RESUMEN

El presente estudio se centra en la extracción y caracterización de polihidroxialcanoatos de

especies de algas marinas mediante el método de extracción con solvente. Las siguientes cepas (i)
Chlorella sp., (Ii) Oscillatoria salina, (iii) Leptolyngbya valderiana y (iv) Synechococcus elongatus se
utilizaron en el presente trabajo de investigación. Las cepas de algas se ampliaron en medio ASN III
y se realizó un estudio preliminar de bioprospección para evaluar el perfil de crecimiento de todas
las cepas de algas en términos de peso de células secas. De las cepas estudiadas, el mayor
crecimiento se observó con Leptolyngbya valderiana y Chlorella sp. a aproximadamente 2,75 g / L,
mientras que Oscillatoria salina y Synechococcus elongatus mostraron un bajo peso de células
secas de 0,99 g / L y 0,32 g / L, respectivamente. Además, se realizó y caracterizó la extracción de
polihidroxialcanoatos de las cepas de algas. Se realizaron análisis termogravimétricos y estudios de
calorimetría diferencial de barrido para determinar la estabilidad térmica y las propiedades
térmicas del PHA sintetizado, respectivamente. Todos los PHA fueron térmicamente estables por
debajo de 260 ºC. Se encontró que el PHA obtenido de Leptolyngbya valderiana era más estable
térmicamente en comparación con el PHA obtenido de otras especies de algas.

INTRODUCCIÓN

En el medio ambiente, la acumulación de desechos plásticos no biodegradables se estima entre

4.8 y 12.7 millones de toneladas por año, lo que crea problemas importantes para los ecosistemas
marinos (Lo € hr et al., 2017). Esto se debe al uso de productos petroquímicos (no renovables)
como fuentes clave para la producción de plástico actualmente (Sabapathy et al., 2019). Por lo
tanto, existe una búsqueda de fuentes degradables de plásticos o alternativas a los plásticos no
biodegradables, para reducir la acumulación de plástico en el ecosistema. En esta coyuntura,
varios microorganismos pueden sintetizar polihidroxialcanoatos (PHA), un biopoliéster, una fuente
de energía y carbono. Los PHA tienen características similares a los plásticos hechos de origen
petroquímico (Martins et al., 2014). Los PHA extraídos de microorganismos son benignos para el
medio ambiente y se utilizan en diversos sectores médicos y alimentarios (Cassuriaga et al., 2018).
Las unidades monoméricas de hidroxiácido (HA) unidas entre sí por enlaces éster es la química
estructural de PHA y se clasifican en función del número de carbonos en las cadenas laterales. Hay
un tipo de longitud de cadena corta (SCL) que tiene menos de 5 carbonos, cadena media tipo de
longitud (mcl) que tiene 5–14 átomos de carbono y longitud de cadena larga (lcl) tipo con más de
14 átomos de carbono (Kunasundari y Sudesh, 2011). Los monómeros de PHA comunes son 4-
hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato, 3-hidroxihexanoato, 3-
hidroxioctanoato, 3-hidroxidecanoato, 3-hidroxidodecanoato y 3-hidroxitetradecanoato. Los PHA
se pueden usar como componentes de empaque, tintas de impresión biodegradables,
recubrimientos y laminaciones. Además, se pueden usar en ceras, aglutinantes y adhesivos, ya que
las estructuras de PHA incluyen diferentes grados de elastómeros termoplásticos y termoplásticos
rígidos.

El polihidroxibutirato es un tipo de PHA. El PHB es producido por numerosos microorganismos a

partir de acetil-CoA a través de una serie de reacciones enzimáticas usando tres enzimas. La β-
cetotiolasa (phaA) es la primera enzima clave que convierte acetil-CoA en una molécula de
acetoacetil-CoA; la segunda enzima acetoacetil-CoA reductasa (phaB) reduce la acetoacetil-CoA a
3-hidroxibutirlCoA y la enzima final PHB polimerasa (phaC) cataliza la polimerización de 3-
hidroxibutirlCoA a la molécula de PHB. Para mantener la polimerasa PHB unida covalentemente,
los polímeros PHB tienden a formar gránulos anfipáticos dentro de la célula. Entre los microbios
utilizados para la extracción de PHA, las algas han ganado un interés sustancial, ya que son fábricas
de células impulsadas por la luz solar que convierten el CO2 en varios bioproductos valiosos con la
evolución del O2. Además, la ruta de producción de bioplásticos a partir de una fuente de algas
puede ser a través de los polímeros de la biomasa directa o de sus metabolitos secundarios (Abdo
y Ali, 2019).
Las algas son principalmente de dos tipos procariotas y eucariotas basadas en un núcleo bien
definido. Las algas procariotas se conocen como cianobacterias o algas verdeazuladas que son
capaces de acumular polihidroxialcanoatos en condiciones fotoautotróficas y heterotróficas (Tabla
1). En las cianobacterias, el compuesto de almacenamiento intracelular más dominante
identificado es el PHB y, además, de los 150 polihidroxialcanoides estudiados, el PHB es el
bioplástico prevalente en las cianobacterias procariotas (Sundamoorthy et al., 2013). De hecho, la
acumulación de PHA en Las cianobacterias se observaron por primera vez en condiciones
ambientales (fotoautótrofas) y aumentaron con suplementos de carbono orgánico como glucosa,
acetato, citrato, xilosa, arabinosa, etc. (Cassuriaga et al., 2018; Singh et al., 2017). Los bioplásticos
de cianobacterias se pueden hacer usando biopolímeros derivados de dos maneras. Son (i)
biopolímeros de organismos vivos: de celulosa, proteína de soja y almidón, (ii) moléculas
polimerizables: están hechas de triglicéridos y ácido láctico. El PHB en las células de algas actúa
principalmente como una molécula de almacenamiento de energía en la que su uso se produce
cuando las células de algas tienen escasez de macronutrientes, derivando así energía para su
supervivencia. Los PHB generalmente se obtienen en baja cantidad a través de la fijación de
carbono o el proceso de asimilación de carbono y se pueden aumentar significativamente en
condiciones limitadas de nutrientes, lo que resulta en un almacenamiento excesivo de compuestos
de carbono (Das et al., 2018). Las cepas de microalgas reportadas para la producción de PHB en los
últimos tiempos son C. reinhardtii, C. vulgaris, C. fusca (Cassuriaga et al., 2018; Kato, 2019;
Mathiot et al., 2019). La producción de PHB a partir de fuentes de algas es mucho mejor en i)
propiedad reciclable ii) biodegradabilidad iii) biocompatibilidad iv) capacidad plastificante v)
usabilidad en múltiples sectores como el médico, agrícola, industrial, envasado de alimentos y
materiales de almacenamiento, etc. que el petróleo convencional plásticos a base (Abdo y Ali,
2019; Das et al., 2018). Uno de los desafíos clave en la producción de PHA a partir de fuentes de
algas es la economización del proceso. Los bioplásticos a base de algas tienen innumerables
beneficios en comparación con la era actual de los plásticos recalcitrantes a base de petróleo en
términos de degradación. Al mismo tiempo, la necesidad de bioplásticos de origen microbiano se
ha ampliado en varios campos para los cuales la productividad actual de los biopolímeros no es
suficiente para lograr el proceso de producción comercial. Además, la bioprospección de la cepa
de algas adecuada que tiene un alto contenido de PHB es de gran importancia y al hecho, solo se
han reportado pocas cepas de microalgas para la producción de PHB, por lo que afirman buscar
cepas de microalgas y cianobacterias altamente productivas de diversas fuentes. Por lo tanto, el
presente estudio se enfoca inicialmente en la selección del candidato de alga adecuado en función
de su perfil de crecimiento. Luego, el estudio adicional apunta a la extracción y caracterización de
polihidroxialcanoatos de tres especies de cianobacterias y una especie de alga verde para evaluar
su potencial de bioplástico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3.1. Patrón de crecimiento de algas

El crecimiento de los cultivos Chlorella sp., O. salina, L. valderiana y S. elongatus se controló en

términos de DCW. La DCW de todos los cultivos se presentó en las Fig. 1 y Fig. 2. Para S. elongatus,
el crecimiento máximo se obtuvo el día 18 con una DCW de 0,32 g / L. El agua dulce S. elongatus
UTEX 2973 y Synechococcus PCC 7942 produjeron 0.87 g / L y 0.33 g / L de peso seco dentro de las
16 h del peso seco inicial de 0.13 g / L y 0.12 g / L respectivamente bajo iluminación de alta luz y
suministro de CO2 (Yu et al., 2015). Para L. valderiana, se observó un crecimiento máximo el día 18
con DCW de 2.75 g / L, mientras que para O. salina el el mayor crecimiento obtenido fue de 0,99
g / L el día 18. Los informes sobre la caracterización de cepas de cianobacterias para una alta
producción de biomasa han mostrado los rendimientos de biomasa seca para Synechococcus PCC
7942, Oscillatoria sp., Lyngbya sp. como 1.09 g / L, 0.76 g / L, 0.64 g / L respectivamente después
de 19 días de cultivo por lotes (Patel et al., 2018). En el caso de alga verde probada Chlorella sp.,
Se obtuvo un mayor peso en seco el día 21 con 2,74 g / L. En un estudio de Thuy et al., (2019) para
la producción de biomasa y lípidos a partir de alga verde Chlorella sp., El crecimiento máximo se
observó el día 16 con un DCW de 1.1 g / L. Otro estudio informó 0.15 g / L DCW para marina C.
vulgaris después de 48 h de cultivo en estanques de alcantarilla al aire libre (Mathimani et al.,
2017). Colla et al. (2007) estudiaron el crecimiento de Spirulina platensis por debajo de 30 ° C y 35
° C en el medio de Zarrouk y la concentración de biomasa obtenida fue de 0.82-0.92 g / L y 0.59-
0.65 g / L respectivamente. Gonçalves et al. (2019) estudiaron la composición bioquímica de Pseu-
doneochloris marina bajo diferentes condiciones de luz y temperatura y la mayor biomasa
obtenida fue DCW de 1.8 g / L.

3.2. Espectros FTIR de muestras de PHA

Los espectros FTIR de cuatro muestras de PHA se mostraron en las Fig. 3 y Fig. 4. Las muestras de
PHA se extrajeron de Chlorella sp., O. salina, L. valderiana y S. los alargados se designaron como
PHA I, PHA II, PHA III y PHA IV respectivamente. Hay una señal prominente y amplia a 3339 cm-1
para PHA I y III, 3348 cm-1 para PHA II y 3349 cm-1 para PHA IV que representan el estiramiento
de –OH dentro de los grupos carboxilo. La presencia del pico alrededor de 2900 cm-1, es decir,
2921 cm-1 para PHA I y II, 2923 cm-1 para PHA III y 2919 para cm-1 para PHA IV representa la
vibración de estiramiento C-H de metilo y los grupos metileno en el polímero. El estiramiento del
grupo C-O se observó a partir de las señales 1625 cm-1 para PHA I, 1644 cm-1 para PHA II y 1639
cm-1 para PHA III y IV. La absorbancia en la región de 1400 cm-1 representa el estiramiento
asimétrico y simétrico del grupo metilo presente en las muestras de PHA. Los picos a 1025 cm-1,
1015 cm-1 y 1023 cm-1 indican el estiramiento de CO en el grupo éster.

Las señales características observadas anteriormente confirman la presencia de PHA en todas las
muestras de algas. Además, los datos de este presente estudio están respaldados por los diversos
trabajos de investigación realizados por otros investigadores mencionados a continuación. Los
estudios FTIR realizados para la muestra de PHA sintetizado a partir de la cepa E3 de
Halogeometricum borinquense por Salgaonkar y Bragança (2015) mostró un pico a 3585 cm-1 que
representa el estiramiento O-H y un pico alrededor de 2900 cm-1 corresponde a la vibración de
estiramiento C-H. Extracción de PHA de la microalga Botryo- coccus braunii se realizó (Kavitha et
al., 2016b). El análisis FTIR y las bandas de transmitancia se identificaron en: 2933 cm-1, que
representa la vibración del grupo –CH3; El estiramiento C – O del grupo éster-carboxílico obtenido
a 1637 cm-1, que confirmó la presencia de scl-PHA.

La caracterización usando FTIR se realizó en el PHA obtenido de Synechocystis salina (Meixner et

al., 2018). Los espectros obtenidos mostraron Señales 2975 cm-1 y 2932 cm-1 que representan la
presencia de grupos metilo y metileno, 1453 cm-1 confirmaron la presencia de estiramiento
asimétrico y simétrico de los grupos metilo y una señal a 1721 cm-1 confirmó la presencia de
estiramiento de carbonilo de un éster grupo. Samantaray y col. (2011) estudiaron el espectro FTIR
de la PHA extraído de Aulosira fertilissima. La señal obtenida alrededor de 3000 cm-1 representa el
grupo –OH. El pico a 1460 cm-1 correspondió al estiramiento asimétrico en el grupo CH3. La banda
a 1720 cm-1 indicó el estiramiento de carbonilo del enlace éster. Espectros de FTIR del PHA
extraído de Spirulina sp. Se estudió LEB-18 y S. subsalsus (Costa et al., 2018a). La región de la
banda alrededor de 1710-1750 cm-1 confirmó la presencia del grupo éster carbonilo. Kavitha y col.
(2016a) estudió el espectro FT-IR de Arthrospira platensis en el que el pico a 3278 cm-1
representaba el grupo hidroxilo, las señales a 2920 cm-1 y 2294 cm-1 corresponden a la vibración
de estiramiento C-H del metilo y los grupos metileno en el polímero alrededor de 1700 cm-1 indicó
el CO estiramiento en enlace éster y a 1415 cm-1 representaba lo asimétrico estiramiento de
vibración en el grupo CH3.

3.3. Análisis térmico de muestras de PHA

Se estudió la degradación térmica de muestras de PHA extraídas de Chlorella sp., O. salina, L.

valderiana y S. elongatus. La figura 5 muestra el gráfico TGA de muestras de PHA. Hay una pérdida
de peso inicial de hasta 150 ° C para las cuatro muestras debido a la presencia de moléculas de
agua y también a la presencia de impurezas durante el proceso de extracción de PHA. La
degradación térmica del polímero comenzó a 217 ° C, 238 ° C, 261 ° C y 249 ° C para PHA I, PHA II,
PHA III y PHA IV respectivamente. La tasa de degradación de PHA depende de diferentes unidades
de monómero. Costa y col. (2018a) estudiaron la degradación térmica del PHA extraído de
Spirulina sp. LEB-18 y S. subsalsus y se encontró que el inicio de la degradación del polímero fue de
alrededor de 250 ° C y 287 ° C, respectivamente, y se concluyó que los polímeros obtenidos eran
térmicamente estables por debajo de una temperatura de 250 ° C y la fusión la temperatura
obtenida de DSC fue de alrededor de 171 y 173 ° C para Spirulina sp. LEB-18 y S. subsalsus
respectivamente. La degradación térmica del PHA extraído de la cianobacteria diazototrófica
Nostoc muscorum Agardh se identificó a una temperatura de 223 ° C (Bhati y Mallick, 2015). La Tg
y Tm de los polímeros de PHA obtenidos fue de alrededor de 0,8 ° C y 178 ° C. Hubo una
disminución en ambas temperaturas a medida que hubo un cambio en la composición del
polímero. La degradación del polímero se registró a 251 ° C y a 284 ° C, se produjo la degradación
completa de PHA obtenida de la cepa RM-G10 de Natrinema altunense. En otro estudio de
Salgaonkar y Bragança (2015), la pérdida de peso observada fue de alrededor de 241 ° C y la
pérdida de peso total se observó en la proximidad de 305 ° C. Se realizó DSC para determinar la
temperatura de fusión (Tm) y la temperatura de transición vítrea (Tg). La temperatura de fusión y
el vidrio. La temperatura de transición se da en la Tabla 2. La Fig. 6 muestra los gráficos DSC de
PHA extrajo las muestras de algas. La transición vítrea y las temperaturas de fusión dependen de
los diferentes monómeros y su composición en el polímero PHA. Samantaray y Mallick (2012)
informaron la Tm y la Tg de PHB de las cianobacterias en el rango de 174-175 ° C y 0.6-0.9 ° C,
mientras que para P (3HB-co-3HV), las temperaturas fueron alrededor de 148.8-168 ° C. C y 5.5 a
2.2 C. En otro estudio realizado por Saito, (1994). Las temperaturas oscilaron entre 53 ° C y -48 ° C
para P (4HB).

La caracterización térmica del polímero PHA sintetizado a partir de P. putida LS46123 fue realizada
por Sharma et al. (2017) La degradación térmica de los diferentes polímeros de PHA se obtuvo en
un rango de 248–259 C. De los estudios de DSC, se encontró Tg en el rango de —28.7 a 34.7 ° C y
Tm en el rango de 138-166 ° C. Venkateswar Reddy et al. (2017) utilizaron la bacteria
Pseudomonas pseudoflava para la producción de PHA utilizando diversas fuentes de carbono. No
se observó degradación térmica completa incluso después de 540 ° C debido a la presencia de
material inorgánico.

La tm del polímero PHA de los estudios DSC osciló entre 140–165 ºC. Mohapatra y col. (2016)
estudiaron las características térmicas de los PHA producido a partir de Lysinibacillus sp. a través
del proceso de fermentación sumergida. Se encontró que Tm y Tg de la PHA eran 112 ° C y 11 ° C
respectivamente. La degradación térmica del polímero de PHA se determinó a 114 ° C, 489 ° C y
831 ° C. Esto se debió a la reticulación y la isomerización del PHA extraído.

CONCLUSIONES

El estudio de crecimiento en las especies de algas mostró el crecimiento máximo el día 18 para S.
elongatus BDU 30312, O. salina BDU 10142 y L. valderiana BDU 10121 y 21 ° día para Chlorella sp.,
Con un DCW de 0.32 g / L, 0.99 g / L, 2.74 g / L y 2.74 g / L respectivamente. Los PHA se extrajeron
con éxito de todas las cepas a través del método de extracción con solvente. Los estudios de FTIR
confirmaron la presencia de grupos funcionales en la PHA. El estudio TGA reveló que la
degradación completa tuvo lugar por debajo de 270 ° C para todas las muestras de PHA y el PHA
extraído de L. valderiana tiene la mayor estabilidad térmica en comparación con otras muestras de
PHA de otras cepas de algas. La transición vítrea y la temperatura de fusión de la síntesis los
bioplásticos de tamaño variaron entre 4 y 10 ° C y 79-116 ° C respectivamente en este estudio, las
cepas de algas se cultivaron en condiciones fotoautótrofas para extraer PHA, pero las cepas de
algas se pueden cultivar en condiciones heterotróficas para aumentar el rendimiento y la calidad
de PHA. Las estrategias de inducción, es decir, la reposición o el agotamiento de nitrógeno y
fósforo en el medio también pueden ser una opción para estudiar la capacidad de las cepas de
algas para acumular PHA tanto en condiciones fotoautotróficas como heterotróficas. La
optimización de los factores físicos y químicos para las algas podría aumentar la calidad y la
cantidad de PHA. La evaluación de las características mecánicas y de biodegradabilidad de las
muestras de PHA de algas proporcionaría valor en tiempo real de PHA para estudios de aplicación.
En estudios futuros, se pueden realizar estudios de ingeniería de vías o sistemas metabólicos de
algas para sobreexpresar el gen para acumular PHA. Para colocar el bioplástico de algas en un
camino sostenible, se deben realizar meticulosos e innumerables intentos de I + D en las vías de
mejora de la materia prima, extracción lucrativa y productividad de PHA.