Fitopatología General 12/08/2020

UNIDAD I

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

PLAQUEO DE MEDIOS DE CULTIVOS, TIPOS Y PREPARACIÓN DE MEDIOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO, SIEMBRA Y DE CULTIVO
MEDICIÓN LINEAL DE HONGOS.
FITOPATOLOGÍA GENERAL

Ing. M.Sc. Giannfanco Egoávil Jump

Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump Docente del ASV – Facultad de Agronomía Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO • Por sus propiedades nutritivas

 Consistencia
 Natural
• Líquido

• Sólido  Semisintetico o complejos

 Propiedades nutritivas
 Sintéticos o definidos
• Carentes de nutrición
 Selectivos o diferenciales
 Agua
Agua

 Agar agua Agar Agua

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• Natural • Semisinteticos o complejos

 Tejido vegetal aséptico  Hojas y petalo de clavel 1. Papa Dextrosa Agar (PDA)
Trozos de papa 250 g
 Tejido vegetal esterilizado  Granos de cereales Dextrosa 15 g
Agar 15 g
 Tejido vegetal macerado  Pastas y jugo de Agua destilada Enrazar a 1000 ml.
papaya
2. Oat Meal Agar (OMA)
Avena cuaker 70 g
Agar 15 g
Agua destilada Enrazar a 1000 ml. OMA

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Preparación del Medio PDA Preparación del Medio PDA

250.0 g

15.0 g

15.0 g
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Preparación del Medio Jugo – V8

3. Corn Meal Agar (CMA)
(Agar Harina de Maiz)
Harina de maiz 20 g
Dextrosa 15 g
Peptona (opcional) 15 g
Agar 15 g
Agua destilada Enrazar a 1000 ml.
CMA
2. V-8 (Jugo V-8)
Jugo V-8 200 ml
Carbonato de Calcio 3 g
Agar 15 g
Agua destilada Enrazar a 1000 ml.
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ESTERELIZADO CONSERVACIÓN
 Equipo: Autoclave
 Refrigeradora, a una temperatura
 Tiempo de esterilizado de XX ºC.

• 15 minutos < 0 = 1 L. de medio  Medio ambiente, dentro de bolsas

de polipropileno.
• 30 minutos + de 1 L. - de 3 L.
• 60 minutos 5 L.
 Temperatura : 121.5 ºC

 Presión : 15 Lb de presión
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PLAQUEO • Sintéticos o definidos

 Czapecks  Phytophthora, Pythium

 Ko & Hora  Rhizoctonia solani

 Nash-Snyder  Fusarium

• Selectivos o diferenciales
 Medio Tetrazolio  Ralstonia solanacearum

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ASEPSIA
 Serie de procedimientos que nos permite eliminar residuos,
microorganismos, etc. sin hacer uso de compuestos antisépticos

 La asepsia nos permite mantener libre de contaminante cuando se

ASEPSIA, AISLAMIENTO, ESTUDIO realiza:
Y MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO  Aislamiento
 Transferencia
 Multiplicación
 Mantenimiento
 Inoculación

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 Para mantener cultivos puros se usan conjuntamente con los  COMO EVITAR LA CONTAMINACIÓN POR AIRE:
procedimientos de asepsia:  Mesa de laboratorio de piedra pulida o sintética
 Esterilización dura o recubierta de vidrio
 Desinfectantes
 Medios selectivos  Ubicar la mesa donde no hay corriente de aire
 Técnicas especiales
 Etc.  Limpiar la mesa con alcohol al 70 % o
Hipoclorito de sodio al 1%
 Donde encontramos contaminantes:
 Aire
 Cámara contra corriente de aire
 Material vegetal
 Utensilios e instrumentos
 Cámara aséptica o microvoid
 Manos y ropa del operador
 Aves, insectos y acaros
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 Habitación aséptica o cuarto de inoculación
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 CONTAMINACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL:
 Seleccionar adecuadamente el material vegetal
 El material debe ser lavado con bastante agua potable. Si se
trata de material que contiene cera se lava con agua y
detergente
 Si se trata de raíces remojar primeramente y luego se lava con
cepillo y abundante agua de caño
 Las muestras lavadas se trata con Hipoclorito de sodio de 0.5-
5%/ 5 minutos (hojas, tallos, flores, frutos, raíces).
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 CONTAMINACIÓN DEL OPERADOR
 La piel, la ropa y la respiración del operador
tiene contaminantes
 El operador debe usar guardapolvo
 Lavarse las manos con jabón carbólico
 Lavarse las manos con alcohol
 Usar guantes y mascarilla aséptica
 No debe hablar mientras trabaja en la cámara aséptica
 Jamás debe trabajar en la cámara aséptica con la ropa
de campo
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 Las paredes del laboratorio deben ser lavadas y fumigadas
periódicamente
 En los espacios de difícil acceso debe aplicarse “Silica o gel”
 En el interior de la incubadora o ambientes cerrados aplicar
acaricida en forma periódica o elevar la temperatura a 60º C
 Las placas que contienen cultivo viejo deben ser hervidos de
inmediato dentro de un recipiente cerrado debe aplicarse
Paradiclorobenceno a fin de matar ácaros
 A temperaturas bajas pueden inhibir a los ácaros
 El piso debe ser limpiada con petróleo
 Los tubos que contienen aislamiento deben ser sellados con papel
cigarro
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 CONTAMINACIÓN EN UTENSILIOS O INSTRUMENTOS
DE LABORATORIO
 Pinza, bisturí, aguja de disección, asa y aguja de kolle,
espátula de Drigalsky.
 Estos instrumentos deben colocarse en remojo (1/3 del
material) en un vaso precipitado con alcohol al 70% y
luego se flamea, enfría y se usa
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 CONTAMINACIÓN AVES, INSECTOS Y ACAROS
 Los olores que despiden los medios de cultivos
o los cultivos o ciertas condiciones de trabajo
atraen a los insectos.
 Si ingresa suelo al laboratorio debe ser estéril
 El material recién traído del campo debe ser colocado en
la sala de preparación, nunca debe ingresar a la sala de
siembra o transferencia
 El material una vez seleccionado debe ser desinfectado
con Hipoclorito de sodio si es madera debe ser flameado
 La superficie de la mesa siempre deben ser limpiadas
antes y después de usarlas
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AISLAMIENTO
 Factores relacionados con el Aislamiento
• Condiciones del material enfermo
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• Tipo de desinfectante • Temperatura de incubación

• Medio de cultivo

Agua
PDA J-V8 CMA OMA Agar Agua

• Técnicas de aislamiento
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 Técnicas de Aislamiento • Aislamiento por

• Inducir a la esporulación inoculación al hospedante

• Inducir al crecimiento micelial

• Aislamiento por trampeo

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• Aislamiento directo  Preparativos para el aislamiento

• Esterilización del material de cristalería

• Preparación de soluciones desinfestantes

• Preparación de medios de cultivo

• Aislamiento por dilución

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 Técnicas de Limpieza SIEMBRA DE TEJIDO Y PROPAGULOS

• Lavado del tejido afectado

 Parte aérea
 Parte subterránea
• Desinfección

 Alcohol etílico al 70%

 Bicloruro de mercurio
 Hipoclorito de Sodio

• Productos antagónicos
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SIEMBRA Y/O REPIQUE ESTUDIO Y MEDICION DEL CRECIMIENTO DE HONGOS

 Métodos universales de medición

• Estimación visual

• Peso seco

• Nitrógeno celular  Método Micro-Kjedahl

• Medición lineal

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Medición lineal
Y

1 día 2 día 3 día

d b
X

c
Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump 4 día 5 día
Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump 6 día
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Ritmo promedio de crecimiento = Incremento total (cm)

Y Y Tiempo total (días)

Radio (r) = ry1 + ry2 + rx1 + rx2

4
X X
RPC = r
t

Ejemplo:
RPC = 5 cm = 0.71 cm/día
7 días
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Radio (r) = ry1 + ry2 + rx1 + rx2 Y

Radio (r) = (ry1 + ry2)+ (rx1 + rx2)

4
X
Radio (r) = (Dy) + (Dx)
4

Radio (r) = Di

4
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 Ejemplo:
 COMPARACIÓN EN MEDIOS DE CULTIVO
Fusarium
Días Datos
• Se probo el crecimiento de cuatro hongos en dos
Placas
1 2 3 4 Radio Total medios de cultivo PDA y OMA
RPC
Repeticion X Y X Y X Y X Y X Y Prom.
I 1.00 0.90 1.60 1.60 2.50 2.60 3.00 3.20 1.50 1.60 1.55 0.39
Media PDA OMA
II 0.80 0.80 1.70 1.70 2.40 2.50 3.50 3.30 1.75 1.65 1.70 0.43 Dias T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4
III 0.90 0.90 1.90 1.90 2.20 2.40 2.50 3.00 1.25 1.50 1.38 0.34
IV 0.80 0.80 1.90 1.90 2.80 2.70 4.00 3.50 2.00 1.75 1.88 0.47 1 0.4 0.43 0.43 0.94 0.47 0.52 0.52 0.9
Promedio 0.88 0.85 1.78 1.78 2.48 2.55 3.25 3.25
2 0.46 1.56 0.85 3.01 1.78 1.46 1.33 2.53
Radio 0.44 0.43 0.89 0.89 1.24 1.28 1.63 1.63
Promedio 0.43 0.89 1.26 1.63 0.41 3 0.69 3.48 1.26 4.24 3.03 3.51 1.73 4.3

Ritmo promedio de crecimiento = Incremento total (cm) 4 0.76 4.3 1.63 4.3 3.77 4.3 2.3 4.3
Tiempo total (días)
RPC 0.19 1.08 0.41 1.08 0.94 1.08 0.58 1.08
RPC = 1.55 cm = 0.39 cm/día
4 días T1  Phytophthora capccice T2  Rhyzoctonia
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T3  Fusarium T4  Lasiodiplodia
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5
Phytophthora (PDA)
 COMPARACIÓN DE FUNGICIDAS (PRUEBA DEL ALIMENTO
4
ENVENENADO)
Rhizoctonia (PDA)
• Se probo el cinco fungicidas para el control de Pythium deliense en medio
Fusarium (PDA)
Radio (cm)

3 de cultivo PDA
Lasiodiplodia (PDA) T1 T2 T3 T4 T5 T6
Días
Phytophthora (OMA) Test. Antr. Cerc. Capt. Prot. Fitop
2
0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Rhizoctonia (OMA)
1 0.14 0.00 0.26 0.11 0.02 0.06
1 Fusarium (OMA) 2 0.44 0.00 0.79 0.47 0.24 0.16

Lasiodiplodia (OMA) 3 0.74 0.00 1.33 0.58 0.58 0.31

0 4 1.06 0.19 1.77 0.81 0.69 0.31
1 2 3 4 5
6
Días 7 2.33 0.30 2.84 0.88 1.03 0.58
Línea de crecimiento de Phytophthora capccice (T1), Rhyzoctonia (T2), Fusarium RPC 0.33 0.04 0.41 0.13 0.15 0.08
(T3) y Lasiodiplodia (T4), en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) y Oat T1  Testigo T2  0.2 % de Antracol
T3  0.1 % de Cercobim T4  0.2 % de Captan
Meal Agar (OMA). Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump
T5  0.1 % de Protexin T6  0.5 % de Fitopron

0.45
0.41 Análisis de Variancia del ritmo promedio de crecimiento (cm/día) de
0.40 Pythium deliense en medio de cultivo de PDA envenenado, con F. Tab =
Ritmo Promedio de Crecimiento

0.33
0.35
0.05
0.30
(cm/día)

0.25
0.20
0.20 Pythium. deliense
0.15
Fuente de Variancia G.L. F. Tab
0.09 0.08
C.M. F. Cal
0.10
0.05
0.04
Tratamiento 5 0.084* 18.26 2.81
0.00 Error Experimental 17 0.005
Test. Antr. Cerc. Capt. Prot. Fitop
Fungicida Total 22
C.V. (%) 35.27
Efecto de los fungicidas Antracol, Fitopron, Captan, Cercobim y Protexin en el
desarrollo micelial (RPC cm/día) de P. daliense en medio de cultivo Agar Papa X (cm/día) 0.19
Dextrosa (PDA) Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump

Prueba de significancia de Duncan (α= 0.05) para el ritmo promedio de

crecimiento (cm/día) de Pythium deliense en medio de cultivo PDA
envenenado

Pythium deliense
Tratamiento
X (cm/dÍa) Sing.
T1 0.33 a
T2 0.04 c
T3 0.41 a
T4 0.09 bc
T5 0.20 b
T6 0.08 c

T1  Testigo T2  0.2 % de Antracol

T3  0.1 % de Cercobim T4  0.2 % de Captan
T5  0.1 % de Protexin
Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump T6  0.5 % de Fitopron Ing. M.Sc. Giannfranco Egoávil Jump
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LIMPIEZA DE CRISTALERIA
 El lavado o limpieza de cristalería no debe descuidarse porque puede
ser fuente de problemas.

 Para trabajos precisos es necesario comenzar con utensilios de vidrio

LIMPIEZA DE CRISTALERIA Y bien lavados
ESTERELIZADO  Para trabajos difíciles debe hacerse uno o mas enjuagues con agua
destilada, aun si el agua contiene carbonato

 La función principal de la limpieza de la cristalería es eliminar

contaminantes

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 Solución limpiadora: Mezcla sulfocrómica

 Lavado de placas petri, probeta, matraz, etc.
Soluciones limpiadoras
Labor Sin uso Usado Ingrediente Normal Fuerte
Agua 1000 cm3 300 cm3
Eliminar marcas, Sin medio de Con medio de cultivo
Dicromato de potasio 60 g 60 g
escrituras y cultivo Ácido sulfúrico 60 cm3 460 cm3
contaminantes
Remojo Agua Preparación:
Hervido 15 minutos 20-30 minutos
Lavado con detergente Esponjillas Escobillar y cepillar

Enjuague 1 Agua de caño

Enjuague 2 Agua destilada Enfriar
Secado Medio
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ESTERELIZADO ESTERELIZCION POR CALOR SECO

 Equipo: Estufa o horno eléctrico
 Esterilización por calor seco (estufa)
 Para aquellos materiales estables al calor
 Esterilización por calor húmedo con presión (autoclave)
 Se esteriliza:
 Esterilización por radiación (luz UV)  140º C  3 Horas
 160º C  2 Horas
 180º C  1 Hora

 No se recomienda para material de goma, tejido, papel

 Placa petri, probeta, etc. con papel aluminio

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ESTERELIZCION POR  Para usarlo:

CALOR HUMEDO CON  Revisar el nivel de agua
PRESIÓN  Introducir los materiales (placa petri, medios, etc.)
 Cierre la puerta del autoclave y abra la llave de purgado.
 Equipo: Autoclave  Luego dejar que por el purgado salga el vapor y cuando
se observa cuando sale en chorro continuo de vapor, cierre
 Tiempo de esterilizado la llave del purgado
• 15 minutos < 0 = 1 L. de medio  El autoclave debe llegar a 15 Libras de presión y una
• 30 minutos + de 1 L. - de 3 L. temperatura de 121º C, desde allí se inicia el conteo
• 40 minutos Placas petri, vidrio porcelana, de la esterilización
etc.  Para abrir la puerta del autoclave, el manómetro debe
• 60 minutos 5 L. y suelo estar en cero y la llave del purgado debe estar cerrado.
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ESTERELIZACION POR RADIACIÓN  Sirve para esterilizar ambiente

 Radiación no ionizante y ionizante
 Ionizante: Tiene alta capacidad de penetración
 No ionizante: Radiación ultravioleta (UV) afecta a nivel de los ácidos
 Puede esterilizar pipetas, placas con medio, embolsadas, productos
nucleicos (15 -390 nm)
empacados.
 Eficacia germicida 254-265nm
 Tenemos a los rayos gamma y rayos catódicos
 Laboratorio usar focos de 15-17 wats a una distancia de 1 m.

 Tiene una acción directa en el organismo no tiene acción de

penetración.

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