Microbiología de los alimentos 82 (2019) 75–81

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Microbiología alimentaria

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Identificación de productores de cereulida Bacillus cereus por MALDI-TOF MS

Sebastián Ulrich a , ∗ , Christoph Gottschalk a , Richard Dietrich B , Erwin Märtlbauer B ,

Manfred Gareis a
a Seguridad alimentaria, Facultad de veterinaria, Ludwig-Maximilians-University Munich, Schoenleutnerstr. 8, 85764, Oberschleissheim, Alemania
B Higiene y Tecnología de la Leche, Facultad de Veterinaria, Universidad Ludwig-Maximilians-Munich, Schoenleutnerstr. 8, 85764, Oberschleissheim, Alemania

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: los Bacilo (B.) cereus grupo consta de nueve especies reconocidas que están presentes en todo el mundo. B. cereus Desempeñan un papel importante en las enfermedades
MALDI-TOF MS transmitidas por los alimentos al producir diferentes toxinas. Sin embargo, solo un pequeño porcentaje de B. cereus
Bacillus cereus Las cepas pueden producir la cereulida termoestable, el agente causante de la intoxicación alimentaria emética. Para minimizar la entrada de emético B.
Cereulida
cereus En la cadena alimentaria, los operadores de empresas alimentarias dependen de métodos eficientes y fiables que permitan diferenciar entre cepas
Intoxicación alimentaria
eméticas y no eméticas.
Actualmente, solo se dispone de bioensayos celulares, métodos moleculares y espectrometría de masas en tándem que requieren mucho tiempo para este
propósito. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue establecer un método rápido y confiable para la diferenciación entre cepas eméticas / no eméticas por
MALDI-TOF MS. Cepas / aislados seleccionados de la B. cereus
grupo así como otros Bacilo spp. (n total = 121) se cultivaron en agar sangre de oveja durante 48 h antes del análisis.
Posteriormente, los cultivos se analizaron directamente mediante MALDI-TOF MS sin pasos de extracción previos. Las muestras se midieron en
el rango de masa de m / z 800–1800 Da. Utilizando el software estadístico ClinProTools 3.0 y el software de análisis Flex (Bruker Daltonics GmbH,
Bremen, Alemania), fue posible una diferenciación entre aislamientos eméticos / no eméticos con una tasa de identificación correcta del 99,1%
mediante la evaluación de dos biomarcadores específicos ( m / z 1171 y 1187 Da).

1. Introducción
Bacilo (B.) Las especies (spp.) son bacterias Gram positivas, en forma de bastoncillos, formadoras de
endosporas que se encuentran en todo el mundo. los B. cereus El grupo es genéticamente muy homogéneo
y comprende nueve especies reconocidas:
B. anthracis, B. cereus en sentido estricto, B. cytotoxicus, B. mycoides, B. pseu- domycoides, B.
thuringiensis, B. toyonensis, B. weihenstephanensis y B. wiedmannii ( Miller y col., 2018; Vos et al.,
2011 ). Sus esporas son resistentes al calor, ácido, ultravioleta (UV) y a la desecación y sobreviven a
la pasteurización ( Bottone, 2010; Clavel y col., 2004 ).
enterotoxina hemolítica) así como citotoxina K1 ( Schoeni y Wong, 2005; Stenfors Arnesen et al.,
2008 ). En contraste, la forma emética es causada por la pequeña cereulida depsipéptido cíclica
estable al calor, codificada por genes de péptido sintetasa no ribosómico ( ces) Ehling-Schulz, Vukov y
otros, 2005 ). La cereulida sin ninguna modificación estructural tiene una masa molecular de 1153 Da
(Da) y generalmente se detecta como el ion aducto de amonio en las mediciones de LC-ESI-MS ( Haggblom
et al., 2002 ). Recientemente, se han descrito 18 variantes de cereulida con masas moleculares que
varían de 1147 a 1205 Da. Curiosamente, la citotoxicidad de los diferentes análogos difiere
ampliamente, por ejemplo, la toxicidad de la isocereulida A es ocho veces mayor que la de la
cereulida ( Marxen y otros, 2005 , 2015 ).

Debido a la persistencia de esporas en los alimentos y a la capacidad de las células vegetativas

para producir diferentes toxinas, los aislamientos del B. cereus El grupo juega un papel importante en la
seguridad alimentaria. Varias publicaciones informan sobre un número creciente de casos de
intoxicaciones alimentarias causadas por B. cereus ( Centro Europeo para la Prevención y el Control de
Enfermedades, 2013; Messelhausser et al., 2014 ). Básicamente, las toxinas del B. cereus grupo puede
resultar en dos formas diferentes de intoxicación alimentaria: emético versus diarreico ( Bottone, 2010 ).
La forma diarreica es causada por proteínas termolábiles, es decir, los dos complejos de
enterotoxina Hbl (enterotoxina hemolítica BL) y Nhe (no-
Emético B. cereus Las cepas representan un peligro importante en la restauración colectiva y con
frecuencia se informa como el agente causante de brotes transmitidos por alimentos ( Ehling-Schulz et
al., 2015; Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades, 2013 ). La formación de
cereulida en el tracto digestivo rara vez se observa, si es que ocurre. La intoxicación suele ser causada
por la ingestión de una toxina preformada en los alimentos por ces- positivo B. cereus cepas Ehling-Schulz
et al., 2015 ). La identificación directa de toxinas en los alimentos se puede realizar mediante LC-MS / MS
(cromatografía líquida de alta resolución-masa

∗ Autor correspondiente. Seguridad alimentaria, Facultad de Medicina Veterinaria, LMU Munich, Schoenleutnerstr. 8, 85764, Oberschleissheim, Alemania.

Dirección de correo electrónico: ulrich@ls.vetmed.uni-muenchen.de (S. Ulrich).

https://doi.org/10.1016/j.fm.2019.01.012
Recibido el 17 de mayo de 2018; Recibido en forma revisada el 11 de enero de 2019; Aceptado el 21 de enero de 2019 On-line el 23 de
enero de 2019
0740-0020 / © 2019 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
S. Ulrich y col. Microbiología de los alimentos 82 (2019) 75–81

espectrometría). Estos métodos son capaces de identificar y cuantificar la toxina con una alta
sensibilidad ( Haggblom y col., 2002; En't Veld et al., 2018; Rønning et al., 2015 ). Generalmente, las
matrices de alimentos ricas en carbohidratos, como la pasta y el arroz, así como la leche y los
productos lácteos, se asocian con un mayor riesgo de causar intoxicaciones por cereulida ( Delbrassinne
y col., 2012; Messelhausser et al., 2014 ). Los síntomas se caracterizan principalmente por la vómito
poco después de la ingestión de la toxina y, en promedio, cesan después de un día. No obstante, los
casos graves requieren hospitalización y se han publicado varios informes de insuficiencia orgánica
mortal ( Dierick y col., 2005; Mahler y col., 1997; Naranjo et al., 2011; Posfay-Barbe et al., 2008;
Tschiedel et al., 2015 ). Para poder tomar medidas preventivas en las empresas alimentarias, las
bacterias viables deben detectarse antes de la producción de toxinas. Tales medidas incluyen, por
ejemplo, la eliminación de materias primas contaminadas con sustancias potencialmente eméticas. B.
cereus son. Para la aplicación de planes específicos de control de peligros, una diferenciación entre
eméticos y no eméticos B. cereus las cepas son necesarias. Sin embargo, esto requiere la
disponibilidad de un método de cribado rápido y confiable con un alto rendimiento. Emético y no
emético B. cereus Las cepas no se pueden distinguir por los métodos de cultivo estándar utilizados
para el aislamiento ( Ehling-Schulz et al., 2015; Stenfors Arnesen et al., 2008 ). Por tanto,
principalmente los métodos moleculares ( Castiaux et al., 2014; Fricker et al., 2007 ) se aplican para
diferenciar B. cereus cepas Ehling-Schulz y col., 2004; Ehling-Schulz y col., 2006 ; Ehling-Schulz,
2005b ). Además, los bioensayos HEp-2 / MTS se pueden utilizar para identificar tóxicos y no tóxicos. B.
cereus cepas Beattie y Williams, 1999; Stark y col., 2013 ). Sin embargo, estos métodos requieren
mucho tiempo, son difíciles y costosos.

Durante algunos años, MALDI-TOF MS (desorción láser asistida por matriz / espectrometría de
masas de tiempo de vuelo de ionización) se utiliza ampliamente para la identificación de rutina de
microorganismos ( Clark y col., 2013 ). Este método es extremadamente robusto, rápido y adecuado para
que lo opere el personal de laboratorio sin un conocimiento profundo de la técnica en sí, ya que los
resultados se generan automáticamente a través de un software estadístico altamente sofisticado. Sin
embargo, los intentos anteriores de aplicar esta técnica para identificar eméticos

B. cereus las cepas no tuvieron éxito Fiedoruk et al., 2016 ). Fiedoruk y col. (2016) describió un
enfoque MALDI-TOF MS para la diferenciación de eméticos y no eméticos B. cereus cepas midiendo Figura 1. Perfil de los analizados B. cereus cepas / aislamientos mostrados como espectros de suma ( Figura 1 a; cepas
proteínas en el rango de masa de m / z 4000-12000 Da. El método MALDI-TOF MS se consideró eméticas en rojo, cepas no eméticas en verde) y en vista de banda ( Figura 1 B).

como un enfoque prometedor y rápido para la preselección de cepas, pero no se consideró un

método totalmente confiable para distinguir emético de no emético. B. cereus son.

2.2. Cepas y condiciones de cultivo bacteriano

El objetivo de este estudio fue establecer un método de EM MALDI-TOF para una diferenciación
confiable entre eméticos y no eméticos. B. cereus
cepas analizando directamente la biomasa obtenida tras el cultivo B. cereus en agar sangre. Todas
las cepas en estudio se analizaron en paralelo mediante técnicas moleculares validadas (PCR) y
bioensayo (cultivo celular) para determinar su capacidad para producir la toxina emética cereulida.
2. Material y métodos
2.1. Productos quimicos
El agar Columbia con un 5% de sangre de oveja se adquirió de VWR (Darmstadt, Alemania). La
matriz MALDI-TOF MS CHCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico), agua dest. y acetonitrilo se
obtuvieron de Fluka (Fluka, Dageb ό ll, Alemania). El ácido trifluoroacético (TFA) y el ácido clorhídrico
se obtuvieron de Merck (Merck, Hamburgo, Alemania). El patrón de cereulida sintético adquirido en
Chiralix (Países Bajos) se disolvió en etanol a una concentración de 1 mg / ml y se usó para
determinar el límite de detección del método MALDI-TOF MS aplicado.
En total, 117 B. cereus cepas / aislados sensu lato y otras 4 Bacilo
spp., que se encuentran comúnmente en los alimentos, se examinaron y diferenciaron con respecto a
su potencial tóxico (producción de cereulida). los B. cereus
sensu lato set comprendió 100 aislamientos (ver Tabla 2), 13 cepas de referencia (ver Tablas 3) y 4 aislados
eméticos de baja producción (ver Cuadro 4 ). Las cepas de referencia se adquirieron de DSM
(Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), los aislados analizados fueron parte de
la colección de cultivos de la Cátedra de Higiene y Tecnología de la Leche (MHI, Departamento de
Ciencias Veterinarias, LMU Munich). Los aislados y las cepas en estudio se almacenaron antes de su
uso a -80 ° C mediante el sistema MAST CryobankTM para la conservación a largo plazo de las
bacterias. Emético B. weihenstephanensis ( MC 118) fueron proporcionados por Weihenstephan Bacillus
cereus colección (TU Munich). Todos B. cereus Las cepas fueron analizadas por métodos moleculares
(ensayo de PCR) y bioensayos (prueba de citotoxicidad HEp-2) para determinar su potencial para
producir la toxina emética de acuerdo con la metodología descrita en estudios previos ( Wehrle et al.,
2009, 2010 ). En resumen, los aislamientos en estudio se enriquecieron en medio de leche desnatada
(SMM) durante 18 ha 32 ° C y, después del autoclave, se analizaron para determinar la producción de
cereulida mediante una prueba de citotoxicidad basada en células HEp-2 como se describe en

La matriz para MALDI-TOF MS se preparó de acuerdo con Meetani y Voorhees (2005) disolviendo Ehling-Schulz (2005b) . Los análisis de PCR han sido descritos en detalle por
10 mg de CHCA en 1 ml de disolvente orgánico (700 μl de acetonitrilo, 300 μl de agua destilada, 1 μl Wehrle y col. (2009) , CesF1 y CesR2 se utilizó como par de cebadores. Para las mediciones de EM
de TFA). de MALDI-TOF, las cepas / aislados en estudio se

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S. Ulrich y col.
tabla 1
Estadística de picos de ClinProTools para los picos de masa seleccionados utilizados para la diferenciación de no eméticos (clase 1) y eméticos (clase 2) B. cereus son.
Pico de masa valor p Intensidad media clase 1 (a. Intensidad media clase 2 (a.
t- prueba/ u.) u.)
ANOVA
1171 <0.05 1,26 6.6
1187 <0.05 1,11 11.32
au: unidades arbitrarias; AUC: área bajo curva.
cultivado durante 48 ha 37 ° C en Columbia Agar con 5% de sangre de oveja (pH
7,3 ± 0,2).
2.3. preparación de la muestra
Una pequeña cantidad (una punta de una barra de aplicación de madera) de una colonia se
transfirió directamente desde el medio de cultivo a un objetivo de acero rectificado (placa de objetivo
MTP 384 acero rectificado BC, Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Alemania). La mancha se cubrió
con 1 μl de matriz (CHCA) y se secó al aire a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C).
Después de secar la mancha, la muestra se cubrió de nuevo con 1 µl de matriz (CHCA) y se dejó
secar al aire a temperatura ambiente.
2.4. Procesamiento de datos y mediciones MALDI-TOF MS
Se utilizó un Autoflex Speed MALDI-TOF / TOF MS (Bruker Daltonics GmbH, Bremen,
Alemania) para las mediciones que se realizaron en modo lineal positivo ( m / z 800-1800 Da).
Se establecieron los siguientes parámetros: recorrido aleatorio de muestra parcial con diez
disparos en un punto raster con un diámetro límite de 2000 μm; La frecuencia de muestreo y la
configuración del digitalizador se establecieron en 2,00 GS / s, el láser smartbeam se fijó en "plano"
con una frecuencia de 1000,0 Hz. Para la medición automática, se creó un método "AutoX" utilizando
el software "flex control". Los ajustes básicos del láser fueron energía láser 68–78% (compensación
global del atenuador 24%) con los siguientes ajustes de alto voltaje: fuente de iones 1, 19,50 kV;
fuente de iones 2, 18,2 kV; lente, 7,0 kV; extracción de iones pulsados ajustada a 340 ns. En total, se
acumularon 1000 espectros individuales por 200 disparos.
El estándar de prueba bacteriana (BTS) de Bruker Daltonics GmbH (rango de masa:
3637,8–16,952,3 Da) se utilizó como estándar de calibración de forma regular una vez a la semana.
Durante cada medición, se utilizó para la calibración el péptido estándar II de Bruker Daltonics GmbH
(rango de masa: 700–3500 Da).
Todos los aislamientos se cultivaron dos veces en días diferentes (réplicas biológicas, n = 2) y
cada una de las ocho réplicas técnicas se midieron por réplica biológica. Para la diferenciación de las
cepas eméticas y no eméticas, se aplicó el algoritmo genético del software de análisis estadístico
ClinProTools 3.0 (Bruker Daltonics GmbH, Bremen) con los siguientes ajustes: máximo de picos: 4;
número máximo de generaciones: 40; tasa de mutación: 0,2; tasa de cruce: 0.5. Se desarrollaron
modelos estadísticos con diez no eméticos (clase 1, cepas no. 86, 1475-9 y 1481-4) y diez eméticos
(clase 2, cepas no. 280, 1305,
1326, 1471, 1485-7, 1515, 1517 y 1528) aislados (n = 20, 160 espectros). Para la validación externa
según el software, se procesaron cinco cepas eméticas (cepas no. 1533-5, 1538 y 1542) y cinco
cepas no eméticas (cepas no. 1489-93) (n = 10, n = 80 espectros de masas) . Todos los demás
aislamientos se utilizaron para la clasificación (ver Tabla 2 ). Para un control de calidad adicional,
todos los espectros se comprobaron visualmente en busca de diferencias en los picos de masa con
el software de análisis Flex (Bruker Daltonics GmbH).
Para evaluar la sensibilidad de la técnica MALDI-TOF MS aplicada, se analizó un patrón de
cereulida sintética disponible comercialmente a concentraciones variables. Para este propósito, el
estándar de toxina se colocó directamente sobre el objetivo, se secó al aire y se superpuso con la
matriz de CHCA. El estándar se midió en concentraciones de 0,001 a 10 μg /
ml.
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Microbiología de los alimentos 82 (2019) 75–81
Clase de desviación estándar Clase de desviación estándar Característica de funcionamiento del receptor 1 (%)
2 (%) (AUC)
0,53 2,96 0,99
0,33 6,72 1,00
3. Resultados
En una prueba preliminar, los espectros de masas de veinte B. cereus Las cepas / aislados (diez
aislados eméticos y no eméticos cada uno) cultivados en agar sangre durante 48 h se analizaron
mediante MALDI-TOF MS. El procesamiento de los espectros de masas se realizó mediante modelos
estadísticos del software ClinProTools 3.0. Los resultados obtenidos indicaron la aplicabilidad básica
del método para la diferenciación de cepas eméticas y no eméticas (resultados no mostrados). En
general, cada espectro de masas constaba de aproximadamente 38 picos de masa discernibles. Dos
picos de masa que aparecieron consistentemente en todos los espectros de masas de las cepas
eméticas tenían diferencias de intensidad prominentes adecuadas para la diferenciación ( m / z [ masa
por carga] 1171 y 1187 Da). Las cepas eméticas mostraron claramente estos dos picos de masa en
sus espectros de masas, mientras que estos picos de masa no fueron detectables dentro de los
espectros de las cepas no eméticas ( Figura 1 a y B).
Para probar aún más la aplicabilidad general del método desarrollado, una amplia gama de B.
cereus aislamientos incluyendo un emético B. weihen- stephanensis previamente descrito por Thorsen
y col. (2006) y 17 Bacilo spp. cepas de referencia Tabla 3 ) fueron analizados ( Guerin et al., 2017 ).
Estos análisis se realizaron como un estudio ciego, es decir, el experimentador MALDI-TOF MS
desconocía la asignación de los aislamientos. Resultados resumidos en Tabla 2 ( B. cereus aislamientos)
y Tabla 3 (cepas de referencia) corroboraron los hallazgos del estudio preliminar. Además, la
reproducibilidad de los análisis se demuestra por el hecho de que m / z- las variaciones de las réplicas
biológicas y tecnológicas para las cepas eméticas fueron inferiores a 1 Da. Las variaciones en la
intensidad de las réplicas biológicas y tecnológicas variaron de 0,1 a 0,3 unidades arbitrarias (au)
para las cepas eméticas.
Se obtuvieron diferencias significativas (p <0.05) entre las intensidades de pico promedio de los
dos conjuntos de datos diferentes (clase no emética 1 y clase emética 2) mediante t- prueba / ANOVA
y los valores de la característica operativa del receptor (ROC) ( tabla 1 ). Estas diferencias permitieron
la identificación confiable de cepas eméticas. Las intensidades medias de los picos de masa variaron
de 1,11 a 11,32 au. Los valores de ROC variaron de 0,99 a 1,00 AUC (área bajo curva). Ambos picos
de masa se incluyeron en el modelo de diferenciación ya que fueron evidentes diferencias
significativas en las intensidades de los picos de masa entre las cepas eméticas y no eméticas. La
diferencia en las intensidades medias fue de 5,34 para el m / z Pico de masa de 1171 Da y 10,21 para
el m / z 1187 Da pico de masa. La desviación estándar relativa para las intensidades de los picos de
masa varió de 0,33 a 6,72% ( tabla 1 ).
En general, el modelo estadístico basado en las diferencias de intensidad de pico de masa
promedio de los picos de masa antes mencionados permitió la diferenciación confiable entre cepas
eméticas (42) y no eméticas (75), incluidas 17 cepas de referencia ( Tablas 2 y 3 ). Todos los
espectros de masas también se evaluaron visualmente utilizando el software “análisis flexible”
(Bruker Daltonics GmbH) con el fin de detectar los picos de masa mencionados anteriormente. En
conjunto, se logró una consistencia del 100% de los resultados de la EM de MALDI-TOF con los
resultados de la caracterización de las cepas mediante bioensayo y PCR.
Como varios estudios previos han señalado una gran variabilidad en la productividad de toxinas
del emético B. cereus cepas, además analizamos cuatro de baja producción B. cereus aislamientos Cuadro
4 ). Aparte del aislado IH 41385 que es bien conocido por su productividad extremadamente baja,
probablemente causada por una mutación puntual en el ces gen Stark y col., 2013 ), todos los demás
aislamientos de baja producción analizados fueron
S. Ulrich y col. Microbiología de los alimentos 82 (2019) 75–81

Tabla 2 Tabla 2 ( continuado)

Diferenciación entre emético (+) y no emético (-) B. cereus aislados por MALDI-TOF MS. La clasificación
de los aislados en estudio se basó en los resultados del bioensayo (ensayo de citotoxicidad) y análisis No. (MHI) Origen MALDI-TOF MS a Bioensayo / PCR B

de PCR. Los aislamientos utilizados para el desarrollo de modelos estadísticos y la validación externa
1569 HOLA + +/+
están marcados con "s" y "v", respectivamente.
1571 HOLA + +/+
1654 EI + +/+
1664 FI + +/+
No. (MHI) Origen MALDI-TOF MS a Bioensayo / PCR B
1665 FI + +/+

86 s FI - -/- 1670 FI - -/-

280 s FI + +/+ 1672 FI + +/+

1305 s FI + +/+ 1673 FI + +/+

1326 s HOLA + +/+ 1678 FI - -/-

1471 s FI + +/+ 1699 FI + +/+

1475 s FI - -/- 1701 HOLA + +/+

1476 s FI - -/- 1745 FI + +/+

1477 s FI - -/- 1885 EI - -/-

1478 s FI - -/- 2011 HOLA + +/+

1479 s FI - -/- 2049 HOLA + +/+

1481 s FI - -/- 2058 HOLA + +/+

1482 s FI - -/- 2350 FI - -/-

1483 s FI - -/- 2507 FI - -/-

1484 s EI - -/- 2572 FI + +/+

1485 s FI + +/+ 3032 FI + +/+

1486 s FI + +/+ 3104 FI - -/-

1487 s HOLA + +/+ 3108 FI - -/-

1489 v FI - -/- 3161 HOLA - -/-

1490 v FI - -/- 3168 FI + +/+

1491 v FI - -/- 3178 HOLA - -/-

1492 v FI - -/- 3185 HOLA - -/-

1493 v FI - -/- 3236 FI + +/+

1494 FI - -/- 3322 FI - -/-

1495 FI - -/- B. weihenstephanensis

1496 FI - -/- MC 118 C EI + +/+

1497 FI - -/- MHI 184 EI - -/-

1499 FI - -/-
1500 FI - -/- -: cepas no eméticas +: cepas eméticas; FI: alimento aislado; HI: aislado humano; EI: aislamiento
ambiental.
1501 FI - -/-
a Biomarcadores ( m / z 1171 y 1187 Da) detectables (+) o no detectables (-).
1502 FI - -/-
1503 FI - -/- B Aislamientos marcados con "s" y "v", así como B. weihenstephanensis se volvieron a analizar para este estudio

1508 FI - -/- como se describe en la sección de materiales / métodos. Para todos los demás aislamientos, los datos son de Wehrle y
1509 FI - -/- col. (2009) o fueron analizados en nuestro laboratorio en otros estudios inéditos.
1510 FI - -/-
1511 FI - -/- C Descrito originalmente como emético B. weihenstephanensis ( Thorsen y col., 2006 ); obtenido del
1512 FI - -/-
WSBC Weihenstephan Bacillus cereus colección, ZIELWeihenstephan, TU Munich (Alemania).
1513 FI - -/-
1514 FI - -/-
1515 s FI + +/+
1516 FI - -/-
1517 s FI + +/+
1518 FI - -/- Tabla 3
1519 FI - -/- Análisis de Bacilo spp. escribe ( T) y otras cepas de referencia por MALDI-TOF MS y bioensayos específicos
1520 FI - -/- de cereulida / PCR.
1521 FI - -/-
1522 FI - -/- Tensión Especies MALDI-TOF MS a Bioensayo / PCR

1523 FI - -/-
B. cereus sensu stricto DSM
1524 FI - -/-
31 T
B. cereus - -/-
1525 FI - -/-
DSM 2301 B. cereus - -/-
1526 FI - -/-
DSM 4222 B. cereus - -/-
1527 FI - -/-
DSM 4282 B. cereus - -/-
1528 s FI + +/+
DSM 4312 B. cereus + +/+
1529 FI - -/-
DSM 4384 B. cereus - -/-
1530 FI - -/-
DSM 8438 B. cereus - -/-
1531 FI - -/-
B. cereus grupo
1532 FI - -/-
1533 v FI + +/+
DSM 22905 T B. citotoxicus - -/-
DSM 2048 T B. mycoides - -/-
1534 v FI + +/+
DSM 12442 T B. pseudomycoides - -/-
1535 v FI + +/+
1538 v FI + +/+
DSM 2046 T B. thuringiensis - -/-
DSM 11821 T B. weihenstephanensis - -/-
1542 v FI + +/+
1548 HOLA + +/+
DSM 102050 T B. wiedmannii - -/-
Otro Bacilo spp.
1549 FI + +/+
DSM 7 T B. amyloliquefaciens - -/-
1550 HOLA + +/+
1553 FI + +/+
DSM 10 T B. subtilis - -/-

1559 FI + +/+
DSM 13 T B. licheniformis - -/-

1562 HOLA + +/+

DSM 27 T B. pumilus - -/-

1566 HOLA + +/+

1567 HOLA + +/+ -: cepas no eméticas +: cepas eméticas.
a Biomarcadores ( m / z 1171 y 1187 Da) detectables (+) o no detectables (-).
1568 HOLA - -/-

78
S. Ulrich y col.
Cuadro 4
Productividad de toxinas de baja producción B. cereus aísla de acuerdo con publicaciones anteriores y datos internos.
B. cereus Productividad de toxinas (ng de cereulida / mg de peso fresco de biomasa) a
Aisla
IH 41385 0,5-1
RIVM BC379 7-9
UHDAM B315 50–90
RIVM BC51 Dakota del Norte
Control de cepas
DSM 4312 (F 4810/72) MHI 240–600
1305 170-200
au: unidades arbitrarias; nd: no detectado.
a Los datos son de Carlin y col. (2006) ; en este estudio B. cereus se cultivó en placas de TSA y la biomasa se extrajo con metanol.
B Los datos son de Stark y col. (2013) ; en este estudio B. cereus se enriqueció en caldo LB y los sedimentos celulares se extrajeron con etanol.
C Datos internos; B. cereus fue enriquecido en medio de leche desnatada. El caldo esterilizado en autoclave se analizó mediante un ensayo de citotoxicidad basado en células HEp-2.
D Biomarcadores (m / z 1171 y 1187 Da) detectables (positivos) o no detectables (negativos).
Figura 2. Medición de patrón de cereulida sintética en diferentes concentraciones en comparación con un
emético B. cereus cepa (cepa núm. 1305).
identificado como emético B. cereus cepas aplicando la técnica MALDI-TOF MS establecida ( Cuadro
4 ). La alta sensibilidad del método desarrollado también fue confirmada por los análisis de un patrón
de cereulida sintético. Midiendo diferentes concentraciones de esta preparación sintética, el límite de
detección fue de 1.0 μg / ml cuando se siguió el protocolo de preparación de muestras descrito.
4. Discusión
Bacillus cereus es abundante en el medio ambiente y, por lo tanto, se encuentra con frecuencia
en los alimentos. Bajos niveles de B. cereus las células o esporas están presentes en prácticamente
todos los productos agrícolas crudos. Particularmente las hierbas y otros alimentos con contacto
directo con el suelo tienen un alto riesgo de contaminación con B. cereus ( Ceuppens et al., 2013;
Stenfors Arnesen et al., 2008 ). Debido a su potencial de intoxicación alimentaria, niveles más altos de B.
cereus en los alimentos constituyen un peligro para la salud pública y representan un problema
importante para la industria alimentaria. Esto se aplica particularmente a las cepas eméticas capaces
de producir grandes cantidades de cereulida termoestable en los alimentos. Dependiendo de la
categoría de alimentos investigada, las tasas de prevalencia de las cepas eméticas muestran una
amplia variabilidad. Se han informado porcentajes en el rango de <1% en hortalizas a> 20% en
productos farináceos ( Biesta-Peters et al., 2016; Delbrassinne y col., 2012; Ehling- Schulz et al., 2015 ).
Mejorar los conceptos basados en HACCP (análisis de peligros y puntos críticos de control) y
prevenir intoxicaciones alimentarias por emético B. cereus es necesario identificar las fuentes de
contaminación en la cadena de producción alimentaria ( Messelhausser et al., 2014 ). Esto requiere
estrategias de diagnóstico novedosas, ya que los enfoques morfológicos o microscópicos son casi
inútiles para la diferenciación de eméticos y no eméticos. B. cereus cepas Ehling-Schulz et al., 2005a,
b ). Actualmente, la identificación de cepas eméticas solo es posible mediante métodos complejos y
sofisticados.
79
Microbiología de los alimentos 82 (2019) 75–81
Intensidad de la señal de MS (au) B Actividad citotóxica (título recíproco) C Resultados de MALDI-TOF D
huellas <10 negativo
<50 76 positivo
> 200 143 positivo
<50 > 1000 positivo
> 150 > 1000 positivo
> 75 230 positivo
como PCR, bioensayos o espectrometría de masas ( Ehling-Schulz y col., 2004; Fiedoruk et al., 2016;
Messelhausser et al., 2014; Rønning et al., 2015; Stark y col., 2013 ).
Por el contrario, MALDI-TOF MS se puede utilizar como un método de detección rápida para
análisis microbiológicos de rutina, ya que se requiere un pretratamiento mínimo de la muestra. Por
tanto, esta técnica parece ser el método de elección para la diferenciación de cepas eméticas y no
eméticas. Sin embargo, hasta el momento solo se ha publicado un estudio en el que se evaluó la
aplicabilidad de esta técnica a este propósito ( Fiedoruk et al., 2016 ). En principio, los autores
utilizaron un enfoque indirecto midiendo las diferencias en los perfiles de espectros de masas en el
modo de ionización lineal positiva en el rango de m / z 4000-12 000 Da. En definitiva, tras analizar
más de 100 B. cereus aislados, los autores declararon que el perfil proteómico de células enteras por
MALDI-TOF MS no es un método suficientemente confiable para distinguir eméticos y no eméticos B.
cereus
aislamientos. La diferenciación de Bacilo spp. dentro de Bacillus cereus
sensu lato group no es posible a través de MALDI-TOF MS utilizando solo bases de datos
comerciales ( Fernández-No et al., 2013 ).
Por lo tanto, en el presente estudio se eligió un enfoque directo para diferenciar entre cepas
eméticas y no eméticas. Obviamente, el enfoque directo tiene la limitación de depender de la
producción de cereulida en el medio de cultivo y de la temperatura utilizada para el cultivo. Si una
cepa tiene la capacidad de producir cereulida durante las condiciones de cultivo utilizadas para el
precultivo, el resultado de la medición de MALDI-TOF MS sería falso negativo. En principio, como se
describió anteriormente para muchas otras toxinas bacterianas, la producción de cereulida depende
en gran medida de las condiciones de crecimiento y enriquecimiento aplicadas ( Ehling-Schulz et al.,
2015; Kranzler et al., 2016 ). Para la evaluación de la productividad de toxinas del emético B. cereus cepas,
en estudios previos la incubación en agar tríptico de soja (TSA) hasta diez días a 28 ° C fue seguida
de extracción con disolventes orgánicos ( Andersson y col., 1998 ). Un enfoque más rápido fue
utilizado por Stark y col. (2013) en el que los aislados se precultivaron en caldo LB (lisogenia) (TSB,
caldo de soja tríptica) y luego se enriquecieron durante la noche a 24 ° C. Sin embargo, la posterior
extracción del sedimento celular tardó hasta 17 h. Si bien ambos medios de cultivo dieron como
resultado altas cantidades de toxinas, no se pudo observar productividad de toxinas en otros medios
como BHI (infusión cerebro-corazón) y caldo de peptona comúnmente utilizado para el
enriquecimiento de bacterias ( Finlay y col., 2000 ). Menos conocido es el hecho de que el agar sangre
también representa un medio excelente para la producción de cereulida ( Jääskeläinen y otros, 2003 ).
Casualmente, Bruker Daltonics también recomienda el cultivo de bacterias en agar sangre a 37 ° C
para la identificación de bacterias mediante MALDI-TOF MS ( Bruker Daltonics, 2014 ). Por lo tanto,
parecía posible desarrollar un método de análisis simple y rápido para la diferenciación de eméticos y
no eméticos. B. cereus aisla. El análisis de más de 100 aislamientos confirmó esta suposición de
manera impresionante. La similitud de los picos de masa ( m / z 1171 y 1187 Da,
Figura 1 ) encontrado después de analizar células enteras de cepas eméticas con el
S. Ulrich y col.
picos de masa detectados del patrón de cereulida ( Figura 2 ), indica claramente que estos picos de
masa representan la cereulida producida por las cepas en agar sangre. Además, como los cultivos
bacterianos se midieron directamente en placas de agar sangre, los análisis se completaron en 5
minutos.
En general, el método funcionó muy bien, 120 de 121 cepas / aislamientos probados, incluido un
emético B. weihenstephanensis fueron correctamente identificados. Solo una cepa emética (IH
41385, Cuadro 4 ) reaccionó con un falso negativo en la EM MALDI-TOF. Esta cepa en particular es
conocida por su productividad extremadamente baja ( Carlin y col., 2006; Stark y col., 2013 ).
Teniendo en cuenta la dosis de toxina necesaria para inducir la emesis, es decir, 8 μg de cereulida
por kg de peso corporal ( Isobe y col., 1995 ), es muy poco probable que estas cepas de baja
producción representen un peligro para la salud pública.
En conclusión, el método desarrollado se caracteriza por una alta inclusividad de> 99% y una
sorprendente simplicidad. En teoría, una cepa puede producir cereulida en una matriz alimentaria
pero no en un agar sangre ( Rajkovic y col., 2006 ). Sin embargo, en nuestros análisis, incluida una
amplia gama de eméticos B. cereus cepas de diferentes fuentes, no encontramos ninguna indicación
para este escenario. Si una versión modificada del método también es aplicable a la detección de
otras enterotoxinas, es decir, hemolisina BL, enterotoxina no hemolítica y citotoxina K, producida por
diarrea enterotoxigénica B. cereus, será objeto de estudios futuros.
Agradecimientos
Patrocinado por la fundación Adalbert-Raps, Kulmbach, Alemania. Todas las opiniones
expresadas aquí pertenecen a los autores.
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