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Hospital de NUTR 2006;

1:38-46 ISSN 0212-1611 • CODEN
NUHOEQ S.V.R. 318

Texto original en
Características del transporte de glucosa a través de membranas
microvillous de la placenta de término humano
Ravinderjit Kaur Anand **, Usha Kanwar ** y Sankar Nath Sanyal *
* Departamento de Biofísica. ** Departamento de Zoología de la Universidad de Panjab, Chandigarh-160014, India.

Resumen CARACTERÍSTICAS DEL TRANSPORTE DE

GLUCOSA A TRAVÉS DE LAS SOLUCIONES CON
Características de transporte de d-glucosa se MICROVELLOSIDADES DE LA PLACENTA
estudiaron en las vesículas microvillous aisladas de la HUMANA A TÉRMINO
placenta de término humano. Transporte se produjo
por fa-cilitated selectivo y rápido sistema de difusión Resumen
inhibitable phlo 2retin y HgCl. El transporte era dependiente en un
transmembrana. Se estudiaron las características del transporte de la
Na-gradiente indicando un "transporte activo D-glucosa en las vesículas con microvellosidades
secundario - +del sistema de puerto". La afluencia de
funcionamiento aisladas de la placenta humana a término. El transporte
transporte se satura-ble y el análisis cinético basado en ocurría por un sistema de difusión selectiva y facilitada
diagrama de Hanes-Woolf produjeron
valor
máximo de 1,2 mM uny kt
34ynmoles.
J rápida cuentística inhibirse por floretina y por 2 HgCl. El
.min mgprotein, -1respectivamente. La emanación de la trans-
Porte dependía de un gradiente de Na transmembrana, +
D-glucosa-1
de las vesículas de la membrana en un análisis previamente equilibrado
indicativo del del sistema ONU operativo "transporte
condiciones demostraron un bifásico distinto patrón activo secundario". El flujo de entrada del transporte
difieren significativamente en la emanación 1/2 de
delmedio
ayuno era satu-rable y el análisis cinético basado en el gráfico
ytiempo. El t
componentes de lentos fue encontrado para ser 15 de Hanes - Woolf produjo t una máximo
k y deuna1,2J mM y 34 nmo -
segundos y 660 seg, respectivamente. El transporte les•mg de proteína 4•min,-1respectivamente. El flujo de
mostró distinta sensibilidad a la temperatura y la Ea salida de la D-glucosa desde las vesículas de membrana
ambos valores por debajo y por encima de la en condiciones de ensayo de pre-equilibrio mostró un
temperatura de transición de 37 º c, calculado de la pa-trón bifásico distintivo difería significativamente en
Arrhenius-1parcela fueron encontrados para ser la mitad del flujo de salida. Se halló la t 1/2 de los
kCa1.mo1
BER de los7600 y 5472,
azúcares porrespectivamente.
vía de transporteEstudios
de hexosasde componentes rápido y lento 15 seg. y 660 seg.,
inhibición
demostró queconlos
unepímeros
num- de la glucosa, azúcares créditos-vamente. El transporte mostró una sensibilidad
fosforilados e incluso los disacáridos y los azúcares de distinti-va a la temperatura, y se encontró los valores de
pentosa compitieron effec-tivamente con la D-glucosa. Ea, tanto por encima como por debajo de la
La afluencia también fue inhibida por una serie ‘ de temperatura de transición de 37 º C, calculada por el
esteroides como testosterona
progesterona, la progesterona,y 17 - hidroxi-Insulina
estrógeno. gráfico de Arrhe - nius, fueron de 7.600-1 y 5.472
kCa1.mo1,
te. Los estudios respectivamen
de inhibición - con una serie de azúcares
fue encontrada para aumentar el transporte -1
de
glucosa de una manera dependiente de la dosis a una para la ruta del transporte de la hexosa mostraron los
nitrophenoi y la nicotina inhiben fuertemente la epímeros de la glucosa de los azúcares fosforilados, e en
concentración de 0.2-1 unit.ml. Ouabain, di-
absorción de D-glucosa en las vesículas de membrana. almaneces los disacáridos y los azúcares pentosa,
competían de forma eficaz con la D-glucosa. El flujo de
(Hospital de 2006;
NUTR21:38-46) entrada también se inhibió por una serie de esteroides
como la progesterona,
Palabras clave: transporte de glucosa. Membrana de borde de cepillo. ‘ la 17 - hidroxiprogesterona, la
Placenta. testostero-
na y los estrógenos. Se encontró la insulina aumenta-ba
el transporte de glucosa de manera dependiente de la
dosis a una concentración de 0,2-1 unidades•ml. La-1
ouabaína, el dinitrofenol y la nicotina inhibieron fuerte-mente la captación de D-glucosa por las vesículas de m

Correspondencia: Dr. S. N. Sanyal

Departamento de Biofísica de la
Universidad de Panjab, Chandigarh-160 014, INDIA
Tel: + 91-172-2534119
Correo electrónico: sanyalpu@yahoo.co.in; Sanyal@PU.AC.in (Hospital de 2006;
NUTR21:38-46)
Recibido: 28-IV-2005. Palabras clave: Transporte de glucosa. Con membrana
Aceptado: 14-VI-2005. borde en cepillo. Placenta.

38
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Introducción
Placenta de varias especies ha demostrado ser
selectivamente permeable para el D-isómero de la
relacionados
glucosa y con monosacáridos en el perfusión del
tejido y el transporte se caracteriza por competitivo
ción y movimiento ascendente por contracorriente.
inhibi- 1
In vitro
estudios con el tejido entero velloso han
expresado-ted que la absorción de la glucosa en el
2
sincitiotrofoblasto es el paso inicial en la transferencia
curs tanto por difusión
placentaria que oc - como por un proceso mediado
de sodio-de-pendiente conforme al requisito de Mi
chaelis-Menten cinética.3Sin embargo, el uso de todo
tejido velloso en el estudio de características
específicas del transporte placentario está seriamente
limitada por la presencia de varios tipos de células y
membranas subcelulares, whi-le una preparación de
membrana aislado sería claramente fa-facilitar tal
investigación. La absorción epitelial membrana del
plasma, llamada las microvellosidades, desde el
4
sincitio pla-central puede obtenerse en preparación
hemos preparado
homogénea. En máslasde
vesículas cerradas del
la modificación capaz de
método,
transportar activamente aminoácidos e iones,
mientras que la pureza de la membrana fue
establecido por micros-copia electrónica, análisis de
enzima marcador, análisis composicional de lípidos
5-8
y Perfil. En este artículo,de
de SDS-PAGE divulgamos
la membranainvestigaciones
pro-teins sobre D-
absorción de la glucosa que incluye la especificidad de sustrato,
propiedades cinéticas de transporte, temperatura
depen-anza, efectos de inhibidores y de hormonas
reguladoras potenciales y la sensibilidad del sistema
de transporte a un número de compuestos de
perturbar la membrana. El transporte en las vesículas
de membrana aislado que mingly ver minimizada la
9
recaptura de sustrato del medio, también demuestra la
camino
existenciade de
Tedunapara el éxodo del azúcar.
media-
Materiales y métodos
Colección de placenta
La placenta se recogieron dentro de 30 minutos de
parto vaginal de madres con embarazos de término
sin complicaciones a través de la cortesía del
Hospital General de gobierno, Sector 16,
Chandigarh, en petición escrita. Estricta ética médica
fue seguido en conseguir-ning fue revisar las
placentas y la historia clínica del paciente desde la
prenatal clínicas grabación para evitar cualquier
estado patológico como la diabetes, hy-pertension y
preeclampsia.
Placentaria microvillous (borde en cepillo) la membrana el transporte fue detenido por diluir el medio 10
preparación
La placenta fue inmediatamente colocada en
hielo, traída al laboratorio dentro de minutos y
cortar en trozos aproximadamente 10-15 cm de
diámetro. Decidua y las placas coriónicas fueron
quitadas usando una cuchilla de micrótomo sharp.
El tejido velloso resultante se lavó con una solución
salina equilibrada de Earle para eliminar
Características del transporte de glucosa a
Hospital de NUTR
través dePDF
Multilizer membranas microvillousFree
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placenta de término humano
la sangre 10 que incluyó 23 mM CaCl, 1 m2 Mg - tan,
5,4 4mM KCl, 116 mM NaCl, 5,6 mM D-glucosa,
26 mM NaHCO, 1 mM NaH PO 2 y411 mg fenol 3
roja por litro de la solución. Un 15-20 g de muestra de
tejido placentario se extendió de forma manual y
luego lavado suc - cessively en solución 2 isotónica
solución
helada de
CaCl, le y
oído-el tampón de 40 mM Tris-HCl, pH
7,4. Estos lavados habían quitado gran parte de la
sangre de los espacios intervillous. La muestra es
brevemente a tierra con un procesador de alimento
eléctrico en trocitos de 1-5 mm de diámetro y
colocada en una solución de NaCl 0,9% helada. El
pH de las soluciones utilizadas en el pre-paration se
ajustó a 7,4 y excepto donde observado de otra
manera, todos los pasos se realizaron estrictamente a
4° C. Eran entonces suavemente agitado a 4° C por
30 min con un agitador magnético. Durante este
procedimiento las vellosidades coriónicas se
esparcieron a modo que sus superficies se podrían
regar bien. La solución salina se vierte fuera y
centrifugar 10 min a 800g en un refrigerado
centri-fuga (fuerzas g son valor promedio aplicado
en el punto medio del tubo) retirar cualquier
fragmento de los tejidos y se centrifugó a 10.000 g
por 10 min a remo-ve más partículas y desechos
intracelulares. Esto es seguido por un
funcionamiento de alta velocidad de 100.000 g
durante 60 min en una ultracentrífuga Beckman
(modelo L8 80) usando el rotor de ángulo fijo de 60
Ti, rindió un claro ye-llow gelatinosa pellets. La
membrana borde de cepillo (pe-llet) más fue
suspendida en un buf-fer 2 mM Tris-Hepes por
homogeneización en un homogeneizador de mano de
cristal todos y pasando varias veces por la aguja de
23 calibre para dar una concentración final de
proteína de alrededor de 2 mg.ml -1. La membrana
aislada fue utilizada para las caracterizaciones como
la manera-sion
Mediciones microscopía electrónica, análisis de
de transporte
enzima marcador, SDS/PAGE de las proteínas de
Medicióndistribución
membrana, del transporte de glucosade
cuantitativa dellos
medio en
lípidos,
las vesículas fue realizada bajo condi-ciones
así como los estudios sobre transporte de membrana.
isotónicas. Vesículas de membrana suspendieron en 2
mM de tampón Tris - Hepes, pH 7.4 (almacenador
intermediario), en la presencia o ab-sence de 130 mM
de NaCl y se mezclaron con concentración conocida
(1 mM) de 14 C-D-glucosa en el mismo buffer con
un repentino Vortex. Las incubaciones se realizaron a
temperatura ambiente en un baño de agua y a
indi-cated intervalo de tiempo tan corto como 3 seg,
veces con solución de phloretin frío de hielo (0.2 mM
en tampón I más 2% e-nol). Las vesículas se
separaron inmediatamente del medio sustrato por
filtración rápida bajo presión reducida en los filtros
de éster mixto (0,45 μm tamaño de poro, 0,25 mm de
diámetro) (Whatman Limited, Maidstone, Inglaterra).
Las vesículas de membrana se cosecharon en los
filtros previamente mojado con tampón rasgunõs I y
en un soporte del filtro tipo syrin-ge (Whatman
Limited, Maidstone, Inglaterra). El vacío de filtración
rápida2006;
fue géneros-
1:38-46 39
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Ted con la ayuda de un motor de alta capacidad 33

impulsada por bomba de suc-ción. Las vesículas

n moles glucosa uptaken mg de proteína

32
31
cosechadas fueron lavadas exten-modo 3 - 4 veces

-1
30
con helado I. tampón no específica vinculante de 29
28
Na+
Ningún catión
radiactividad para el filtro en la ausencia de la 27
26
proteína se determinó colocando 100 μl de solución 25
de incuba-ción (carece de vesículas) en el filtro y 24
23
lavarlas como se describe. Las cuentas de 22
21
radiactividad tal filtro fueron aceptadas como el 20
"filtro blanco". Cada filtro fue suspendido en 19
18
centelleo cóctel contai-ning
11
0.2% PPO, 0,04% 17
16
POPOP 6% naftaleno, ácido acético al 2%, 2% 15
Ned por espectrometría
etilenglicol, metanol 10% deycentelleo utilizando
el resto 1,4 dioxano.unLa 14
contador de centelleo líquido
radiactividad fue determi- Beckman (LS 7000).
Medición de transporte del mismo sustrato en una 0 - 5 1 2 3 4 5 1 0
Tiempo (min)
dirección exterior o salida fue realizado accor-ding en
el método de Johnson y Smith. Vesículas 12
fue cargado por equilibrar durante 1,5 h a 22° C con Fig.1.-curso del tiempo para la absorción de 14 C-D-glucosa
C-D-glucosa 14
([S] = 1 mM) en presencia en vesículas BBM placen-tal.
Sustrato fue agregado a una suspensión de las vesículas a un
o ausencia de 130 mM de NaCl y se sumergieron en final con-centration de 1 mM D-glucosa en la presencia o
un baño de hielo después de eso. Alícuotas de 100 μl ausencia de 130mM de NaCl. La absorción fue terminada
cada una fueron guerra - med a 22° C y una alícuota indica a veces mediante la adición de 1 ml de solución de
grande (2 ml) de tampón estaba agregado rápidamente phloretin de 0,2 M helada.
para diluir la externa substrato concentración-tration a
un nivel bajo y salida iniciar. Phloretin como agente Emanación del sustrato de las vesículas
de bloqueo (2 ml a 0° C) del transporte se añadió precargados, llamado la 'salida' fue igualmente rápida
ra-pidly después de un intervalo de tiempo deseado con la concentración interna de la etiqueta cae a 75%
para detener la salida y las vesículas se recuperaron en 20 seg y 30 seg en presencia y en ausencia de
rápidamente
Medición queproteínas
de las el anterior.
de membrana NaCl, créditos-vamente (fig. 2). La tasa entonces se
desaceleró abruptamente como salida fue estudiado
La cantidad de proteína en las superficies BBM durante 10 minutos. El curso del tiempo de salida era
era es-timated por el sulfato dodecyl de sodio así bifásica como evidente en el diagrama de registro
modificado (SDS)-procedimiento de Lowry 13de semi (recuadro de la figura 2) que muestra un
borras y Paxman. descanso de 15 segundos y 660 seg para los
Curso del tiempo resultados de D-glucosa afluencia y componentes rápidos y lentos, respectivamente.
salida en las vesículas BBM placentarias Propiedades cinéticas del sistema de transporte fueron
inves-tigated con un rango de concentración de
Figura 1 muestra que en presencia de un sodio sustrato de 1-30 mM y midiendo la tasa inicial de
interiormente dirigido gradiente (inicial de absorción de la etiqueta en las vesículas. La tasa de
condiciones: 130 mM NaCl exterior y cero interior), absorción de la D-glucosa fue encontrada para ser
la afluencia de D-gluco-se en las vesículas BBM concentración dependiente en un rango de 1-10 mM
placentarias parece ex-tremely rápido y sigue un (fig. 3 a y b), que luego se satura en hig - su
patrón de tiempo característicos depen-dent. La concentración del monosacárido asumiendo la
-l 1
cantidad de constantemente
min. que declinó azúcar en las vesículas
después alcanzó
de eso y alcanzó uncerca
un valor valor
del cinética hiperbólica típica de una proteína mediada
de pico(estado
equilibrio de 32.17 nmoles.mg
estacionario) proteína
en alrededor enEn ausencia de Na, la tasa defacilitado
de 5 minutos. absorción
difusión. En experimentos posteriores, una
+ concentración de sustrato de 30 mM fue adoptada
en las vesículas fue mucho más lento, nunca logró ensu-anillo una cinética lineal del proceso de
acumulación pico y procedió a un ritmo constante de absorción
t
con una concentración de sustrato de máximo )
unos 20 nmoles.mg proteína, que es sólo -l satura-ble.
se Los
calcularon a datos
partir de
delabsorción velo-city
x-intercepto (v)
y la pendiente,
60% del valor máximo que logró en presencia de versus la concentración
respectivamente deSigue
(fig. 3c). sustrato ([S]) fueron
la forma usual de la
Na. La acumulación transitoria de la azúcar en la + transformados
ecuación de Miachaelis-Menten
una trama linealdedelaHanesWoolf
cinética de la([S]
las vesículas sugiere que el proceso es en cierta forma /v frente a [S]) y la constante de afinidad aparente de
enzima,
lin-ked al movimiento interno de iones +
de Na hasta ti- absorción (k) y la[S]velocidad k , aparente inicial
[S] máxima
= + t
yo cuando las vesículas también se equilibra con el (J v Max J Max J
ion. En los experimentos posteriores, las vesículas se
incubaron con el sustrato por un período de 30 Trazan de los datos de absorción en esta forma
segundos porque cae en la región lineal de la yJ valor de 1,2 mM y 34.3 nmoleslmg
produce un pro-max
t de k
ve-locity de absorción. Tein/min, respectivamente.

40 Hospital de NUTR 2006; 1:38-46 Ravinderjit Kaur Anand y cols.

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 15 34
0
.1 33
14 .2
n moles glucose uptaken mg protein-1 32
.3
13 .4 31

v (n moles mg prot-1 min-2)

.5 30
.6
Ao
-In ___t
A
12 .7 29
.8 28
11 .9
1,0 27
10 26 15s
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 25 30s
1'
9 Time (min) 24 3'
23
8
22
7 21
20
6
1 5 10 15 20 30
0 1 2 3 4 5 10 [s]
Time (min)
35

Fig. 2.–Time course of egress of C-D-glucose from placental 14 30

BBM vesicles.

v (n moles mg prot-1 min-1)

14
C-D-glucose (1 mM) was preloaded into vesicles for 90 min. 25
at 22 ºC and then 100 µl of these vesicles were diluted in the
medium 20-fold (2 ml) with 2 mM Tris-Hepes buffer, pH 7.4
at 22 ºC to generate a gradient of 1 mM to 0.05 mM. Outward 20
flow of substrate was stopped at various times with ice-cold 1 mM 5
15 mM 10
0.2 mM phloretin solution. mM 20
Inset: Semi-log plot for egress. Ordinate is –natural logarithm (- mM 30
ln) of the ratio of concentration at time t (At) to the initial inter- 10 mM
nal substrate concentration (A0).
5
Inhibition by phloretin and HgC12
Fig. 4 shows that the uptake of D-glucose in BBM 0 1 2 3
Time (min)
vesicles was found to be inhibited by phloretin (60%
inhibition) and H9C12(30%). The time course of inhi-
32
bition was also followed from 15 sec to 3 min, and
30
while the “overshoot” in D-glucose uptake was once 28
again visible, the inhibitory effects of phloretin and 26
HgC12were clearly and uniformly discernible at all ti-
v (n moles mg prot-1 min-1)

24
Control
me points. Phloretin was therefore used as transport 22 HgCl2
Phloretin
terminator in subsequent experiments to counter the 20
18
rapidity with which the influx took place during the 16
ti- me lapse between incubation and filtration of 14
mem- brane vesicles which was although as less as 1-2 sec. 12
10
8
The temperature dependence of uptake 6
4
The effect of temperature, if any, on the D-glucose
2
uptake in the BBM vesicles was studied by following
the uptake process at different temperatures ranging 0 1 2 3
Time (min)
from 4-48 ºC (fig. 5). The results demonstrate that alt-
hough the glucose uptake can be visualized even at lo- Fig. 3.–Rate of C-D-glucose uptake in the placental BBM ve- 14
wer temperatures, the optimum activity takes place at sicles over a range of substrate concentration of 1-30 mM
37 ºC which considerably decreases thereafter at 48 ºC a) v vs. [S], at different time points
(25% inhibition). The uptake velocity at 0 ºC was only b) v vs. time, at different substrate concentrations
c) Hanes-Woolf plot of ([S]/v vs. [S])
about 35% of that obtained at 37 ºC and at A substrate range of 1-30 mM was used and incubation carried
temperatures from 10-28 ºC, the uptake was found to out for 30 sec.
increase line- arly. The data was transformed to v = initial uptake velocity (nmoles. prot . min ),-1[S] = substra- -1
te concentration (mM).
Arrhenius relations- hip of log maximum velocity to 1/T (absolute tempera-

Characteristics of glucose transport across Nutr Hosp. 2006;21(1):38-46 41

the microvillous membranes of human
term placenta
 ture) that yielded a non-linear curve (inset). From the
32 plot were yielded the energy of activation (Ea) values
30
below and above the transition temperature as calcula-
28
ted from the slope which were found to be 7600 and
26
5472 kCal.mol-1, respectively. The transition tempera-
v (n moles mg protein-1 min-1)

24 Control ture (37 ºC) was directly recorded from the plot.
22 HgCl2
Phloretin
20
18 Substrate specificity
16
14 The substrate specificity for D-glucose transport in
12 the placental BBM vesicles was determined by
10 competi- tive inhibition with a number of mono- and
8 disacchari- des and their structural analogues when
6 tested in a ten- fold molar excess over the substrate in
4 the incubation medium which also contained 130 mM
2 NaC]. Table I shows that the D-glucose transport was
1 2 3 inhibited subs- tantially by the glucose analogue,
Time (min) D-galactose, deoxy- glucose, D-mannose, pentose
sugars like D-arabinose, D-xylose and the
Fig. 4.–Evaluation of non-mediated diffusion through membra- disaccharides such as a-lactose, malto- se and sucrose.
ne of 14C-D-glucose in the placental BBM vesicles. The phosphorylated sugars, glucose-1- phosphate,
Penetration of glucose in the membranes in presence of 0.2 mM
phloretin or 0.2 mM HgCl 2at different time points keeping the glucosc-6-phosphate and fructose 1,6-dip- hosphate
substrate concentration constant at 1mM. also produced strong inhibition of D-glucose uptakei in these vesicles. Th
listed in the table was calculated following the equation:
35
v [S] [I]
= , while kt app = (1 + )
30
Jmax kt app + [S] k i
v (n moles mg prot-1 min-1)

25
The k values showed, as listed in table I, that the i
20 disaccharides, phosphorylated sugars and arabinose
with small ki values may prove to be the more potent
15 BBM inhibitors.
10
Effect of steroids
5
To study the effect of a number of steroid hormones
0 15 22 28 37 48
on the uptake of D-glucose in the BBM vesicles, the
Temperature (°C)
membranes were preincubated for 10 min with a steroid
1,50 and then the uptake studies carried out. During the trans-

1,40
300

1,30
v x 6 n moles/mg prot/min
log v

200
1,20

1,10 100

3,1 3.2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 81 6, 4, 2, 0,

-3
1/T ×10 (°K) Insulin conc. (units/ml)

Fig. 5.–Effect of temperature on 14 C-D-glucose uptake in the

placental BBM vesicles. a) v vs. t (ºC). b) Arrhenius transfor- Fig. 6.–Effect of insulin on on C-D-glucose uptake in the pla- 14
mation (log v vs. 1/T (ºK) of the data) cental BBM vesicles.

42 Nutr Hosp. 2006;21(1):38-46 Ravinderjit Kaur Anand y cols.

 Table I
Competition of various sugars with labeled C-D-glucose for the D-glucose transport in placental BBM vesicles
14

Competitor Structural Uptake velocity % inhibition Inhibition

(10 MM) difference from (v) (nmoles. of D-glucose constant
D-glucose prot-1 . min-1) transport (ki ) (mM)

None – 53.84 ± 4.74 – –

D (+)–Mannose Epimer at No. 2 26.67 ± 7.69 50.46 32.31
D(+)–Galactose Epimer at No. 4 23.65 ± 5.76 56.07 17.15
D(+)–Arabinose Pentose 20.44 ± 0.99 62.04 10.39
D(+)–Xylose Pentose 22.01 ± 4.61 59.12 13.10
A-Lactose Disaccharide 19.28 ± 3.63 64.19 8.84
2-deoxy-D-glucose Missing hydroxyl at 20.67 ± 0.25 61.05 11.21
No. 2
D(+Fructose Ketose 23.91+1.21 55.59 17.96
Maltose Disaccharide 21.52 ± 3.75 60.03 12.16
Sucrose Disaccharide 23.24 ± 5.76 56.84 15.98
Glucose-1- Phosphorylated at 29.87 ± 1.05 44.52 –
phosphate No. 1
Glucose-6- Phosphorylated at 23.94 ± 0.82 55.53 18.05
phosphate No. 6
Fructose-1,6- Ketose,
diphosphate phosphorylated at 19.39 ± 2.33 63.99 8.98
No. 1 & 6

Each datum represents mean ± SD of 3-4 independent observations.

port, the media contained 500 µM steroid; 30 mM subs-
trate and 130 mM NaCl. Progesterone, 17±-hydroxypro-
gesterone and testosterone strongly inhibited the uptake
process and 13-estradiol inhibited moderately while cho-
lesterol produced a rather weak inhibition (table II). Al-
so, an amount of 5% ethanol present as solvent for the
steroids had no effect on glucose uptake. The inhibition
constant as listed showed that the hydroxylated proges-
terone with 0.22 mM was the most potent inhibitor.
pendent linear relationship of the increase in
D-glucose uptake with an increment in insulin
concentration in the incubation medium. It is also
interesting to note that an extrapolation of the linear
plot to the insulin concentration intersects the y-axis
at a point which wasvalue as obtained
identical to the J in the substrate
max The uptake values however, were
kinetics experiment.
obtained when BSA was present along with insulin,
while without BSA, the value was about 29.5% less.

Effect of insulin Effect of inhibitors

Insulin was found to stimulate the glucose uptake in
the placental BBM vesicles. Fig. 6 showed a dose de-
DNP
The uptake was inhibited by a number of com-
pounds which are known membrane perturbing
agents or metabolic inhibitors (fig. 7). Ouabain, a
+ +
competiti- ve inhibitor of Na /K -ATPase showed about 20%
inhibition of glucose uptake. 2,4-dinitrophenol

60 (DNP), a potent metabolic inhibitor blocked the

50
influx to as much as 50% while its para substituent
remained almost without any effect. Nicotine, a well
Ouapain

40 documen- ted drug of abuse, depressed the uptake

% inhibition

significantly up to 18% of the control value.

Nicotine

30

20 Discussion
Control

PNP

10 Glucose is a major fetal nutrient and understanding

its transport across placenta is fundamental to the un-
0
derstanding of the fetal nutrition and metabolism. Sin-
ce, the fetal liver is known to be deficient in gluconeo-
Fig. 7.–Effect of different chemicals (metabolic inhibitor) on genic activities 14
, a transplacental movement of sugar
the transport of 14 C-D-glucose uptake in the placental BBM from the maternal blood remained the only source for
vesicles. this primary energy molecule. Transport through the

Characteristics of glucose transport across Nutr Hosp. 2006;21(1):38-46 43

the microvillous membranes of human
term placenta
 Table II
Effect of steroids on C-D-glucose transport in the placental BBM vesicles
14
Uptake velocity (v)
Steroid (1 mM) (nmoles. prot-1
. min-1)
Control 195.66 ± 12.6
Cholesterol 157.08 ± 11.73
² -Estradiol 83.16 ± 4.56
Progesterone 62.22 ± 2.54
Testosterone 56.52 ± 3.90
17 ±-hydroxy 41.85 ± 16.67
progesterone
Each datum represents mean ± SD of 3-4 independent observations.
microvillous plasma membrane of the placental
syncy- tiotrophoblast is believed to be the first step in
the transfer process. The study of D-glucose uptake in
the isolated membrane vesicles in the present
investigation clearly demonstrates the presence of a
high affinity glucose transport which is selective and
mediated by a facilitated diffusion system. The
process was saturable and had a kt of 1.2 mM which is
similar to that repor- ted in a number of tissues 15such as
results trate. The
the adipocyte and the cultured fibroblasts from baby hamster kidney . The transport system also seems to have little dis-
suggest that the monosaccharide is transiently
accumulated within the vesicles by an electrogenic
process dependent on the presence of an inward gra-
dient of NaCl. The process is therefore, powered by
sodium co-transport and aptly called as the “secondary
16
active transport” . The transport is characterized by a
huge overshoot phenomenon which is also variously
reported in 10 experiments with glucose and amino
acid transport in the isolated microvillous membrane
vesicles of similar transport epithelia, like intestinal
17,18
vi- llous and renal proximal tubule . Outward flux of
the monosaccharide is characterized by two distinct
phases, a slower one preceded by an extremely rapid
flux. The biphasic time course indicates the possibility
of existence of two types of vesicular compartments
with transport system of different affinity - one that
fills and empties much faster than the other one. The
transport also showed clearly its sensitivity towards
temperature of incubation. The uptake was negligible
at 4-15°C, proceeded maximally at 37°C and was
inhi- bited thereafter, thus further suggesting that the
pro- cess was transport protein-mediated and
depended on the changes in membrane lipid
microenvironment. The non-linearity in Arrhenius
plot demonstrates a selecti- ve partitioning of the
protein (transporter) in the orde- red and liquid
crystalline lipid phases. The break point as visualized
directly from the plot corresponds to the membrane
-1
lipid phase transition (Tc). The Ea below the Tc (7600 kCal.mol
of the native molecule to the activated state while the
Ea above the Tc (5472 kCal.mor1) may relate to dena-
turation or unfolding of the higher order structures.
44 Nutr Hosp. 2006;21(1):38-46
% inhibition of D- Inhibition
glucose transport constant (ki) (mM)
– –
19.72
57.50 2.19
68.20 0.54
71.11 0.42
78.61 0.22
The D-glucose uptake in placental BBM vesicles
prefers substrates which are conformational analogues
such as the D-galactose, D-mannose or the phosphory-
lated sugar at one or six position. It was interesting to
note that a number of disaccharides also compete for
the glucose binding sites. The possible explanation
could be that these membranes are also richly
19
endowed with disaccharide hydrolases which could provide the
ready source, of the competing monosaccharide subs-
crimination for the pentose sugar and the ketohexoses.
The microvillous membrane glucose transport sys- tem
is inhibited by a number of steroid hormones which
although are synthesized in vivo by the placenta and
their local concentration cannot be told precisely, but
may be presumed to be quite high. Smith and Brush 20
reported a value of 1-2 µg of progesterone per g of
iso- lated microvilli from placenta that corresponds to
about 5-6xM10which is within the range of the steroids
where inhibition of glucose transport was observed in
the present study. Direct inhibitory effects of steroids
on glucose transport had been demonstrated in other
cell types such as the diethylstilbestrol in erythrocy-
tes21. It seems that the inhibition of glucose uptake in
placental microvillous membranes from the maternal
blood in ten-fold molar excess of the steroids is a part
of the unique self regulatory mechanism of a tissue
which is known to be autonomous. However,
choleste- rol, the precursor molecule for these steroids
did have little effect on the uptake process. Steroid
hormones ha- ve also been shown to inhibit strongly
the 22
uptake pro- cess of different amino acids in the
placental membra- nes . On the other hand, the transport process was
stimulated in a dose dependent fashion by insulin. Pla-
cental membranes are richly endowed with high affi-
nity insulin receptors 23-25, although the biological ef-
fects of insulin on placenta are unknown and the
membrane contains no hormone-sensitive adenylate
26
cy- clase
. Insulin however,
) corresponded seemed to inhibit the amino
to the transition
acid movement . The inhibition is particularly pro- 27
nounced in placental slice preparations . Since, insulin
is rapidly degraded by placental tissues24,29 we have ad-
28
Ravinderjit Kaur Anand y cols.
ded BSA to the incubation medium to slow down the
proteolysis of insulin.
A number of drugs, membrane perturbing agents
and metabolic inhibitors have been shown to inhibit
the glu- cose uptake in the present study. Ouabain, a
cardiac glycoside which specifically inhibits+the +Na /K AT-
Pase by competitively binding with the K –inding sites
+
of the enzyme . The enzyme is responsible for genera-
ting the Na –gradient and therefore, the inhibitory ef- +
30
fect of the drug on glucose transport which has to be
co- transported with+Na , is also expected. Ouabain has al-
so been found to inhibit the amino acid transport in
22
and other epithelial surfaces . Similar com- 31
pla- cental
pounds like digoxin and ethacrynic acid which
inhibited the transport ATPase, also strongly blocked
the amino acid and glucose transport in placental
32
mem- branes . The oxidative inhibitor, dinitrophenol inhibi-
ted the uptake while in the presence of p-nitrophenyl
phosphate, the uptake of glucose appeared to maintain
the near normal rate. The results are similar to that of
the glucose and amino acid uptake in placental slice
32
ex- periments . Dinitrophenol is also reported to inhibit the
vitamin B uptake in placental membranes .3312
The uptake is also inhibited drastically by metabo-
lic poison, HgCl 2and also by phloretin. Phloretin has
some structural similarities to the steroids and is also
known to be weakly estrogenic34. It has an o- -D-glu-
² rad N: Glutamine transport by rat basolateral membrane vesi-
copyranosine in its molecule, which is used experi-
mentally to produce glycosuria and is a potent
inhibi- tor of glucose transport in the intestinal and
35,36
renal membrane vesicles . Nicotine is a major drug of
abuse, known to depress the placental amino acid
transport37 and may be one of the factors that cause
re- duction in intrauterine fetal growth in smoking mot-
hers . Nicotine considerably inhibited the glucose up-
38
take which is surprising in view of the fact that
placenta is devoid of any kind of nerve. However, it
is known that placenta is rich in acetyl choline and
39
its metabolizing enzymes . Nicotine binds to the acetyl
choline/muscarinic receptor and it is believed that
cholinergic regulation may form the basis of glucose
and amino acid transport in placenta37 .
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