UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO-CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN-BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANAS

LIC. BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

FARMACOGENÓMICA
Grupo: 1001

REPORTE PRÁCTICA 2 Y 3:

“OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LA FRACCIÓN MICROSOMAL S9 DE HÍGADO DE

RATÓN”

Equipo No. 2
MZM
MVLQ

Asesoras:
QFB María Llasbeth Hernández Calderón
QFB Sara Hernández Matilde
pBQD Luis Gerardo Soriano Salas

Fecha de entrega: 29 de septiembre de 2015

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Estado de México 27 de septiembre de 2015

Obtención y Cuantificación de la Fracción Microsomal S9 de hígado de ratón.

Martínez Zamudio Marisol, Medina Velázquez Laura Quetzally

Laboratorio de Farmacogenómica, Sección de Bioquímica y Farmacología Humana, Facultad de Estudios

Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México.

OBJETIVOS

Generales

 Obtención de la fracción microsomal S9 de hígado de ratón inducida con pentobarbial y

benzoflavona para su próxima utilización en el ensayo de ICH.

Particulares

 Realizar la inducción enzimática en ratones con pentobarbital y benzoflavona.

 Obtener la fracción microsomal S9 de hígado de ratones.
 Realizar cuantificación de proteínas de la fracción S9 con la técnica de NuDrop y comparar entre
muestras con y sin inducción enzimática.
 Elaborar un control de esterilidad de las muestras obtenidas, en medio de cultivo sólido y líquido,
para su futura utilización.

HIPÓTESIS

Si se realizó la inducción enzimática de la fracción S9 de hígado de ratón; entonces, la concentración de

proteínas será mayor que en aquellas que no fueron inducidas.

INTRODUCCIÓN

Los citocromos P450 (CYP) constituyen una superfamilia de isoformas que desempeñan un papel importante
en el metabolismo de fármacos. Estas enzimas catalizan reacciones de fase I de biotransformación de
xenobióticos, generalmente introduciendo o exponiendo un grupo funcional hidrofílico en el fármaco.
[ CITATION Qui08 \l 2058 ] Algunas enzimas de esta familia son inducibles, como la CYP1A1, CYP2C9, CYP2E1
y CYP3A4 en humanos. La inducción es una respuesta adaptativa que protege a las células de los
xenobióticos tóxicos al aumentar la actividad de detoxificación. Aunque en algunos casos la inducción es
producida por el aumento en la transcripción del gen correspondiente, también se han descrito mecanismos
no transcripcionales. [ CITATION JHL98 \l 2058 ]

METAS CALENDARIZADAS
 3 al 7 de septiembre: Inducción enzimática en ratones tratados con pentobarbital (primeros 3 días) y
benzoflavona (último día).
 8 De septiembre: Sacrificio de animales de laboratorio, extracción de hígado y obtención de la fracción
microsomal S9.
 22 De septiembre: Cuantifiación de proteínas de las fracciones microsomales y prueba de esterilidad.
 23 y 24 De agosto: Obtención de resultados de la prueba de esterilidad.

MATERIAL

Químico

 Solución de pentobarbital . Dosis: 60 mg/Kg.

 Solución de 5,6-benzoflavona. Dosis: 80 mg/Kg.
 Solución de KC 0.15 M a 4°C
 Solución isotónica de NaCl al 0.9 %
 Medio sólido de agar nutritivo.
 Medio líquido de McCoy 5A modificado.

Biológico

 5 Ratones

Equipo

 Jaula para ratón

 Jeringas de 1 mL con aguja removible
 Campo estéril
 Estuche de disección estéril
 Ultracentrífuga refrigerada.
 Tubos estériles
 Caja Petri estéril
 Homogenizador Dounce estéril
 NuDrop

METODOLOGÍA
 INICIO:
FRACCIÓN MICROSOMAL
S9 PT 2

Balanza con cansatilla,

ratones, marcador
indeleble.

Pesar y marcar a los ratones.

Soluciones de
fármacos.

Administrar al ratón 2, 3, 4 y 5
con pentobarbital 3 días y con
benzoflavona el cuarto día.

Sacrificar a los ratones

mediante dislocación cervical.

R1

Extracción de hígado de
forma estéril

Caja petri con KCl

0.15 M

Pesar y añadir KCl (3mL/g de

tejido)

Dounce

Homogenizar

Centrifuga, tubo
falcon

Centrifugar 9000 rpm/20 min

4°C

R2

Almacenar sobrenadante a
-80°C

FIN
 INICIO:
FRACCIÓN MICROSOMAL S9 PT
2

NuDrop, micropipeta,
puntillas estériles

Cuantificar proteínas mediante

NuDrop

Campana de flujo
laminar, agar
R3
nutritivo, McCoy 5A
modificado.

Sembrar 0.1 mL de fracción

microsomal al medio sólido y 3
gotas al medio líquido.

Revisar a las 24, 48 y 72 hrs.

Ciomprobar visualmente
crecimiento bacteriano.

R4

FIN
R1: Residuos anatómicos, cadáver: Envolver con papel estraza y etiquetar, almacenar en congelador para
posterior incineración.

R2: Restos (pellet) de tejido hepático: Almacenar en bolsa roja de polietileno para su posterior incineración.

R3: Puntillas: Almacenar en recipiente para su inactivación.

R4: Medios de cultivo: Almacenar para su inactivación y desecho correspondiente.

COMPETENCIAS

Teóricas

 Se conoció a la superfamilia Citocromo P450, así como los fármacos más utilizados para la inducción de
la misma. Se recordó el fundamento de los principales métodos para la cuantificación de proteínas y las
pruebas básicas para el control de esterilidad de productos biológicos.

Prácticas

 Se perfeccionó la técnica de administración de fármacos por vía intraperitoneal en ratones.

 Se mejoró la técnica para sacrificar ratones por medio de dislocación cervical.
 Se practicó y reforzó las técnicas de disección y extracción de hígado de ratón, así como la
homogenización del mismo por medio del Potter (Dounce).
 Se aprendió a utilizar el equipo NuDrop para cuantificación de proteínas.
 Se pusieron a prueba las habilidades para trabajar en campana de flujo laminar en ambiente estéril.

Éticas

 Se reforzó la importancia del manejo adecuado de los animales del laboratorio para brindarles un trato
humanista y proporcionarles una muerte digna.

RESULTADOS

Tabla No 1 Características de los ratones utilizados en la práctica.

Eq Ratón Peso Ratón (g) Peso hígado (g)

4 Blanco 36.7 1.4
1 1 33.2 1.8
2 2 33.9 1.5
3 3 29.7 1.6
4 4 27.4 1.4

Tabla No 2 Concentración de proteínas en fracción S9 y resultados de las pruebas de esterilidad.

Ratón Concentración Agar MaCoy 5S
de proteínas nutritivo* modificado** * ( + ): Se observan crecimiento bacteriano; ( - )
(mg/mL) (placa) (líquido) No se observa crecimiento bacteriano.
1 74.378 + Amarillo
2 73.028 + Amarillo ** Amarillo: Color del medio indica
3 69.473 + Amarillo contaminación por crecimiento bacteriano; Rosa:
4 68.925 - Rosa Color del medio indica sin crecimiento
Blanco 21.5 - Rosa bacteriano.

(A) (B)
Imagen No 1 Lectura de pruebas de esterilidad a 24hrs. (A)
Medio Líquido MaCoy 5A modificado, no se observa
turbidez en el medio y éste preserva su color rosa,
indicando que no hay productos que evidencien
crecimiento bacteriano. (B) No se observa crecimiento
bacteriano en la placa.
(A) (B)
Imagen No. 2 Lectura de pruebas de esterilidad a 48hrs.
(A) Medio Líquido MaCoy 5A modificado, se observa
turbidez en el medio y éste viró de rosa a amarillo debido a
los productos metabólicos de las bacterias evidenciando el
crecimiento bacteriano. (B) Se observa crecimiento
bacteriano en colonias blancas, cremosas y redondas.
DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

1. JBS Haldane (1927). «A Mathematical Theory of Natural and Artificial Selection, Part V: Selection and
Mutation». Mathematical Proceedings of the Cambridge Philosophical Society 23 (7): 838–844.
2. Griffiths, J .F. A. et al. (2002). Genética (7ª edición). McGraw-Hill Interamericana.
3. IPGRI y Cornell University, (2004) Análisis de la diversidad genética utilizando datos de marcadores
moleculares: Módulo de aprendizaje Conceptos básicos de genética de poblaciones Disponible
online:
http://web.ecologia.unam.mx/laboratorios/fmolina/pdf/lab/gen/conceptos_basicos_genetica_de_p
oblaciones.pdf Revisado el 01 de septiembre de 2015
4. L. Cavalli-Sforza / W. F. Bodmer, Genética de poblaciones humanas, Ediciones Omega S. A. Barcelona
1981
5. Guo and Reed; Reed, D. R. (2001). "The genetics of phenylthiocarbamide perception". Annals of
Human Biology 28 (2): 111–142

ANEXOS
ANOVA

RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Columna 1 1 21.5 21.5 #¡DIV/0!
Columna 2 4 285.804 71.451 7.115806

ANÁLISIS DE
VARIANZA
Origen de
las Suma de Grados de Promedio de Probabilida Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F d para F
1996.08192 280.513819 10.1279644
Entre grupos 1 1 1996.081921 6 0.00046344 9
Dentro de
los grupos 21.347418 3 7.115806

2017.42933
Total 9 4        

Alfa: 0.05