Universidad Autónoma del Estado de México

Facultad de Química
Licenciatura: Química Farmacéutica Biológica
Área de acentuación: Análisis Bioquímicos Clínicos
Unidad de Aprendizaje: Análisis Bioquímicos Clínicos
Especiales
Practica 7: perfil hepático
Profesora: Dra. María del Socorro Camarillo Romero
Elaboró:
● Yair López Hernández
Fecha: 1 de noviembre del 2021
Grupo: 92
 Practica 7: perfil hepático
• Objetivo:
El alumno aprenderá a usar las técnicas adecuadas para la determinación de enzimas Alanino
aminotransferesa (GTP), fosfatasa alcalina, colinesterasa, gama glutamil transferasa, bilirrubina total,
directa e indirecta, proteínas totales, albúmina, globulinas, relación A/G, compararlas con los valores
de referencia y establecer un posible diagnóstico.
• Marco teórico:
Los mayores aumentos de actividad GPT en suero, se producen como consecuencia de alteraciones
hepáticas. En el caso de hepatitis virales, el aumento de GPT precede a la aparición de ictericia. Si
los valores permanecen elevados luego de 6 semanas, debe pensarse en la posibilidad de una
hepatitis activa o en el comienzo de una hepatitis crónica.
La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los
monoésteres del ácido ortofosfórico en medio alcalino. Entre las patologías que afectan la actividad
sérica de fosfatasa alcalina, pueden ser carcinomas metastásicos en hígado y en hueso, colestasis
biliar, fenómenos osteoblásticos, trastornos de malabsorción acompañados de lesiones ulcerosas.
La colinesterasa (Che) del suero o plasma o pseudocolinesterasa está como un índice de función
hepática, especialmente en hepatopatías crónicas. Se observa una buena correlación entre el
aumento de AST y la disminución de Che, en hepatitis infecciosas. Su disminución indica intoxicación
por insecticidas organofosforados, inhibidores de la Che.
La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos
estados de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones
prolongadas, suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma múltiple,
endocarditis bacteriana y hemoconcentración de diversos orígenes, se observan hiperproteinemias.
La albúmina es el principal contribuyente de las proteínas totales plasmáticas. Los aumentos
anormales de albúmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con la deshidratación. La
hipoalbuminemia ocurre en condiciones patológicas como pérdida excesiva de proteínas en el
síndrome nefrótico, desnutrición, infecciones prolongadas, y quemaduras severas.
La γ-glutamil transferasa (γ-GT) es una enzima de membrana ampliamente distribuida en el
organismo. Se localiza principalmente en riñón, vesículas seminales, páncreas, hígado, bazo y
cerebro. En el caso de alteraciones hepáticas, la γ-GT generalmente es índice de agresión tóxica. El
análisis conjunto de γ-GT, fosfatasa alcalina, transaminasas y bilirrubina, amplía significativamente el
panorama del diagnóstico diferencial de las enfermedades hepáticas primarias y secundarias,
formando parte del hepatograma.
• Pruebas:
Para la determinación de fosfatasa alcalina se usará un método colorimétrico al igual que para
determinar la actividad de GTP en una muestra de suero. Para la determinación de Che se usará un
método enzimático, basado en la formación de 2-nitromercaptobenzoato, para la determinación de
proteínas totales se usará el método de Biuret, para la determinación de albumina, se usará el método
de verde de bromocresol. Para determinar la concentración de bilirrubina, se usará el método de
Jendrassik modificado, y para la determinación de γ-GT se usará un método colorimétrico.
• Fundamento del método:
Determinación de fosfatasa alcalina: la actividad de la enzima se vera reflejada en la formación del p-
nitrofenol de la muestra problema.
p-nitrofenilfosfato + H2O à Fosfato + p-nitrofenol
Determinación de GPT: la actividad de la enzima se determina midiendo la concentración formada de
piruvato en la muestra.
α -oxoglutarato + L-aspartato à L-glutamato + Piruvato
Determinación de Che: la determinación de la actividad de la enzima se calculará con la formación de
2-nitromercaptobenzoato.
Butiriltiocolina + H2O à Tiocolina + Butirato
Tiocolina + DTNB à 2-nitromercaptobenzoato
Determinación de proteínas totales: los iones de cobre reaccionaran con los enlaces peptídicos de las
proteínas, lo que resultara en un complejo coloreado, que es proporcional a la cantidad de proteínas
en la muestra.
Determinación de albúmina: la determinación de la proteína se basa en la formación del complejo de
esta con el verde de bromocresol, midiendo la absorbancia que es proporcional a la concentración de
esta en la muestra.
Determinación de bilirrubina: se determinará en ausencia de acelerador, por la reacción con acido
sulfanilico diazotado, dando una coloración proporcional a la concentración de la bilirrubina.
Determinación de γ-GT: su determinación se basa en la formación de 5-amino-2-nitrobenzoato, que
es proporcional a la actividad de la enzima.
L- γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + Glicilglicina à L- γ-glutamilglicilglicina + 5-amino-2-nitrobenzoato
 • Tipo de muestra:
Se obtendrá una muestra de 5 mL de sangre por punción, y colocar en un tubo con gel separador sin
anticoagulante.
• Material y reactivos:
Gradilla para tubos Guantes
Kit para determinar GPT Termómetro
Kit para determinar fosfatasa alcalina Micropipetas de 10, 50, 100 y 1000 uL
Kit para determinar colinesterasa Puntas para micropipetas
Kit para determinar gamma glutamil transferasa Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 mL
Kit para determinar bilirrubina total, directa e indirecta Perilla
Kit para determinar proteínas totales Torniquete
Kit para determinar albúmina Alcohol
Kit para determinar globulinas Algodón
Kit para determinar relación A/G Agua destilada
Tubos sin anticoagulante Jeringas estériles
• Equipo:
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotómetro.
Baño de agua a 37º C.
Centrifuga.
• Procedimiento:
Determinación de fosfatasa alcalina: kit randox
1.- Obtener 5 mL de sangre por punción y colocar en un tubo de tapa amarilla.
2.- Centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos; separar el suero en otro tubo limpio.
3.- Reconstruir el vial RIb con 3 mL de tampón RIa e incubar a 37º C.
4.- En un tubo, mezclar 50 uL de suero y 3000 uL de vial RIb, leer absorbancia a 405 nm, cronometrar
tiempo e incubar a 37º C.
5.- Leer de nuevo a 1, 2 y 3 minutos.
6.- Realizar cálculos.
Determinación de GPT: kit randox
1.- Aforar vial R3 con 1000 mL de agua destilada en un matraz.
2.- En un tubo mezclar, 0.5 mL de vial R1, 0.1 mL de agua destilada, 0.5 mL de vial R2, y reposar por
20 minutos a temperatura ambiente.
3.- Pasados los 20 min. Agregar 5 mL de vial R3.
4.- En otro tubo, mezclar 0.1 mL de suero, 0.5 mL de vial R1, 0.5 mL de vial R2, y reposar por 20
minutos a temperatura ambiente.
5.- Pasados los 20 min. Agregar 5 mL de vial R3.
6.- Leer absorbancia de los tubos a 546 nm después de 5 minutos de agregado el vial R3.
7.- Realizar cálculos.
Determinación de Che: kit spinreact
1.- Disolver el vial R1 en 50 mL de agua destilada, e incubar a 37º C.
2.- Disolver el vial R2 en 3 mL de agua destilada e incubar a 37º C.
3.- En un tubo, mezclar 1.5 mL de vial R1, 50 uL de vial R2 y 10 uL de muestra, e incubar 30 segundos.
4.- Leer absorbancia a 405 nm, cronometrar tiempo.
5.- Leer cada 30 segundos hasta completar 1.5 minutos.
6.- Realizar cálculos.
Determinación de proteínas totales: kit randox
1.- Diluir el vial R1 con 400 mL de agua destilada.
2.- Diluir el vial R2 con 400 mL de agua destilada.
3.- En un tubo mezclar 0.02 mL de agua destilada y 1 mL de vial R1 (blanco). En otro tubo, mezclar
0.02 mL de vial CAL y 1 mL de vial R1 (patrón). En otro tubo mezclar 0.02 mL de suero y 1 mL de vial
R1 (muestra). Incubar a 25º C por 30 minutos.
4.- Medir absorbancia a 546 nm del tubo 2 y 3.
5.- Realizar cálculos.
Determinación de albúmina: kit randox
1.- Diluir vial R1 con 87 mL de agua destilada.
2.- En un tubo mezclar, 0.01 mL de agua destilada y 3 mL de vial R1 (blanco), en otro tubo mezclar
0.01 mL de vial CAL y 3 mL de vial R1 (patrón). En otro tubo mezclar 0.01 mL de suero y 3 mL de vial
R1 (muestra).
3.- Incubar tubos por 5 minutos a 25º C.
4.- Leer absorbancia a 630 nm del tubo 2 y 3.
5.- Realizar cálculos.
Determinación de bilirrubina: kit randox
1.- Mezclar vial RIa y el vial RIb antes de usarse.
2.- En un tubo mezclar 2.5 mL de vial RIa con una gota de vial RIb (blanco). En otro tubo mezclar 2.5
mL del vial RIa, 1 gota de vial RIb y 0.1 mL de suero (muestra/STD). En otro tubo mezclar 2.5 mL de
vial RIa y 0.1 mL de suero (muestra/blanco).
3.- Incubar por 5 minutos a 25º C y leer absorbancia del tubo 2 y 3 a 546 nm.
4.- Realizar cálculos.
Determinación de γ-GT: kit randox
1.- Reconstruir vial RIb con 3 mL de vial RIa, incubar a 37º C.
2.- En un tubo mezclar 0.1 mL de suero y 1 mL de vial RIb y leer absorbancia a 405 nm, cronometrar
tiempo.
3.- Leer de nuevo al 1, 2 y 3 minutos.
4.- Realizar cálculos.
• Cálculos de los resultados:
Determinación de fosfatasa alcalina:
𝑈
= ∆𝐴𝑏𝑠(3300)
𝐿
Determinación de GPT:
Abs U/L Abs U/L
0.025 4 0.275 48
0.050 8 0.300 52
0.075 12 0.325 57
0.100 17 0.350 62
0.125 21 0.375 67
0.150 25 0.400 72
0.175 29 0.425 77
0.200 34 0.450 83
0.225 39 0.475 88
0.250 43 0.500 94
Determinación de Che:
𝑈
= ∆𝐴𝑏𝑠(23460)
𝐿
Determinación de proteínas totales:
𝑔
= 𝐴𝑏𝑠0123456 (190)
𝐿
𝑔
= 𝐴𝑏𝑠0123456 (19)
𝑑𝐿
𝑔 𝐴𝑏𝑠0123456
= (𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛)
𝐿 𝐴𝑏𝑠:645;<
Determinación de albúmina:
𝑔 𝐴𝑏𝑠0123456
= (𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛)
𝐿 𝐴𝑏𝑠:645;<
Determinación de bilirrubina:
𝑔 𝐴𝑏𝑠0123456 − 𝐴𝑏𝑠GH6<I;/0123456
= (𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛)
𝐿 𝐴𝑏𝑠:645;< − 𝐴𝑏𝑠GH6<I;/:645;<
Determinación de γ-GT:
𝑈
= ∆𝐴𝑏𝑠(1158)
𝐿
• Intervalos de referencia:
Valores de referencia de fosfatasa alcalina:
98-279 U/L a 37º C.
Valores de referencia de GPT:
<12 U/L a 37º C.
Valores de referencia de Che:
4659-1443 U/L a 37º C.
Valores de referencia de proteínas totales:
64-83 g/L a 37º C.
Valores de referencia de albúmina:
38-44 g/L a 37º C.
Valores de referencia de bilirrubina:
<0.25 mg/dL a 37º C.
Valores de referencia de γ-GT:
Hombre: 11-50 U/L a 37º C.
Mujer: 7-32 U/L a 37º C.
• Linealidad de la técnica:
Linealidad para fosfatasa alcalina: es lineal hasta 1609 U/L, si es mayor, diluir 1:9 con NaCl al 0.9% y
multiplicar resultado por 10.
Linealidad para GPT: si la absorbancia es mayor que 0.5, diluir 0.1 mL de suero con 0.9 mL de NaCl
al 0.9% y multiplicar resultado por 10.
Linealidad para Che: si la concentración es mayor, diluir 1:5 con NaCl al 0.9% y multiplicar resultado
por 5.
Linealidad para proteínas totales: es lineal hasta 13 g/dL, si la absorbancia es mayor a 0.7, diluir 1:1
con NaCl al 0.9% y multiplicar resultado por 2.
Linealidad para albúmina: es lineal hasta 7.55 g/dL, si es mayor, diluir 1:1 con NaCl al 0.9% y multiplicar
resultado por 2.
Linealidad para bilirrubina: es lineal hasta 15 mg/dL, si es mayor, diluir 1:5 con NaCl al 0.9% y
multiplicar resultado por 6.
Linealidad para γ-GT: es lineal hasta 400 U/L, si la absorbancia es mayor a 0.2 por minuto, diluir 0.1
mL de suero con 0.5 mL de NaCl al 0.9% y multiplicar resultado por 6.
• Referencias:
1.- Wiener lab. (2000). GPT(ALT). noviembre 2, 2021, de wiener lab Sitio web: https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/gpt_uv_aa_sp.pdf
2.- Wiener lab. (2000). Fosfatasas Alcalina. noviembre 2, 2021, de Wiener lab Sitio web:
https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/fosfatasas_alcalina_optimizada_sp.pd
f
3.- Wiener lab. (2000). Colinesterasa. noviembre 1, 2021, de Wiener lab Sitio web: https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/colinesterasa_aa_sp.pdf
4.- Wiener lab. (2000). Bilirrubina. noviembre 2, 2021, de Wiener lab Sitio web: https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/bilirrubina_sp.pdf
5.- Wiener lab. (2000). Proteínas Totales. noviembre 2, 2021, de Wiener lab Sitio web:
https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/proteinas_totales_aa_sp.pdf
6.- Wiener lab. (2000). Albúmina. noviembre 2, 2021, de Wiener lab Sitio web: https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/albumina_aa_sp.pdf
7.- Wiener lab. (2000). γ-G-test. noviembre 2, 2021, de Wiener lab Sitio web: https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/g_test_cinetica_aa_liquida_sp.pdf
Referencias:
1.- Gómez Gutiérrez, A., Casas Gómez, M. and Gómez Tobón, P., 2014. Interpretación clínica del
laboratorio. 8th ed. Bogotá: Panamericana.
2.- SNYDER, L., 2020. Wallach - interpretación clínica de pruebas. wallach- clinical interpretation of
tests. 11th ed. Phyladelphia: WOLTERS KLUWER MEDICAL.