del medio YEMA (Kneen y
LaRue 1983; Ondieki et al.2017) mientras que Agrobacterium
 Aislamiento, caracterización y depuración de Rhizobium cepa para enriquecer la productividad del maní
absorbe rápidamente el rojo Congo y se vuelve rosado inicialmente y
luego se vuelve negro profundo (Fentahun et al. 2013; Figura 1C).
2.5.7 Prueba de rojo de metilo
Rhizobium se inoculó en tubos de ensayo estériles que contenían
caldo de rojo de metilo-Voges Proskauer (Manasa et al.2017) a 5
ml / tubo de ensayo, se incubó a 30 ± 2 ° C durante dos días,
después de lo cual se agregaron 5 ml de rojo de metilo a cada
tubo . El caldo rojo indica un resultado positivo, pero el amarillo
indica un resultado negativo (Dinesh et al. 2015).
2.5.8 Ensayo de hidrólisis del almidón
Se preparó medio de agar almidón (Hemraj et al. 2013). El
medio se vertió en placas de Petri estériles y se dejó solidificar.
Rhizobium se inoculó en placas de Petri y se incubó a 30 ± 2 ° C
durante 4 días. Después de la incubación, se agregaron 5 mL
de solución de yodo (0.340 g de yodo y 0.660 g de yoduro de
potasio en 100 mL de agua destilada) (Küpper et al. 2011). La
formación de una zona clara alrededor de las colonias indicó
un resultado positivo, es decir, la capacidad de hidrolizar el
almidón (Hemraj et al. 2013).
2.5.9 Ensayo para evaluar la utilización de fuentes de carbono
Rhizobium También se examinó su capacidad para utilizar
varias fuentes de carbono: glucosa, manitol, sacarosa, lactosa,
galactosa, rafinosa, manosa, xilosa y celobiosa (HiMedia). Para
determinar el patrón de utilización de carbono, se agregaron
80 μL de soluciones esterilizadas por filtración al 10% (p / v) de
estos carbohidratos a 5 mL de YEMA sin manitol. El medio se
inoculó con cultivos de crecimiento exponencial (108 células
mL–1) (Kumar et al. 2014). El caldo inoculado se incubó a 28 ± 2
° C con agitación constante (150 rpm). La densidad óptica se
evaluó a 610 nm en un espectrofotómetro Hach DR 3000
(Hach, Loveland, CO, EE.UU.) después de siete días de
incubación como medida del crecimiento.
2.5.10 Prueba de azul de bromotimol (BTB)
YEM se enriqueció con un 1% (w/v) azul de bromotimol (HiMedia) para
identificar selectivamente el crecimiento rápido y lentoRhizobium
aislamientos. Todos los aislados se cultivaron en medio YEM con BTB
añadido. Las cepas positivas de crecimiento rápido fueron amarillas,
405
lo que indica la producción de ácido, después de la incubación durante
48 ha 28 ° C (Shahzad et al. 2012; Figura 1F).
2.5.11 Prueba de Voges-Proskauer
los Rhizobium los aislados se inocularon por separado en tubos de
ensayo que contenían caldo de rojo de metilo-Voges Proskauer a 5
ml / tubo de ensayo estéril y se incubaron a 30 ± 2 ° C durante dos
días. Después de la incubación, se agregaron los reactivos A y B de
Barrit (5 ml cada uno). El desarrollo de un color rojo indicó un
resultado negativo (McDevitt 2009).
2.6 Prueba de eficacia de seleccionados Rhizobium
sobre el crecimiento y la productividad del maní
2.6.1 Preparación de inóculos
Rhizobium Los aislamientos de plantas de maní se probaron en
experimentos con macetas en invernadero. Antes de la inoculación de
semillas de maní, aisladasRhizobium Los aislamientos se cultivaron en
matraces cónicos de 250 mL que contenían 40 mL de YEMA para
Rizobios (Somasegaran y Hoben 1985) y se incubaron en una
incubadora con agitación a 150 rpm durante 3 días (Figura 1H),
agitando solo durante 8 h cada día a 28-30 ° C. Se inoculó un ml (que
contenía 108 células) del cultivo bacteriano en su etapa logarítmica de
crecimiento a semillas esterilizadas en la superficie, como se indicó
anteriormente, y se secó a la sombra durante 30 minutos antes de
sembrar en macetas a 5 macetas de semillas.-1. Las semillas
esterilizadas en la superficie se remojaron en cultivos de 48 h de
Rhizobium se aísla durante 30 min, utilizando sal sódica de
carboximetilcelulosa pura (Merck Specialties Pvt. Ltd., Mumbai, India)
como adhesivo (Figura 1I).
2.6.2 Experimento de cultivo en maceta para evaluar la
eficiencia de los Rhizobium aisla
Eficiencia promotora del crecimiento y de nodulación de los dos
Rhizobium se estudiaron los aislamientos en maní. Las semillas
esterilizadas en la superficie se remojaron en cultivos de 48 h de
Rhizobium aislados durante 30 min (Figura 1I), secados al aire bajo
sombra, luego sembrados en macetas (18 cm × 19 cm) que contienen
suelo esterilizado. Cada tratamiento se repitió dos veces (Figura 1J). Las
macetas se colocaron en un invernadero a 27,3 ° C (máx.) / 13,7 ° C
(mín.) Y 85% (8 AM) a 53% (2 PM) de humedad relativa. Las plantas se
arrancaron de raíz y se limpiaron con agua del grifo 45 días después de
la inoculación (Figura 1K).
406 A. Hossain et al.

2.7 Registro y análisis de datos
Datos sobre la longitud de las raíces y los brotes, la altura de la planta,
la planta de materia seca-1, planta de número de nódulo–1y planta de
peso seco de nódulos–1 se midieron a partir del experimento de
invernadero de cultivo en maceta (cuatro plantas / maceta). Los datos
se analizaron estadísticamente, incluida la separación media, ANOVA y
laF-prueba en PAG ≤ 0,05, por STAR (Herramienta estadística para la
investigación agrícola; IRRI 2014).
dieron resultados positivos para las pruebas de oxidasa, catalasa y
Voges Proskauer, pero resultados negativos para las pruebas de
utilización de citrato, gelatinasa, indol, rojo Congo, hidrólisis de
almidón, BTB y rojo de metilo. Shahzad y col. (2012) también utilizaron
las mismas pruebas para confirmar que se encontraron cepas
bacterianas aisladas similares.Rhizobium spp. Erum y Asghari (2008),
Singh (2008) y Shahzad et al. (2012) observaron pruebas positivas de
azúcar durante el aislamiento y caracterización deRhizobium meliloti.

Aprobación ética: La investigación realizada no está relacionada 3.4 Utilización de carbohidratos por
con el uso humano o animal. Rhizobiumaisla

Los resultados de la utilización de carbohidratos por Rhizobium se

3. Resultados y discusión
3.1 Aislamiento de eficientes Rhizobium aisla
Dos Rhizobium se aislaron cepas ('RhBC' y 'NRA1') de los
nódulos de la raíz del maní cultivado en macetas (Figura
1A).
resumen en la Tabla 3. Ambos Rhizobium los aislados ('RhBC' y 'NRA1')
utilizaron varios de los nueve carbohidratos como única fuente de
carbono. Ambos aislados prefirieron los monosacáridos sobre los
disacáridos. Se prefiere la xilosa sobre otros monosacáridos (Ishihara et
al.2002), lo que favorece un mejor crecimiento que la glucosa y la
galactosa, mientras que en la utilización de disacáridos, todos los
Rhizobium los aislados mostraron un mejor crecimiento cuando se
alimentaron con lactosa y sacarosa (Tabla 3).

3.2 Características morfológicas de

Rhizobium aisla

Ambos aislados crecieron bien en medio YEMA. Fenotípicamente,

ambos aislamientos crecieron rápidamente dentro de los 3-5 días de la Tabla 2: Caracterización morfológica y bioquímica de Rizobios
incubación y no pudieron absorber el rojo Congo en este medio. Las aisla
colonias de ambos aislamientos en medio YEMA fueron circulares,
mucoides, blancas y translúcidas. Ambos aislamientos fueron Rhizobium aisla
Ensayos bioquímicos
gramnegativos y con forma de bastoncillo. En rojo Congo medio, RhBC NRA1
Rhizobium Las colonias eran blancas, translúcidas, relucientes, elevadas Prueba de Gram - -
y comparativamente más pequeñas que las colonias teñidas de otros
Morfología Varillas Varillas
no-Rhizobium aislamientos. Las características morfológicas de
Rhizobium los aislamientos fueron similares a los reportados por Arora Ensayos bioquímicos:

(2003). Prueba de oxidasa + +

Prueba de citrasa - -

3.3 Características bioquímicas de Prueba de catalasa + +

Rhizobium aisla Prueba de gelatinasa - -

Prueba de indol - -
Se realizaron varias pruebas bioquímicas cualitativas según lo
Prueba de rojo congo - -
descrito por Lowe (1962): producción de oxidasa y catalasa,
utilización de citrato, actividad de gelatinasa, pruebas de indol, rojo Prueba de Vogas Proskauer + +
de metilo y rojo Congo, prueba de Voges Proskauer e hidrólisis de Prueba de hidrólisis de almidón - -
almidón.
Prueba de rojo de metilo - -
Los resultados de las características morfológicas y
bioquímicas de aislados seleccionados se resumen en la Tabla (+) resultado positivo, (-) resultado negativo
2. Se encontró que ambos aislamientos ('RhBC' y 'NRA1')
 Aislamiento, caracterización y depuración de Rhizobium cepa para enriquecer la productividad del maní 407

Tabla 3: Utilización de fuentes de carbono por Rhizobium aisla planta–1, planta de número de nódulo–1y planta de peso seco de nódulos–1 y

por lo tanto fue seleccionado para una futura prueba de campo.

Diferentes pruebas de utilización de Rhizobium aisla Los resultados del presente estudio son similares a los de estudios
carbono RhBC NRA1 anteriores. Rahman (2006) informó queBradyrhizobium la inoculación afectó
significativamente el rendimiento, pero la mayoría de los atributos del
Glucosa + +
rendimiento no se vieron afectados significativamente. Brahmaprakash y col.
Manitol + +
(2007) informó que la planta de número de nódulos–1 y el rendimiento de
Sacarosa + +
grano se mejoró debido a la inoculación de líquido Rhizobium inoculantes en
Lactosa + +
comparación con los basados en portadoresRhizobium inoculantes en todos
Galactosa + +
los cultivos probados. Deshwal y col. (2003) encontraron que las semillas de
Manosa + +
maní recubiertas conBradyrhizobium las cepas tuvieron una germinación
Xilosa + +
significativamente mejorada, así como una mayor biomasa de plántulas,
Celobiosa - -
número de nódulos, peso fresco de nódulos y peso promedio de nódulos en
comparación con los controles no inoculados y no infectados. Biswas y col.
(+) resultado positivo, (-) resultado negativo
(2003) informaron que los niveles aumentados deRhizobium El inóculo

3.5 Prueba de la eficiencia de aumentó significativamente el número de nódulos, el peso de los nódulos, la

seleccionadosRhizobium aisla altura de la planta, el peso de los brotes, el peso de las raíces, el rendimiento
de las vainas y el contenido de N en la semilla de maní. En su estudio, hubo

los Rhizobium los aislados mostraron efectos positivos una correlación positiva entre el peso del nódulo, la altura de la planta, el

significativos sobre el crecimiento y la nodulación de las plantas de peso de los brotes, el peso de la raíz, el rendimiento de las vainas y el

maní en comparación con el control no inoculado (Cuadro 4) 45 contenido de N en las semillas y el número total de nódulos como resultado

días después de la emergencia de la planta. En comparación con el de la aplicación del inóculo. Por lo tanto, la producción de maní puede

control no inoculado, la cantidad máxima de biomasa por planta se mejorarse considerablemente proporcionando un inóculo eficaz a los

encontró en TG 51 cuando se inocularon con NRA1, que fue agricultores.

estadísticamente similar con TG 71 también inoculado con NRA1,

seguido de TG 51 y TG 71 que fueron inoculados con RhBC. Similar
a la planta de biomasa vegetal–1, TG 51 inoculados con NRA1 y TG
4. Conclusión
71 inoculados con NRA1 mostraron valores estadísticamente más
altos que TG 51 y TG 71 inoculados con RhBC para otros
Rhizobium El aislado NRA1 se aisló del suelo en un experimento en
parámetros de crecimiento como longitud de brotes y raíces,
macetas a base de plantas de maní. Una vez purificado el aislado,
número de nódulos y biomasa de nódulos de la planta.-1. NRA1
se caracterizó por parámetros morfológicos y bioquímicos. Isolate
funcionó mejor que RhBC en cultivo en macetas en términos
NRA1 fue superior a la cepa RhBC en términos de eficiencia de
de longitud de raíz y brote, altura de planta, materia seca
nodulación, materia seca de la planta y absorción de nitrógeno de
la planta y ha sido seleccionada para un futuro

Cuadro 4: Efecto de Rhizobium aislados en biomasa seca, longitud de la raíz, longitud de los brotes, nodulación, contenido de nitrógeno y puntuación del color de la hoja del

maní en cultivo en maceta

Rhizobium Maní Biomasa vegetal Duración del rodaje Longitud de la raíz (cm) Nódulo no. Biomasa de nódulos

aisla variedad (g planta–1) (cm) planta–1 (g planta–1)

TG 51 6,80 16,85 19,50 24,50 0,05

RhBC
TG 71 5.50 16.25 18,98 23.30 0,04
TG 51 7,50 20.05 29.00 28.00 0,09
NRA1
TG 71 7,44 19,65 28,50 27,50 0,07
TG 51 3,84 15.00 16.05 00.00 0,00
Control
TG 71 3,82 14,75 15.55 00.00 0,00
F-prueba * * * * *
SEm ± 2.12 1,54 2,97 4.85 0,01

* Significativo al nivel del 5%

408 A. Hossain et al.
prueba de campo. Para aumentar el rendimiento del maní se
requiere el aislamiento de cepas microbianas adecuadas y
eficaces. La metodología utilizada en este estudio será útil
para detectarRhizobium aísla y prueba su eficacia con
variedades locales de cacahuete. En definitiva, el objetivo es
enriquecer la productividad del maní en suelos infértiles.
Fondos: El primer autor agradece a CICS y DST, India por una beca de
investigación para completar la capacitación en investigación avanzada
como ISRF 2016.
Contribución del autor: AH diseñó y realizó la investigación, y
también coescribió el manuscrito; SKG y MB ayudaron a
diseñar y realizar la investigación y también ayudaron a
escribir el manuscrito; AELS ayudó con el análisis de datos;
JATS analizó los datos, ayudó con la evaluación del diseño
experimental, ofreció supervisión, coescribió y editó todas las
versiones del manuscrito. Todos los autores vieron y
aprobaron la versión final para su publicación.
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún
conflicto de intereses.
Consentimiento informado: Se obtuvo el consentimiento informado de
todos los participantes individuales incluidos en el estudio.
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