UNIVERSIDAD NACIONAL

DE MOQUEGUA

Potencial probiótico de bacterias aisladas de

pan de polen para mejorar la producción y
sanidad de Apis mellifera
Autores: María José Cabana, Marcos Raúl Tejerina,
José José, Ricardo Manuel Castro, Marcelo Rafael
Benítez Ahrendts

Curso: Biotecnología
Docente: Dr. Hebert H. Soto Gonzales
Integrantes:
• Ccama Llanque,Henry Gonzalo
• Damián Flores, Héctor Rinaldo
• Maldonado Rondo, Luis Santiago
• Incacutipa Layme, Deysi Magali
• Ampuero Herrera,Valeria Fernanda
1 Obtención y procesamiento de las muestras
Se obtuvieron
Se enriquecieron En caldo Man Rogosa Sharp
Laboratorio
Se incubaron
muestras
Después de 24 horas de
incubación se
seleccionaron, aquellas
placas que presentaban
entre 100 y 150 colonias.
Se eligieron aproximadamente 10
colonias, que correspondieron a la
raíz cuadrada del total de estas
diversos apiarios de la Provincia
de Jujuy.
(MRS)
Por 24 h en microaerofilia,
condición que se logró a partir
del empleo de frascos
herméticos.
Donde se colocaron
las muestras
sembradas y una vela
para disminuir el nivel
de oxígeno
Transcurrido este
tiempo se sembraron
en agar MRS
2 Selección e identificación de cepas lácticas
se eligieron por las características fenotípicas
Las cepas que definen al género
Lactobacillus spp.
características La morfología de su colonia
Incluyen macroscópicas y características
microscópicas: bacterias
Composicion: Gram positivas y
 proteasa peptona endosporado negativo.
 extracto de carne
 extracto de levadura Se llevaron a una turbidez del 0,5 de la escala de
 Glucosa
 Monoleata de sorbitán McFarland (1-2x108 UFC/ml).
 fosfato dipotásico
 acetato de sodio Se realizaron las pruebas
 citrato de amonio para determinar la
 citrato de amonio capacidad de potencial
 sulfato de manganeso probiótico.
 Prueba de potenciales
probióticos

• Prueba de crecimiento a Las cepas seleccionadas se incubaron a 30, 37 y 40 ºC

observó la turbidez al 0,5 de la escala de McFarland
en caldo MRS durante 48 horas
diferentes temperaturas

Transcurrido este período se sembraron en

• Tolerancia de crecimiento en
diferentes pH
placas de agar MRS por 24 horas
Se evaluó el crecimiento de las colonias bacterianas a
pH (7,5 y 3), donde se ajustó el caldo MRS con HCL 1N
con el potenciómetro para medios ácidos y con Na (OH)
para el medio con pH 7 Se realizó la lectura de las
UFC/ml de las colonias
bacterianas que crecieron a pH 3
(Moreno Galarza, 2012)

• Tolerancia a diferentes
concentraciones de bilis de buey
Para esta prueba se utilizaron concentraciones de 0,3 y
1% de bilis de buey. Las cepas se sembraron en caldo
MRS, ajustadas previamente con las diferentes
concentraciones de bilis. Se incubaron a 37 ºC en
microaerofilia por 4 horas.
se contabilizaron solamente las colonias de bacterias
que crecieron a una concentración de bilis del 1%
(Moreno Galarza, 2012).
 ACTIVIDAD HEMOLÍTICA

Se preparó agar Prueba de sensibilidad de antibióticos

Columbia con 5% de
sangre cordero, donde
Para la prueba de sensibilidad a
se sembraron las cepas
antibióticos, se procedió a
lácticas a 37 ºC
sembrar las cepas en medio
agar MRS

condiciones de
Posteriormente se colocaron
microaerofilia por 24,
discos de antibióticos de
48 y 72 h. Se realizó la
penicilina (10 µg), gentamicina
lectura de hemólisis en
(10 µg) y eritromicina (15 µg).
cada uno de los días
Transcurridas 24 h, se observó si
mencionados
las cepas eran resistentes,
moderadamente sensibles o
sensibles a los antibióticos
DENTIFICACIÓN
NOTÍPICA DE LAS
Protocolo descrito por
1 Cariaga- Martínez y
Zapata
BACTERIAS EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
LÁCTICAS Bacterias crecidas en medio liquido

2
utilizando realizado
AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN GÉNICA por PCR
3 Cebadores 124Eub_1542reverse

mezclo

1X de tampón 2,5 mM de cloruro de magnesio 200MM dNTPs 10 µM de cada cebador 0,5 U Taq polimerasa 0,5 U Taq polimerasa
SOFTWARES

en 20 ul de volumen final de reacción

Macrogen Services Los fragmentos fueron purificados y secuenciados por
Desnaturalización 94°C 4 min
BioEdit Análisis de los cromatógrafos
Amplificación de la secuencia
Compararon y alinearon con las
BLAST (NCBI)
bases de datos GenBank.
35 ciclos

GenBank Las secuenciaciones se depositaron en la base de por

datos 94 40
ºC segundos
por
53 40
ºC segundos
por
72 40
ºC segundos
 d) Se realizaron 5 repeticiones a) La cepa fúngica fue obtenida
de cada muestra, con sus de polen comercial de la
respectivos controles provincia de Jujuy.

e) Se incubaron en condiciones b) Se cultivaron los Lactobacillus

de crecimiento del hongo. PRUEBA DE en medio líquido a 37 º C.

INHIBICION CONTRA
f) Después de 14 días, se midió el ASCOPHAERA APIS c) Se sembró un explante del
diámetro y se observó el aspecto hongo en el centro de la placa
de las colonias fúngicas. de 7 mm de diámetro .