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Composición de antocianinas en variedades de frijol negro (Phaseolus vulgaris

L.) cultivadas en México

Article  in  Agrociencia · January 2005

Source: OAI

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4 authors, including:

Yolanda Salinas-Moreno Patricia Pérez Herrera

INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias
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 COMPOSICIÓN DE ANTOCIANINAS EN VARIEDADES
DE FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris L.) CULTIVADAS EN MÉXICO

ANTHOCYANIN COMPOSITION IN BLACK BEAN (Phaseolus vulgaris L.)

VARIETIES GROWN IN MÉXICO

Yolanda Salinas-Moreno1, Luciano Rojas-Herrera2, Eliseo Sosa-Montes3 y Patricia Pérez-Herrera1

1
Laboratorios de Calidad. Campo Experimental Valle de México. INIFAP. 56230. km 38.5. Chapingo,
Estado de México. (yolysamx@yahoo.com). 2Departamento de Ingeniería Agroindustrial y 3Departa-
mento de Zootecnia. Universidad Autónoma Chapingo. 56230. Chapingo, Estado de México.

RESUMEN ABSTRACT

Se determinó la composición de antocianinas en 15 variedades de
frijol negro (Phaseolus vulgaris L.) cultivadas en México: cinco
de la raza Jalisco, cinco de la Mesoamérica y cinco variedades
recombinantes. El contenido total de antocianinas (ACNT) en gra-
no y testa se realizó mediante un método espectrofotométrico; los
perfiles de antocianinas se determinaron por cromatografía de
líquidos de alta resolución (HPLC). ACNT en grano entero y testa
fue estadísticamente diferente entre razas y variedades dentro de
cada raza (p≤0.01). El contenido de esta variable en la testa de
las variedades de frijol negro osciló entre 10.1 y 18.1 mg g−1 de
testa; este valor fue alto en la variedad Negro Jamapa de la raza
Mesoamérica y en la variedad recombinante Negro Altiplano (18.1
y 17.3 mg g−1 de testa). En grano entero, el contenido de
antocianinas varió de 37.7 a 71.6 mg 100 g−1 de grano. Las varie-
dades de la raza Mesoamérica (testa negra opaca) presentaron el
mayor ACNT en grano y testa. Independientemente de su origen
racial, se identificaron como antocianinas en la testa de frijol:
delfinidina 3-glucósido 65.7%, petunidina 3-glucósido 24.3% y
malvidina 3-glucósido 8.7%. Las variedades Veracruz y Jamapa,
de la raza Mesoamérica, presentaron una antocianina adicional
no identificada. Los resultados muestran que las variedades de
frijol negro son una fuente importante de antocianinas que pue-
den usarse como antioxidantes naturales, porque son principal-
mente del tipo no acilado.
Anthocyanin composition was determined in 15 cultivars of black
bean (Phaseolus vulgaris L.) grown in México. The studied
genotypes included: five cultivars of the Jalisco race, five cultivars
of the Mesoamérica race and five recombinant cultivars. Total
content of anthocyanins (TCAN) in whole seed and seed coat was
performed by a spectrophotometric method; anthocyanin
composition by profiles were determined by high performance
liquid cromatography (HPLC). TCAN in whole seed and seed coat
were different among races and cultivars (p≤0.01). The content of
this variable in the seed coat of black beans varieties ranged
between 10.1 an 18.1 mg g−1 seed coat; this value was high in the
Negro Jamapa variety (Mesoamérica race) and Negro Altiplano
recombinant variety (18.1 an 17.3 mg g−1 seed coat). In whole grain,
the content of anthocyanin ranged between 37.7 and 71.6 mg g−1
grain. The cultivars from the Mesoamérica race (opaque black
seed coat) showed the highest TCAN in whole seed and seed coat.
Independently of racial origen, the following were identified as
anthocyanins in seed coats of beans: delphinidin 3-glucoside 65.7%,
petunidin 3-glucoside 24.3% and maldivin 3 glucoside 8.7%. The
varieties Veracruz and Jamapa (mesoamérica race) showed an
additional unidentified anthocyanin. The obtained results indicate
that black bean cultivars are an important source of anthocyanins
and could be used as natural antioxidants, because they are mainly
non-acylated anthocyanins.

Palabras clave: Flavonoides, frijol negro, color, pigmentos. Key words: Flavonoids, black beans, color, pigments.

INTRODUCCIÓN INTRODUCTION

L T
as antocianinas pertenecen al grupo de los com-
puestos fenólicos, particularmente de los
flavonoides, que se caracterizan por su solubilidad
en agua y por sus colores brillantes. Se encuentran en los
frijoles con testa de color rojo, rosa y negro, y contribu-
yen a determinar sus diferentes coloraciones. Las
antocianinas tienen una gran actividad antioxidante que
inhibe los radicales libres, previniendo enfermedades
Recibido: Mayo, 2004. Aprobado: Abril, 2005.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 39: 385-394. 2005.
he anthocyanins belong to the group of the
phenolic compounds, particularly of the
flavonoids, which are characterized by their
solubility in water and by their brilliant colors. They are
found in beans with red, pink and black colored seed coat,
and contribute to determining their different colorations.
The anthocyanins have a great antioxidant activity which
inhibits the free radicals, preventing diseases such as
cancer, arteriosclerosis and inflammations, and they are
also valued for their coloring capacity (Tsuda et al., 1994;
Takeoka et al., 1997).

385
AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2005
como el cáncer, arterosclerosis e inflamaciones, y se les
valora también por su poder colorante (Tsuda et al., 1994;
Takeoka et al., 1997).
La presencia de antocianinas en el grano de frijol ne-
gro, lo hace un producto potencial para el suministro de
colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el estudio
de los pigmentos del frijol negro (Phaseolus vulgaris L.)
ha despertado gran interés.
En el grano entero de frijol negro se han encontra-
do 213 mg 100 g−1 de antocianinas, y en la testa 2.37 g
100 g−1 (Takeoka et al., 1997). El contenido de
antocianinas varía de acuerdo con las condiciones de
cultivo y la localidad de siembra, pero el perfil de
antocianinas se conserva. En el frijol negro se han iden-
tificado las antocianinas: delfinidina 3-glucósido,
petunidina 3-glucósido y malvidina 3-glucósido, y aun-
que su porcentaje relativo puede diferir entre las varie-
dades, la delfinidina 3-glucósido se encuentra en mayor
proporción (Yoshida et al. 1996; Gantet et al., 1993;
Takeoka et al., 1997).
Las antocianinas del grano de frijol se localizan ge-
neralmente en la testa (Yoshida et al., 1996; Tsuda et al.,
1994); sin embargo, se han encontrado también en el
hipocotilo y el cotiledón (Gantet et al., 1993). La sínte-
sis de antocianinas en todas las especies de Phaseolus se
realiza en la capa subepidérmica, a excepción de P.
coccineus, donde la pigmentación aparece en la epider-
mis, dentro del cuerpo celular llamado antocianoplasto
(Nozzolillo y McNeill, 1985).
El contenido de antocianina total (ACNT) en la testa
de los géneros Glycine, Phaseolus y Vignia es diferente,
pero el perfil de antocianinas es el mismo. Glycine pre-
senta 1.3 a 20.4 mg g−1; Phaseolus, 0.1 a 3.6 mg g−1; y
Vignia, 0.0003 a 20.8 mg g−1 (Yoshida et al., 1996).
México, como parte de Mesoamérica, es considerado
uno de los centros de origen más importantes de varios
tipos de frijol, entre los que destaca por su valor comer-
cial Phaseolus vulgaris L., especie donde se encuentra el
frijol negro (Acosta et al., 1996; Sánchez et al., 2001).
Las variedades de frijol negro cultivadas en México
pertenecen mayormente a dos de las razas genéticas des-
critas por Singh et al. (1991). Esta descripción se ha
complementado con el trabajo de Rosales et al. (2003),
realizado con base en características morfoagronómicas
y con intersecuencias simples repetidas (ISSR). Estas
razas genéticas son: la raza Mesoamérica, que incluye
las variedades de grano negro opaco pequeño y de hábi-
to de crecimiento indeterminado Tipo II ó III, de regio-
nes del trópico húmedo y de baja altitud; y la raza Jalis-
co, de grano negro brillante mediano y de hábito de cre-
cimiento indeterminado postrado Tipo III, sembradas
principalmente en el Altiplano de México. Además hay
un grupo de variedades recombinantes que presentan
características relacionadas con ambas razas genéticas.
386 VOLUMEN 39, NÚMERO 4
The presence of anthocyanins in black bean grain,
makes it a potential product for providing natural
colorants and antioxidants. For this reason, the study of
the pigments of the black bean (Phaseolus vulgaris L.)
has stirred great interest.
In the whole grain of black bean, 213 mg 100 g−1
of anthocyanins have been found, and in the seed coat,
2.37 g 100 g−1 (Takeoka et al., 1997). The content of
anthocyanins varies according to the growing conditions
and the location of the crop, but the profile of anthocyanins
is conserved. In black bean, the following anthocyanins
have been identified: delphinidin 3-glucoside, petunidin
3-glucoside and malvidin 3-glucoside, and although its
relative percentage may differ among the varieties,
delphinidin 3-glucoside is found in greater proportion
(Yoshida et al., 1996; Gantet et al., 1993; Takeoka et al.,
1997).
The anthocyanins of the bean grain are generally
located in the seed coat (Yoshida et al., 1996; Tsuda et
al., 1994); however, they have also been found in the
hypocotyls and the cotyledon (Gantet et al., 1993). The
synthesis of anthocyanins in all of the species of
Phaseolus is carried out in the sub-epidermic layer,
with the exception of P. coccineus, where the
pigmentation appears in the epidermis, within the
cellular body called anthocyanoplast (Nozzolillo and
McNeill, 1985).
The content of total anthocyanin (TCAN) in the seed
coat of the genuses Glycine, Phaseolus and Vignia is
different, but the anthocyanin profile is the same. Glycine
presents 1.3 to 20.4 mg g−1; Phaseolus, 0.1 to 3.6 mg
g−1; and Vignia, 0.0003 to 20.8 mg g−1 (Yoshida et al.,
1996).
México, as part of Mesoamérica, is considered one
of the most important centers of origin of various types
of bean, among which is outstanding for its commercial
value, Phaseolus vulgaris L., species in which the black
bean is found, (Acosta et al., 1996; Sánchez et al.,
2001).
The varieties of black bean grown in México belong
mainly to two of the genetic races described by Singh
et al. (1991). This description has been complemented
with the work of Rosales et al. (2003), carried out based
on morphoagronomical characteristics and with
repeated simple intersequences (RSIS). These genetic
races are: the Mesoamérica race, which includes the
varieties of small opaque black grain and Type II or III
indeterminate growth habit, from regions of the humid
tropic and low altitude; and the Jalisco race, of brilliant
black medium sized grain and Type III or prostrated
indeterminate growth habit, grown principally in the
high plateau of México. There is also a group of
recombinant varieties that present characteristics related
to both genetic races.
 COMPOSICIÓN DE ANTOCIANINAS EN VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO CULTIVADAS EN MÉXICO
En México, el frijol negro representa cerca de 22%
de todo el frijol producido y se siembra en casi todas las
regiones productoras, aunque se consume principalmen-
te en el Altiplano del centro y sureste de México (Caste-
llanos et al., 1997; Rosales et al., 2003). En la región sur,
90% de las amas de casa prefieren este tipo de frijol (Cas-
tellanos et al., 1997).
México es uno de los centros de diversificación del
género Phaseolus y la producción y consumo del frijol
negro es importante, pero se ha estudiado poco las
antocianinas en variedades mexicanas. Por tanto, el obje-
tivo de este trabajo fue determinar la composición de
antocianinas en variedades de frijol negro cultivadas en
México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material genético
Se utilizó como germoplasma 15 variedades de frijol negro: cinco
de la raza Mesoamérica (Jamapa, Veracruz, Medellín, Sinaloa y Nayarit
80), cinco de la raza Jalisco (San Luis, Querétaro, 151, 152 y Puebla)
y cinco variedades recombinantes (Otomí, Puebla 152, Perla, Altipla-
no y Mecentral). Estas se sembraron durante el ciclo Primavera-Vera-
no 2002 en temporal más riego suplementario, en el Campo Experi-
mental Valle de México del INIFAP, municipio de Texcoco, México,
ubicado a 19° 29’ N, 98° 53’ O y 2240 m, y con una precipitación
anual de 635 mm.
El suelo se fertilizó al momento de la siembra con 40 kg de urea y
superfosfato triple. El diseño experimental fue bloques completos al
azar con dos repeticiones, y la parcela experimental consistió de dos
surcos de 6 m de longitud, separados 0.6 m.
Color de grano
Se determinó con un equipo Hunter Lab MiniScan XE Plus Mo-
delo 45/O (Hunter Associates Laboratory, Reston, VA) y se obtuvie-
ron los valores de L*, a* y b*: L* mide la luminosidad del color, con
un rango desde 0 = negro hasta 100 = blanco; a* puede tener valores
positivos (rojo) o negativos (verde); b* puede tener valores positivos
(amarillo) o negativos (azul). El color se puede expresar en términos
de estas tres variables, pero no se proporciona información sobre el
tono y croma, aspectos mejor entendidos en la cadena productor-con-
sumidor (McGuire, 1992). En el presente trabajo el color de los gra-
nos de frijol se expresa en función de L*, tono y croma, calculando
estas dos últimas variables: a: tono = tan−1 (b * / a *) , y
1 1
(
croma = a *2 +b *2 ) 2
. (
Preparación de las muestras para la extracción de antocianinas
Para cada variedad, la testa se separó del resto del grano manual-
mente, con un bisturí. La testa y el grano entero se molieron en un
molino UDY (Tecator AB, Suecia) con malla 0.4 mm, para obtener las
harinas de testa y grano entero.
In México, black bean represents nearly 22% of all
the bean produced, and is grown in almost all of the bean
producing regions, although it is consumed mainly in the
central high plateau and southeast of México (Castellanos
et al., 1997; Rosales et al., 2003). In the southern region,
90% of the housewives prefer this type of bean
(Castellanos et al., 1997).
México is one of the centers of diversification of the
genus Phaseolus, and the production and consumption
of black bean is important. However, little has been studied
of the anthocyanins in Mexican varieties. Therefore, the
objective of this study was to determine the composition
of anthocyanins in varieties of black bean grown in
México.
MATERIALS AND METHODS
Genetic material
Fifteen varieties of black bean were used as germ plasm: five of
the Mesoamerica race (Jamapa, Veracruz, Medellín, Sinaloa, and
Nayarit 80), five of the Jalisco race (San Luis, Querétaro, 151, 152,
and Puebla) and five recombinant varieties (Otomí, Puebla 152, Perla,
Altiplano and Mecentral). These were sown during the 2002 Spring-
Summer cycle in rainfall plus supplementary irrigation, in the Campo
Experimental Valle de México of the INIFAP, municipality of Texcoco,
México, located at 19° 29’ N, 98° 53’ W and 2240 m, and with an
annual precipitation of 635 mm.
The soil was fertilized at the moment of planting with 40 kg of
urea and triple superphosphate. The experimental design was of
complete random blocks with two repetitions, and the experimental
plot consisted of two rows 6 m in length, separated by 0.6 m.
Color of grain
This was determined with a Hunter Lab MiniScan XE Plus,
Model 45/O (Hunter Associates Laboratory, Reston, VA), obtaining
the values of L*, a* and b*: L* measures the luminosity of the
color, with a range of 0 = black to 100 = white; a* can have positive
(red) or negative (blue) values; b* can have positive (yellow) or
negative (blue) values. The color can be expressed in terms of these
three variables, but information is not provided of the tone and
chroma, aspects which are best understood in the producer-
consumer chain (McGuire, 1992). In the present study the color of
the bean grains is expressed as a function of L*, tone and chroma,
calculating these two latter variables as tone = tan−1 (b * / a *) , and
chroma = a *2 +b *2 ) 2
.
Preparation of the samples for the extraction of anthocyanins
For each variety, the seed coat was separated from the rest of the
grain manually, with a scalpel. The seed coat and the whole grain
were ground in an UDY mill (Tecator AB, Sweden) with 0.4 mm mesh,
to obtain the flours of the seed coat and whole grain.
SALINAS-MORENO et al. 387
AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2005
Extracción y cuantificación de las antocianinas
Se efectuó en testa y grano entero, pesando 5 g de la harina del
grano entero sometida a tres extracciones sucesivas con 40, 25 y
25 mL de una mezcla de metanol:ácido acético:agua (10:1:9 v/v/v), a
temperatura ambiente y con agitación, durante 24 h cada una. Al ini-
cio de cada extracción, el pH se ajustó a 3 mediante la adición de HCl
1N o NaOH 1N, según lo requerido. Después de cada extracción el
sobrenadante se decantó y se midió su volumen. Se tomó una alícuota
de 3 mL, previamente centrifugada a 14 000 rpm por 15 min (centrífu-
ga Z 200M/H, Hermle-Labortechnick, Alemania); en la alícuota se
tomó la absorbancia con un espectrofotómetro Genesys 5 (Milton Roy,
EE. UU.), a 520 nm. Se preparó una curva patrón con pelargonidina
clorada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en concentraciones de 0.0 a
50 ppm. Con los datos del volumen de cada extracto y de absorbancia,
así como el peso de muestra, se calculó la concentración total de
antocianinas, como mg antocianina 100 g−1 grano (Salinas et al., 1999).
Para la testa se pesaron 0.5 g de harina y se realizaron tres extrac-
ciones sucesivas. La primera extracción se efectuó utilizando como
disolvente 25 mL de ácido trifluoracético (TFA) al 1% en metanol y
un tiempo de extracción de 24 h en refrigeración. Para las dos extrac-
ciones restantes se usó como disolvente una mezcla de metanol:ácido
acético:agua (10:1:9 v/v/v), empleando las mismas condiciones como
para grano entero. En la primera extracción se usó TFA como agente
acidificante del metanol, ya que este ácido favorece la estabilidad de
las antocianinas. La medición de ACNT se realizó de modo similar al
de grano entero, y los resultados se expresaron como mg antocianina
100 g−1 testa.
Purificación de las muestras
Una porción del extracto de antocianinas de la testa, obtenido a
partir de la primera extracción con TFA al 1% en metanol, se aplicó a
una columna de Amberlita XAD-7 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO),
utilizando como disolvente de lavado ácido acético al 5% en agua, y
como eluyente ácido acético al 5% en metanol. El extracto obtenido
se sometió a una segunda purificación usando una columna de
Sephadex LH-20 (Fluka, Suiza), y los disolventes: a) metanol:TFA:agua
(19.8:0.2:80 v/v/v); y b) metanol:TFA:agua (59.4:0.6:40 v/v/v); ini-
ciando con 100% de a y decreciendo la proporción de éste 25% cada
vez, hasta llegar a 100% de b (Fossen et al., 2001).
Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
Se realizó en un equipo HP 1100 (Agilent Technologies, Alema-
nia) usando una columna analítica Hypersil ODS (250×46 mm) con
tamaño de partícula 5 µm, mantenida en condiciones isotérmicas a
30 °C. Las muestras antes de inyectarse se filtraron a través de un
acrodisco de 0.45 µm (Millipore, Bedford, MA), inyectando un vo-
lumen de 20 µL. Se usaron como disolventes de elución: a) ácido
fórmico:agua (1:9 v/v); y b) ácido fórmico:agua:metanol (1:4:5 v/v/
v). El protocolo de elusión consistió de un gradiente lineal desde
10% de b hasta 100% de b por 17 min, una elusión isocrática duran-
te los siguientes 4 min, para luego tener un gradiente lineal desde
388 VOLUMEN 39, NÚMERO 4
Extraction and quantification of the anthocyanins
This was carried out in the seed coat and whole grain, weighing
5 g of the whole grain flour subjected to three successive extractions
with 40, 25 and 25 mL of a mixture of methanol:acetic acid:water
(10:1:9 v/v/v), at room temperature and with agitation, during 24 h
each one. At the start of each extraction, the pH was adjusted to 3 by
means of the addition of HCl lN or NaOH lN, as required. After each
extraction, the supernatant was decanted and its volume was measured.
An aliquot of 3 mL was taken, previously centrifuged at 14 000 rpm
for 15 min (centrifuge Z 200 M/H, Hermle-Labortechnick, Germany);
in the aliquot, the absorbance was taken with a Genesys 5
spectrophotometer (Milton Roy, U.S.A.), at 520 nm. A standard curve
was prepared with pelargonidine chlorate (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) in concentrations of 0.0 to 50 ppm. With the data of the volume
of each extract and the absorbance values, along with the sample
weight, the total concentration of anthocyanins was calculated, as mg
anthocyanin 100 g−1 grain (Salinas et al., 1999).
For the seed coat, 0.5 g of flour were weighed and three
successive extractions were carried out. The first extraction was made
using as a dissolvent 25 mL of trifluoracetic acid (TFA) at 1% in
methanol and an extraction time of 24 h in refrigeration. For the two
remaining extractions, a mixture of methanol:acetic acid:water
(10:1:9 v/v/v) was used as a dissolvent, using the same conditions as
for whole grain. In the first extraction, TFA was used as an acidifying
agent of the methanol, given that this acid favors the stability of the
anthocyanins. The measurement of ACNT was carried out the same
way as with the whole grain, and the results were expressed as mg
anthocyanin 100 g−1 seed coat.
Purification of the samples
A portion of the anthocyanin extract of the seed coat, obtained
from the first extraction with 1% TFA in methanol, was applied to a
column of Amberlite XAD-7 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), using
as a washing dissolvent 5% acetic acid in water, and as an elutant,
5% acetic acid in methanol. The extract obtained was subjected to a
second purification using a column of Sephadex LH-20 (Fluka,
Switzerland), and the dissolvents used were: a) methanol:TFA:water
(19.8:0.2:80 v/v/v); and b) methanol:TFA:water (59.4:0.6:40 v/v/v);
starting with 100% of a and decreasing the proportion of it 25%
each time, until reaching 100% of b (Fossen et al., 2001).
High performance liquid chromatography (HPLC)
This procedure was carried out on an HP 1100 (Agilent
Technologies, Germany), using a Hypersil ODS (250×46 mm)
analytical column with a particle size of 5 µm, maintained in isothermic
conditions at 30 °C. Before the samples were injected, they were
filtered through an acrodisc of 0.45 µm (Millipore, Bedford, MA),
injecting a volume of 20 µL. Dissolvents of elution used were: a) formic
acid:water (1:9 v/v); b) formic acid:water:methanol (1:4:5 v/v/v). The
elution protocol consisted of a linear gradient from 10% of b to 100%
of b for 17 min, an isocratic elution during the following 4 min, to
 COMPOSICIÓN DE ANTOCIANINAS EN VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO CULTIVADAS EN MÉXICO
100% de b hasta 10% de b por 1 min (Fossen et al., 2001). La velo-
cidad de flujo fue 1.2 mL min−1. Todos los disolventes fueron grado
HPLC, y antes de usarse se filtraron a través de una membrana de
0.2 µm (Millipore, Bedford, MA). La detección de las antocianinas
se realizó a 525 nm.
Estándares
Se usó un estándar comercial de malvidina 3-glucósido
(Polyphenols, Noruega), mientras que la delfinidina 3-glucósido se
aisló de cáscara de berenjena (Macheix et al., 1990). La identificación
de petunidina 3-glucósido se hizo por comparación de los resultados
del presente trabajo y los obtenidos por Yoshida et al. (1996).
Análisis de aglicones
Parte del extracto filtrado de las antocianinas se hidrolizó con
ácido clorhídrico 6 M y se hirvió por 45 min. El residuo se concentró
a sequedad en vacío y 35 °C en un Rotavapor Laborota 4010-digital
(Heidolph Instruments, Alemania). El concentrado se disolvió en HCl
0.01M, se filtró y analizó por HPLC según lo descrito para antocianinas
(de Pascual-Teresa et al., 2002). La identificación de las antocianidinas
se realizó hidrolizando los monoglucósidos de igual forma que se hizo
con las muestras y efectuando el análisis por HPLC.
Análisis estadístico
Los resultados de contenido de ACNT en grano y testa de frijol
negro se sometieron a un análisis de varianza y comparación de me-
dias (Tukey, p≤0.05), utilizando un arreglo completamente al azar
con efectos anidados, empleando el programa SAS (SAS, 1998).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Color de grano
En las variedades de la raza Jalisco, la luminosidad
del grano medida en términos de L* (Cuadro 1) varió de
16.9 a 20.1; algo similar se observó entre los genotipos
del grupo Recombinante, de 17.2 a 19.7. Sin embargo,
entre las variedades de la raza Mesoamérica la luminosi-
dad del grano fue más uniforme, de 17.1 a 18.1. De acuer-
do con estos resultados, las variedades de testa opaca
(Mesoamérica) presentaron un rango de luminosidad más
estrecho que las variedades de testa brillante (Jalisco y
Recombinantes).
Los valores a* y b* fueron negativos para los tres
grupos de variedades de frijol, y sólo para la variedad
Negro Otomí del grupo Recombinante el valor a* fue
positivo, y el valor b* negativo. Por ello, las tres razas de
frijol se ubicaron en el cuadrante 3 de la escala triestímulo,
donde los valores negativos de a* y b* y los valores de
tono 235.2 a 258.4 en 14 de las 15 variedades, indican
que éstas presentaron testa de color entre verde y azul.
later have a linear gradient from 100% of b to 10% of b for 1 min
(Fossen et al., 2001). The flow velocity was 1.2 mL min−1. All of the
dissolvents were grade HPLC, and before use they were filtered through
a membrane of 0.2 µm (Millipore, Bedford, MA). The detection of the
anthocyanins was carried out at 525 nm.
Standards
A commercial standard of malvadin 3-glucoside (Polyphenols,
Norway) was used, while the delphinidin 3-glucoside was isolated from
eggplant peel (Macheix et al., 1990). The identification of petudinin
3-glucoside was carried out by comparing the results of the present
work and those obtained by Yoshida et al. (1996).
Analysis of aglicones
Part of the extract filtered from the anthocyanins was hydrolyzed
with chlorohydric acid 6 M and was boiled for 45 min. The residual
was concentrated to vacuum dryness and 35 °C in a Rotavapor Laborota
4010-digital (Heidolph Instruments, Germany). The concentrate was
dissolved in HCl 0.01M, filtered and analyzed by HPLC according to
what was described for anthocyanins by Pascual-Teresa et al. (2002).
The identification of the anthocyanins was carried out by hydrolyzing
the monoglucosides, the same way as was done with the samples and
making the analysis by HPLC.
Statistical analysis
The results of the TCAN in grain and seed coat of black bean
were subjected to a variance analysis and means comparison (Tukey,
p≤0.05), using a complete randomized arrangement with nested effects,
using the SAS program (SAS, 1998).
RESULTS AND DISCUSSION
Grain color
In the varieties of the Jalisco race, the grain luminosity
measured in terms of L* (Table 1), varied from 16.9 to
20.1; something similar was observed among the
genotypes of the Recombinant group, from 17.2 to 19.7.
However, among the varieties of the Mesoamérica race,
the grain luminosity was more uniform, from 17.1 to 18.1.
According to these results, the opaque seed coat varieties
(Mesoamérica) presented a narrower range of luminosity
than the brilliant seed coat varieties (Jalisco and
Recombinants).
The values a* and b* were negative for the three
groups of bean varieties, and only for the Negro Otomí
variety of the Recombinant group, the a* value was
positive and the b value negative. Therefore, the three
races of bean were placed in quadrant 3 of the tristimulus
scale, where the negative values of a* and b* and the
tone values, 235.2 to 258.4 in 14 of the 15 varieties,
SALINAS-MORENO et al. 389
AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2005

Excepcionalmente, Negro Otomí presentó un valor de Cuadro 1. Valores de luminosidad, tono y croma de las variedades
tono en el cuadrante cuatro, que corresponde a una colo- de frijol negro analizadas.
Table 1. Values of luminosity, tone and chroma of the varieties of
ración azul rojiza (281.3). black bean analyzed.
Medir color en materiales de color negro no es con-
veniente, ya que no hay propiamente tonalidades, y el Raza Variedad L* Tono Croma
croma presenta valores muy bajos, como en los observa-
Jalisco Negro Puebla 16.9 237.5 0.64
dos en frijoles negros. Sin embargo, se decidió realizar la Negro 151 17.6 239.1 0.74
medición para conocer los valores de tono y croma que Negro152 17.7 258.4 0.78
presentan los frijoles negros. Negro Querétaro 18.2 245.3 0.71
Negro San Luis 20.1 245.3 0.82
Mesoamérica Negro Sinaloa 17.1 253.5 0.79
Contenido de antocianina en el grano Negro Veracruz 17.6 238.7 0.74
y testa de frijol Medellín 17.7 241.6 0.75
Nayarit 80 17.9 235.2 0.78
El contenido de ACNT en grano entero y testa varió Jamapa 18.1 246.7 0.96
Variedades Negro Otomí 17.2 281.3 1.19
entre genotipos: de 37.7 a 71.9 mg 100 g−1 y 10.1 a Recombinantes Negro Perla 17.4 241.7 1.01
18.1 mg g−1 de testa (Cuadro 2). Estos valores de ACNT Mecentral 17.9 237.8 1.13
fueron menores a los reportados por Takeoka et al. Altiplano 18.3 249 1.40
(1997), quienes detectaron ACNT de 213 mg 100 g−1 de Negro Puebla 152 19.7 255 0.63
frijol y 2.37 g 100 g−1 de testa en el frijol negro; sin Los valores son el promedio de tres lecturas.
embargo, fueron superiores a los encontrados por
Yoshida et al. (1996) en muestras de frijol negro (0.1 a
3.6 mg g−1 de testa), y por Choung et al. (2003) de 2.14 y indicate that they present a seed coat color between green
2.78 mg g−1 de testa en cultivares de frijol común negro. and blue. Exceptionally, Negro Otomí presented a tone
Los valores de ACNT en testa estaban dentro de los value in quadrant four, which corresponds to a reddish
intervalos reportados por Yoshida et al. (1996) para le- blue coloration (281.3).
guminosas: Glycine (1.3 a 20.4 mg g−1 de testa); Vignia Measuring color in black colored materials is not
(0.0003 a 20.8 mg g−1 de testa); y Phaseolus (1.3 a 20.4 convenient, given that there are no different black tones,
mg g−1 de testa). Estos autores encontraron que los ma- and the chroma presents very low values as those observed
yores contenidos de ACNT en estas leguminosas se pre- in black beans. However, it was decided to carry out the
sentaron en las variedades con testa de color negro. measurement in order to know the values of tone and
Los valores de ACNT detectados en la testa de las chroma presented by the black beans.
variedades estudiadas, eran superiores a los reportados
para cáscara de uva (8.9 mg g−1) (Muñoz-Espada et al., Anthocyanin content in the grain and seed coat of bean
2004) y cáscara de rábano rojo (0.56 a 1.95 mg g−1)
(Giusti et al., 1998), cultivos reconocidos como una po- The TCAN in whole grain and seed coat varied among
sible fuente de colorantes naturales por su alto contenido the genotypes: between 37.7 to 71.9 mg 100 g−1 and 10.1
de antocianinas. Las variedades de frijol negro analiza- to 18.1 mg g−1 of seed coat (Table 2). These values of
das tuvieron mayor concentración de antocianinas y, por TCAN were lower than those reported by Takeoda et al.
tanto, pueden considerarse como productos con usos y (1997), who detected TCAN from 231 mg 100 g−1 of
beneficios potenciales similares. bean and 2.37 g 100 g−1 of seed coat in black bean;
Las variedades recombinantes mostraron la mayor va- however, they were higher than those found by Yoshida
riabilidad en el contenido de ACNT en grano entero y en et al. (1996) in samples of black bean (0.1 to 3.6 mg g−1
testa (C.V.> 24%), lo cual se puede deber a las diferen- of seed coat), and by Choung et al. (2003) from 2.4 and
cias entre las razas que les dan origen. 2.78 mg g−1 of seed coat in cultivars of common black
El análisis estadístico reveló diferencias significati- bean.
vas en el contenido de ACNT en grano entero y testa en- The values of TCAN in seed coat were within the
tre razas y variedades dentro de cada raza (p≤0.01). La intervals reported by Yoshida et al. (1996) for legumes:
raza Mesoamérica sobresalió por su alto contenido de Glycine (1.3 to 20.4 mg g−1 of seed coat); Vignia (0.0003
ACNT, en grano y en testa (59.2 mg 100 g−1 y 14.3 mg to 20.8 mg g−1 of seed coat); and Phaseolus (1.3 to
g−1), valores superiores en al menos 9.7 mg 100 g−1 de 20.4 mg g−1 of seed coat). These authors found that the
grano y 1.3 mg g−1 testa a los de las medias para la raza greater contents of anthocyanins in these legumes
Jalisco y las variedades recombinantes (Cuadro 3). La appeared in the varieties with black seed coat.
raza Jalisco presentó los niveles menores de ACNT en The TCAN values detected in the seed coat of the
grano entero y en testa, aunque en grano entero el valor varieties studied were higher than those reported for grape

390 VOLUMEN 39, NÚMERO 4

 COMPOSICIÓN DE ANTOCIANINAS EN VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO CULTIVADAS EN MÉXICO

Cuadro 2. Contenido total de antocianinas en grano entero y testa de frijol negro por raza genética.
Table 2. Total content of anthocyanins in whole grain and seed coat of black bean per genetic race.

Grano entero† Testa¶ Grano entero† Testa¶ Grano entero† Testa¶

Estadísticas básicas
Raza Jalisco Raza Mesoamérica Variedades Recombinantes

Valor mínimo 37.66 10.21 50.36 11.56 38.84 10.05

Valor máximo 64.14 13.10 70.59 18.14 71.86 17.28
Media 49.18 11.76 59.26 14.31 49.60 13.04
Desviación estándar 9.86 1.34 7.25 2.46 13.03 3.19
Coeficiente de variación (%) 20.05 11.35 12.24 17.22 26.27 24.44
†
mg ACNT 100 g−1 grano.
¶
mg g−1 testa.

no fue diferente al observado en las variedades
recombinantes.
El análisis del contenido total de antocianinas (Cua-
dro 4) en grano entero y testa indica que las variedades
con los mayores valores en grano dentro de cada raza,
presentaron los valores más altos de ACNT en testa, ex-
cepto la raza Jalisco, donde el mayor contenido de ACNT
en testa ocurrió en la variedad Negro Puebla pero con un
valor relativamente bajo de ACNT en grano. Estos resul-
tados explican la correlación positiva y significativa
(r=0.79; p≤0.01) entre el contenido de ACNT en grano
entero y testa (datos no mostrados).
Independientemente del origen racial, las varieda-
des Negro Altiplano y Negro Jamapa tuvieron los con-
tenidos más altos de ACNT (Cuadro 4) en grano entero
(71.86 y 70.59 mg 100 g−1) y testa (17.28 y 18.14 mg
g−1); mientras que Negro 152 y Negro Mecentral tuvie-
ron los contenidos menores de ACNT en grano entero
(37.66 y 38.84 mg 100 g−1) y testa (10.21 y 10.05 mg
g−1). pero estas diferencias no fueron significativas
(Cuadro 4).
skin (8.9 mg g−1) (Muñoz-Espada et al., 2004) and red
radish skin (0.56 to 1.95 mg g−1) (Giusti et al., 1998),
crops recognized as a possible source for natural colorants
because of their high content of anthocyanins. The black
bean varieties analyzed had a higher concentration of
anthocyanins, and therefore, can be considered as products
with similar potential uses and benefits.
The recombinant varieties showed greater variability
in the TCAN in whole grain and seed coat (C.V.>24%),
which may be due to the differences among the races
from which they originate
The statistical analysis revealed significant
differences in the TCAN in whole grain and seed coat
among races and varieties within each race (p≤0.01).
The Mesoamerica race stood out because of its high
TCAN, in grain and seed coat (59.2 mg 100 g−1 and
14.3 mg g−1), values which are higher in at least 9.7 mg
100 g−1 of grain and 1.3 mg g−1 of seed coat than those
of the means for the Jalisco race and the recombinant
varieties (Table 3). The Jalisco race presented the lowest
values of TCAN in whole grain and seed coat, although

Identificación de las antocianinas Cuadro 4. Contenido de antocianinas en grano entero y testa en

15 variedades de frijol negro.
Se identificaron tres antocianinas en las variedades Table 4. Content of anthocyanins in whole grain and seed coat in
15 varieties of black bean.
de frijol negro estudiadas, independientemente de su ori-
gen genético: delfinidina 3-glucósido (65.7%), Grano entero Testa
Raza Variedades (mg 100 g−1) (mg g−1)
petunidina 3-glucósido (25.9%) y malvidina 3-glucósido
Jalisco Negro Querétaro 64.14 12.58
Cuadro 3. Contenido total de antocianinas en grano y testa de fri- Negro 151 51.72 12.48
jol en los tres grupos de variedades. Negro San Luis 47.99 10.44
Table 3. Total content of anthocyanins in grain and seed coat of Negro Puebla 44.23 13.10
bean in the three groups of varieties. Negro152 37.66 10.21
Mesoamérica Negro Jamapa 70.59 18.14
Grano entero Testa Negro Nayarit 80 59.13 14.30
Raza (mg 100 g−1) (mg g−1) Negro Medellín 58.39 12.92
Negro Veracruz 57.82 14.65
Jalisco 49.2 b 11.80 c Negro Sinaloa 50.36 11.56
Mesoamérica 59.3 a 14.30 a Variedades Negro Altiplano 71.86 17.28
Variedades recombinantes 49.6 b 13.00 b recombinantes Negro Puebla 152 48.35 11.85
DSH† 0.97 0.55 Negro Perla 47.06 15.48
†
Negro Otomí 41.88 10.52
Diferencia significativa honesta. Negro Mecentral 38.84 10.05
Valores con letras distintas en una columna son diferentes (p≤0.05).

SALINAS-MORENO et al. 391

AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2005
(9.1%). Los tiempos de retención de cada antocianina
fueron 7.41, 9.25, y 10.78 min, valores que coinciden
con los estándares utilizados para su identificación (Fi-
gura 1).
Los resultados concuerdan con los reportados por
Takeoka et al. (1997), quienes encontraron las mismas
antocianinas en frijol negro y señalan, al igual que Yoshida
et al. (1996) y Tsuda et al. (1994), a la delfinidina 3-
glucósido como la antocianina mayoritaria en frijol ne-
gro, seguida por la petunidina 3-glucósido y la malvidina
3-glucósido.
Yoshida et al. (1996) indicaron que existen diferen-
cias en el perfil de antocianinas entre especies de frijol;
así, en Phaseolus coccineus y P. vulgaris la delfinidina
3-glucósido es la antocianina presente en mayor propor-
ción, mientras que en P. lunatus son la peonidina 3-
glucósido y peonidina 3- rutinósido. Los mismos autores
señalaron que el perfil de antocianinas varía dependien-
do del color de la testa de la semilla. Los resultados obte-
nidos indican que, independientemente de la raza a la
que pertenece cada variedad, el perfil de antocianinas en
las variedades de frijol negro es el mismo, aunque en las
variedades Negro Veracruz y Negro Jamapa se presentó
un pico adicional no identificado, cuyo tiempo de reten-
ción fue 8.2 min (datos no mostrados).
Las antocianinas en la testa de frijol negro de las va-
riedades estudiadas, son de tipo simple y no aciladas, ya
que su estructura está formada por el grupo cromóforo y
únicamente un azúcar, que es la glucosa (Strack y Wray,
1989). Esta estructura química reduce su uso potencial
como colorantes naturales para alimentos, pues son me-
nos estables a cambios de pH que las aciladas; sin
embargo, poseen una actividad antioxidante sobresalien-
te, por lo que las antocianinas del frijol negro pueden
considerarse valiosas como agentes antioxidantes (Tsuda
et al., 1996).
Identificación de agliconas
La hidrólisis ácida de los extractos de antocianinas de
las variedades de frijol negro, mostró la presencia de tres
antocianidinas: delfinidina, petunidina y malvidina, con
tiempos de retención promedio de 11.9, 14.0 y 14.8 min
(Figura 2). Estas antocianidinas son las precursoras de
las antocianinas en frijol negro (Takeoka et al., 1997;
Hungria et al., 1991; Gantet et al., 1993).
La eliminación del azúcar de la estructura de la
antocianina durante la hidrólisis, reduce la polaridad de
la molécula, volviéndola más compatible con la fase es-
tacionaria (columna), de modo que su elusión con la fase
móvil tarda más tiempo. Por ello, aunque las
antocianidinas y las antocianinas fueron analizadas en
las mismas condiciones, los tiempos de retención de las
primeras fueron mayores (Strack y Wray, 1989).
392 VOLUMEN 39, NÚMERO 4
in whole grain the value did not differ from that observed
in the recombinant varieties.
The analysis of the total content of anthocyanins (Table
4) in whole grain and seed coat indicates that the varieties
with the highest values in grain within each race, presented
the highest values of TCAN in seed coat, except the Jalisco
race, where the higher TCAN in seed coat occurred in
the Negro Puebla variety, but with a relatively low value
of TCAN in grain. These results explain the positive and
significant correlation (r=0.79; p≤0.01) between the
TCAN in whole grain and seed coat (data not shown).
Independently of racial origin, the Negro Altiplano
and Negro Jamapa varieties had the highest contents of
anthocyanins (Table 4) in whole grain (71.86 and 70.59
mg 100 g−1) and seed coat (17.28 and 18.14 mg g−1);
whereas the Negro 152 and the Negro Mecentral had the
lowest contents of anthocyanins in whole grain (37.66
and 38.84 mg 100 g−1), but these differences were not
significant (Table 4).
Identification of the anthocyanins
Three anthocyanins were identified in the varieties of
black bean studied, independently of their genetic origin:
delphinidin 3-glucoside (65.7%), petunidin 3-glucoside
(25.9%) and malvidin 3-glucoside (9.1%). The retention
times of each anthocyanin were 7.41, 9.25, and 10.78
min, values which coincide with the standards used for
their identification (Figure 1).
The results coincide with those reported by Takeoka
et al. (1997), who found the same anthocyanins in black
Figura 1. Cromatograma de HPLC de frijol negro. Las
antocianinas identificadas fueron: 1) delfinidina 3-
glucósido; 2) petunidina 3-glucósido; 3) malvidina 3-
glucósido.
Figure 1. HPLC chromatograms of black bean. The anthocyanins
identified were: 1) delphinidin 3-glucoside; 2)petunidin
3-glucoside; 3)malvidin 3-glucoside.
 COMPOSICIÓN DE ANTOCIANINAS EN VARIEDADES DE FRIJOL NEGRO CULTIVADAS EN MÉXICO
Figura 2. Cromatogramas HPLC de antocianidinas de frijol ne-
gro. Pico 1) delfinidina, 2) petunidina, y 3) malvidina.
Figure 2. HPLC chromatograms of black bean anthocyanidins.
Peak 1) delphinidin, 2) petunidin, and 3) malvidin.
CONCLUSIONES
El contenido de antocianinas en las variedades de fri-
jol negro cultivadas en México varía entre genotipos y
entre razas. Los cultivares de la raza Mesoamérica sobre-
salieron por su mayor contenido de antocianinas, en gra-
no entero y en testa. Las antocianinas identificadas en el
grano de frijol de las variedades estudiadas fueron:
delfinidina 3-glucósido (antocianina mayoritaria),
petunidina 3-glucósido y malvidina 3-glucósido, inde-
pendientemente de su origen racial, las cuales proceden
de los aglicones delfinidina, petunidina y malvidina. Por
la naturaleza química de las antocianinas identificadas
en los genotipos de frijol negro estudiados, su uso poten-
cial sería como fuente de antioxidantes, más que como
colorantes naturales.
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bean and indicate, as did Yoshida et al. (1996) and Tsuda
et al. (1994), delphinidin 3-glucoside as being the major
anthocyanin in black bean, followed by petunidin 3-
glucoside and malvidin 3-glucoside.
Yoshida et al. (1996) indicated that there are
differences in the profile of anthocyanins among the bean
species; thus, in Phaseolus coccineus and P. vulgaris the
delphinidin 3-glucoside is the anthocyanin present in
greatest proportion, whereas in P. lunatus it is peonidin
3-glucoside and peonidin 3-rutinoside. The same authors
point out that the profile of anthocyanins varies depending
on the color of the seed coat. The obtained results indicate
that, independently of the race to which each variety
belongs, the profile of anthocyanins in the bean varieties
is the same, although in the varieties Negro Veracruz and
Negro Jamapa an additional unidentified peak appeared,
whose retention time was 8.2 min (data not shown).
The anthocyanins in the seed coat of black bean of
the varieties studied, are of a simple and non-acylated
type, given that their structure is formed by the
chromoforic group and only one sugar, which is glucose
(Strack and Wray, 1989). This chemical structure reduces
their potential use as natural colorants for foods, as they
are not as stable for changes of pH as the acylated
anthocyanins; however, they possess an outstanding
antioxidant activity, and therefore, the anthocyanins of
black bean can be considered valuable as antioxidixing
agents (Tsuda et al., 1996).
Identification of aglicons
The acid hydrolysis of the extracts of anthocyanins
of the black bean varieties showed the presence of three
anthocyanidins: delphinidin, petunidin and malvidin, with
average retention times of 11.9, 14.0 and 14.8 min (Figure
2). These anthocyanidins are the precursors of the
anthocyanins in black bean (Takeoka et al., 1997; Hungria
et al., 1991; Gantet et al., 1993).
The elimination of the sugar from the structure of the
anthocyanin during hydrolysis reduces the polarity of the
molecule, making it more compatible with the stationary
phase (column), so its elution with the mobile phase takes
longer. For this reason, although the anthocyanidins and
the anthocyanins were analyzed under the same
conditions, the retention times of the former were greater
(Strack and Wray, 1989).
CONCLUSIONS
The content of anthocyanins in the varieties of black
bean grown in México varies among genotypes and races.
The cultivars of the Mesoamérica race stood out due to
their higher content of anthocyanins, in whole grain and
seed coat. The anthocyanins identified in the grain of bean
SALINAS-MORENO et al. 393
 AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2005
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394 VOLUMEN 39, NÚMERO 4
View publication stats
of the varieties studied were: delphinidin 3-glucoside
(predominant anthocyanin), petunidin 3-glucoside and
malvidin 3-glucoside, independently of their racial origin,
which proceed from the aglicons delphinidin, petunidin
and malvadin. Due to the chemical nature of the
anthocyanins identified in the black bean genotypes
studied, their potential use would be as a source of
antioxidants, rather than as natural colorants.
—End of the English version—




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