RESUMEN:

Los fluidos supercríticos son materiales por encima de su punto crítico que representan una
clase única de medios no acuosos para biocatálisis y bioseparación. Las bajas viscosidades
inherentes a gases y las altas difusividades de los fluidos supercríticos aumentan las tasas de
transferencia de masa de los sustratos a la enzima. Por el contrario, las densidades similares a
las de los líquidos de los fluidos supercríticos dan como resultado un poder de solubilización
más alto que las observadas para los gases. A diferencia del comportamiento de gases y
líquidos, las propiedades físicas de un fluido supercrítico se pueden ajustar en un amplio rango
mediante un cambio relativamente pequeño de presión o temperatura. En un fluido
supercrítico, la cuidadosa regulación de la densidad permite controlar la solubilidad del
reactivo y del producto, simplificando así las separaciones posteriores. El poder de extracción
del dióxido de carbono supercrítico se ha utilizado ampliamente tanto en la industria química
como en la alimentaria.

El uso de fluidos supercríticos como dispersante para la biocatálisis se describió por primera
vez en 1985, y ahora existe una tendencia creciente en el uso de fluidos supercríticos como
medio de reacción para la catálisis enzimática. Las ventajas de usar enzimas en fluidos
supercríticos incluyen las siguientes:

I. Las reacciones de síntesis en las que el agua es un producto pueden completarse.

2. Las solubilidades de los materiales hidrófobos aumentan en relación con las del agua.

3. La termoestabilidad de las biomoléculas en los fluidos supercríticos es mayor que en el agua.

4. El disolvente se puede reciclar fácilmente.

5. Las reacciones y separaciones bioquímicas se pueden integrar en un solo paso.

Entre los disolventes potencialmente interesantes para la catálisis enzimática, el dióxido de

carbono es el fluido supercrítico más utilizado. Sin embargo, existe un interés creciente en el
uso de otros fluidos supercríticos (por ejemplo, etileno, fluoroformo, etano, hexafluoruro de
azufre y propano casi crítico). En esta revisión, nos enfocamos en describir la catálisis
enzimática en fluidos supercríticos realizada hasta la fecha, y abordamos los problemas
fundamentales asociados con la biocatálisis basada en fluidos supercríticos.

1. INTRODUCCIÓN

El uso de enzimas como catalizadores en disolventes distintos del agua es un área de

investigación en desarrollo.

Debido a las suaves condiciones de reacción requeridas para la actividad, la especificidad única
del sustrato y la selectividad, las enzimas se consideran ahora como posibles reemplazos de los
catalizadores convencionales. Sin embargo, el desarrollo de enzimas como catalizadores en la
química orgánica industrial se ve obstaculizado por la percepción de que las enzimas no
pueden funcionar en disolventes distintos del agua. En la última década, se ha demostrado que
este preconcepto es en gran parte infundado, y el uso de enzimas en disolventes orgánicos, la
fase gaseosa (Barzana et al., 1987; Firooze et al., 1992; Hwang et al., 1993; Lamare, 1993;
Pulvin et al., 1988), y en fluidos supercríticos es ahora un lugar común (para revisiones, ver
Klibanov, 1989; Dordick, 1992; Khmelnitsky et al., 1988, Butler, 1979). Súper-
Los fluidos críticos son una clase única de medios no acuosos con muchas características que
hacen que su uso como disolventes (dispersantes) para biocatálisis y separación sea
particularmente deseable.

Los fluidos supercríticos son materiales por encima de su temperatura crítica y, por lo tanto,
no se pueden licuar.

Por encima del punto crítico, la energía térmica molecular excede las fuerzas de atracción
entre moléculas y existe un estado similar a un gas; en consecuencia, las propiedades de los
fluidos supercríticos cierran la brecha entre las propiedades de los líquidos y los gases.

Las densidades de los fluidos supercríticos son comparables a las de los líquidos, mientras que
las viscosidades y los coeficientes de difusión de los fluidos supercríticos son comparables a los
de los gases. Existe al menos un orden de diferencia de magnitud entre las viscosidades de los
fluidos supercríticos y los líquidos (Tabla 1) y, por lo tanto, los coeficientes de difusión de los
fluidos supercríticos son un orden de magnitud más altos que los de los líquidos. Las
viscosidades bajas aumentan las tasas de transferencia de masa, elevando así las tasas de
reacciones controladas por difusión. Además, los fluidos supercríticos muestran una tensión
superficial casi nula y, por lo tanto, pueden penetrar poros inaccesibles para los líquidos
convencionales. La capacidad de los fluidos supercríticos para humedecer los poros pequeños
se ha utilizado con éxito en el secado de cerámica, impregnación de matriz sólida y síntesis de
polímeros microporosos (Goel et al., 1993). Subramaniam y col. (1986) han descrito el uso de
fluidos supercríticos como medio de reacción en muchas reacciones, incluidas hidrolizaciones,
reacciones térmicas y fotoquímicas, isomerizaciones y procesos catalizados
heterogéneamente. La dependencia de la presión de la densidad de los fluidos supercríticos
está acoplada a la dependencia de la presión de todas las propiedades físicas dependientes de
la densidad. Como se analiza en detalle a continuación, tales propiedades físicas dependientes
de la densidad incluyen la constante dieléctrica del fluido, el parámetro de solubilidad y la
viscosidad.

Aunque las propiedades de los fluidos supercríticos se han estudiado durante muchos años, su
uso como dispersante para la biocatálisis es relativamente nuevo. Los primeros artículos sobre
el uso de biocatalizadores en fluidos supercríticos aparecieron en 1985 (Randolph et al., 1985;
Hammond et al., 1985; y Nakamura nnn et al., 1985), y desde este trabajo pionero ha habido
un aumento constante en la actividad investigadora (Figura I). El estado del campo ha sido
revisado recientemente por Randolph et al. (1991), Aaltonen et al. (1992), Nakamura (1990) y
Russell et al. (I 994).

Desde una perspectiva biotecnológica, existen numerosas ventajas de realizar reacciones

catalizadas por enzimas en fluidos supercríticos.

La naturaleza hidrófoba de los fluidos supercríticos permite la solubilización de reactivos y

productos hidrófobos.

La contaminación microbiana de los biorreactores de fluidos supercríticos no será un problema

porque las bacterias no pueden crecer en un ambiente no acuoso.
medio ambiente.

El entorno de baja actividad de agua cambiará el equilibrio termodinámico de las reacciones

hidrolíticas para favorecer la síntesis. Por ejemplo, la ausencia de agua desplaza el equilibrio de
la hidrolización de péptidos hacia la síntesis.

Las temperaturas críticas (T,) y las presiones (P,) de una variedad de compuestos están en el
rango de 35 a 50 ° C y por debajo de 20 MPa, respectivamente (ver Tabla 2).

Las enzimas son insolubles en fluidos supercríticos y, por lo tanto, la recuperación es sencilla y
la inmovilización es innecesaria.

Los reactivos gaseosos, como el oxígeno y el hidrógeno, son completamente miscibles con
fluidos supercríticos. Por lo tanto, la velocidad de las reacciones que involucran sustratos
gaseosos no estará limitada por la solubilidad.

La solubilidad de un material en un fluido supercrítico se puede controlar ajustando la presión

del sistema y añadiendo una pequeña cantidad de codisolventes como metanol y acetona.

El fraccionamiento, la purificación y la cristalización del producto a partir de la mezcla de

reacción, sin ningún cambio de disolvente, son factibles usando una reducción gradual de la
presión en una secuencia de separadores.

En esta revisión, describimos brevemente algunos de los trabajos que abordan las reacciones
enzimáticas en fluidos supercríticos y discutimos cuestiones fundamentales en la biocatálisis /
bioseparación de fluidos supercríticos. Además, se discuten las cuestiones de cómo las
propiedades físicas de los fluidos supercríticos pueden ser reguladas por la temperatura y la
presión, y se presenta una introducción al efecto de los cambios inducidos por la presión en las
propiedades físicas del solvente sobre la actividad enzimática, la especificidad y la estabilidad.

II. PARÁMETROS QUE AFECTAN A LA CATÁLISIS ENZIMÁTICA EN FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Para comprender la función de las enzimas en los fluidos supercríticos, es necesario

determinar la relación entre las propiedades fisicoquímicas fundamentales de los fluidos
supercríticos y las enzimas suspendidas en ellos.

En sistemas acuosos, la catálisis enzimática está bien caracterizada con respecto a las
propiedades físicas del solvente, y para muchas reacciones se han derivado mecanismos
detallados. Sin embargo, el conocimiento derivado de los sistemas acuosos no se puede
extrapolar necesariamente a la biocatálisis de fluidos supercríticos porque las propiedades
físicas del solvente que afectan la catálisis enzimática, como la hidrofobicidad, la constante
dieléctrica y la viscosidad, cambian considerablemente al pasar de una solución acuosa a una
supercrítica no acuosa fluidos.

A. Efecto de la presión

A diferencia de los disolventes orgánicos convencionales, la biocatálisis en fluidos supercríticos

se lleva a cabo por encima de la presión atmosférica y, por tanto, el efecto intrínseco de la
presión sobre las enzimas es un parámetro importante. El efecto de la presión en un entorno
de fluido supercrítico es complejo, pero se puede dividir en tres categorías: los efectos directos
de la presión sobre la conformación de moléculas enzimáticas (estabilidad), el efecto de la
presión sobre la cinética enzimática intrínseca y el efecto de la presión sobre propiedades
físicas de los fluidos supercríticos, que luego pueden modular indirectamente la actividad
enzimática, la especificidad y la estabilidad.