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Dinámica de amplificación de los miembros de la familia alu específicos para humanos (HS)

RESUMEN
Hemos investigado la distribución de varios miembros de la familia Alu insertados recientemente en
representantes de diversos grupos humanos. Los estudios de población humana que utilizaron 65 muestras
de ADN humano no relacionado, así como un estudio familiar para comprobar la herencia, mostraron que
los miembros individuales de la familia Alu podían dividirse en tres grupos. El primer grupo consistía en
miembros de la familia Alu relativamente antiguos que eran monomórficos (homocigotos) en toda la
población analizada (HS C3N1 y C4N6). El segundo grupo (HS C4N2, C4N5 y C4N8), aparentemente se
insertó en otras regiones repetitivas del genoma, dando lugar a resultados no concluyentes en la prueba
PCR utilizada. Sin embargo, está claro que estas inserciones Alu concretas estaban presentes en la mayoría,
si no en todos los loci analizados. El tercer grupo estaba formado por tres miembros dimórficos de la familia
Alu (HS C2N4, C4N4 y TPA 25). Sólo un miembro de la familia Alu (TPA 25) mostró un alto grado de
dimorfismo dentro de la población humana. Este último ejemplo también mostró diferentes frecuencias
alélicas en distintos grupos humanos. El aislamiento y la caracterización de otros miembros de la familia
Alu con alto grado de dimorfismo deberían constituir una herramienta útil para la genética de las
poblaciones humanas.

INTRODUCCIÓN
La familia Alu de elementos de ADN repetitivo intercalado corto (SINEs) está distribuida por los genomas de los
primates (para revisiones ver 1, 2, 3). La familia Alu representa una de las clases más exitosas de elementos
móviles, habiendo surgido como familia de ADN repetitivo en los últimos sesenta y cinco millones de años (4) y
amplificado hasta un número de copias superior a 500.000 en el genoma humano (5). Cada elemento Alu tiene
una longitud aproximada de 300 pb y consta de dos mitades dispuestas en tándem, la mitad derecha de las cuales
contiene 31 pb adicionales con respecto a la mitad izquierda (5). Los elementos Alu también contienen una región
media rica en A, una cola 3' oligo-dA de longitud variable, y están flanqueados por repeticiones directas cortas
que se forman durante la integración en nicks cromosómicos escalonados (5, 6). Se cree que las secuencias Alu
derivan ancestralmente del gen de ARN 7SL (7), y se movilizan a través de un intermediario derivado de la ARN
polimerasa III mediante un proceso denominado retroposición (8).
Los miembros de la familia Alu que se encuentran en los genomas de los primates pueden subdividirse en grupos
de miembros de subfamilias relacionadas en función de la identidad de los nucleótidos (9). En los genomas de los
primates se han identificado varias subfamilias superpuestas de distintas edades genéticas (10, 11, 12, 13, 14). La
subfamilia más reciente de secuencias Alu encontrada en el genoma humano se denominó originalmente la "nueva"
subfamilia (15). Posteriormente, se ha caracterizado más y se ha denominado subfamilia de Variantes Predichas
(PV) (16) y subfamilia de Específicos Humanos (HS) (17). Curiosamente, la subfamilia HS (PV) también resultó
ser transcripcionalmente activa in vivo, lo que sugiere la competencia transposicional de esta subfamilia (16). Se
estima que hay entre 500 (17) y 2000 (16) miembros de la subfamilia HS recientemente insertados en el genoma
humano. Los miembros individuales de la subfamilia HS comparten un alto grado de identidad nucleotídica
(>98%) con la secuencia consenso de la subfamilia, lo que sugiere que se derivaron de un único gen o, como
mucho, de un conjunto de genes fuente estrechamente relacionados (6, 15, 16, 17, 18). Anteriormente, se descubrió
que varios miembros de la subfamilia HS sólo estaban presentes en el genoma humano, y que estaban ausentes en
posiciones ortólogas en los genomas de otros primates, lo que indicaba que la mayoría de los miembros de la
subfamilia HS, si no todos, se habían amplificado en el genoma humano en los últimos 4-6 millones de años (17).
En este informe, presentamos un análisis detallado de la distribución de ocho miembros de la subfamilia HS
recientemente insertados en los principales grupos humanos.

MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras de ADN y líneas celulares
Las muestras individuales de ADN se aislaron de linfocitos humanos periféricos como se describió anteriormente
(19). Estas muestras estaban disponibles a partir de estudios anteriores y se consideraron exentas de las
restricciones sobre sujetos humanos tras la revisión del IRB. Las muestras de ADN africano fueron proporcionadas
por el Dr. Haig H. Kazazian. Las muestras de ADN familiar fueron un regalo de la Dra. Bronya Keats. Las muestras
de ADN de la línea celular híbrida humano-hámster "PCRable" se obtuvieron de BIOS.

Amplificación PCR
La amplificación de las muestras de ADN se llevó a cabo en reacciones de 100 ml utilizando 100 ng de ADN
diana, 750 ng de cada cebador, 100 mM de dNTP y Taq ADN polimerasa (3 u) según las instrucciones del
proveedor (BIOS). Cada muestra se sometió al siguiente ciclo de amplificación: 1 minuto a 94°C
(desnaturalización), 2 minutos a la temperatura de recocido y 2 minutos a 72°C (extensión), durante 30 ciclos. Los
cebadores de oligonucleótidos y las condiciones de recocido para HS C2N4, C3N, C4N4, C4N6, C4N8, C4N5 y
TPA 25 fueron comunicados previamente (17). Los miembros de la subfamilia HS C2N4, C3N1, C4N2, C4N4,
C4N5, C4N6 y C4N8 se aislaron a partir de una biblioteca genómica humana aleatoria como se describió
anteriormente (17). El miembro de la familia TPA 25 Alu se encontró en uno de los dos clones independientes del
locus del activador del plasminógeno tisular humano (20). Los cebadores de oligonucleótidos para el HS C4N2
fueron el cebador 5'-TGCAGGAATTCAGCACAAATTGTAG-3' y el cebador 3' 5'-
AAATCAGTCCTACCATGTTGTC-3' con una temperatura de recocido de 58°C. Veinte microlitros de cada
muestra se fraccionaron en un gel de agarosa al 2% con 0,5 AgIml de bromuro de etidio. Los productos de la
reacción se visualizaron directamente por fluorescencia UV.

Análisis informáticos
Las frecuencias alélicas y los análisis de chi-cuadrado se determinaron utilizando un programa de análisis de datos
genéticos diseñado para SAS (21). Los sitios individuales de preintegración de los miembros de la familia Alu
(HS C4N2, C4N5 y C4N8) se utilizaron para buscar en la base de datos EMBL (versión 21) utilizando el programa
FASTNSCAN de PC/GENE (Intelligenetics) con un valor de k-tupla de 4. Este programa se basa en el algoritmo
FASTN de Lipman y Pearson (22).

RESULTADOS
Distribución bruta de los miembros de la familia Alu recientemente amplificados
Cada locus de inserción de un miembro de la subfamilia Alu HS se analizó por PCR utilizando cebadores
oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ADN únicas que flanquean a cada miembro de la subfamilia
Alu. Estos cebadores amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb si la secuencia Alu estaba
presente, o de aproximadamente 150 pb en ausencia del miembro de la familia Alu (véase la Figura 1). Los
individuos fueron calificados como homocigotos (+ +), heterocigotos (+ -), u homocigotos (- -) para la presencia
de la banda de 400 pb (+), o la banda de 150 pb (-). Los genotipos, los valores esperados y las frecuencias alélicas
de los miembros individuales de la subfamilia HS determinados a partir de los análisis de PCR se resumen en la
Tabla 1. Los miembros individuales de la subfamilia se distribuyeron en tres grupos distintos basados en su
distribución dentro de la población humana. Un grupo estaba compuesto por los miembros dimórficos de la
subfamilia TPA-25, HS C2N4 y HS C4N4. Un segundo grupo (HS C3N1 y C4N6) era monomórfico (homocigoto)
para la presencia de un miembro de la familia Alu en las 65 muestras humanas no relacionadas que se analizaron
(Tabla 1). El tercer grupo (HS C4N2, C4N5 y C4N8) mostraba ambas bandas en todos los individuos analizados,
aparentemente como resultado de la inserción de miembros de la subfamilia Alu en otros loci repetitivos (véase
más adelante). Los miembros dimórficos de la subfamilia pueden subdividirse en grupos altamente dimórficos
(TPA 25) y débilmente dimórficos (HS C2N4 y C4N4). La presencia de sólo uno y dos individuos heterocigotos
para HS C2N4 y C4N4, respectivamente (Tabla 1), hace que estos miembros de la familia Alu sean poco
informativos a nivel poblacional, pero son consistentes con la inserción relativamente reciente de la subfamilia en
el genoma humano. Sólo el miembro de la subfamilia TPA 25 mostró una heterocigosidad significativa dentro de
los grupos utilizando una prueba de Chi-cuadrado para la homogeneidad en los recuentos alélicos (X2=12,05,
d.f.=3, P<0,01). La frecuencia alélica del miembro de la subfamilia TPA 25 fue significativamente diferente en
las poblaciones de origen africano en comparación con las de origen no africano (x2=9,93, d.f.=1, P<0,01). En
todos los casos, las frecuencias genotípicas dentro de los grupos se acercaron (P <0,05) a las frecuencias predichas
(Hardy-Weinberg) utilizando las pruebas de Chi-cuadrado para la bondad de ajuste (Tabla 1).

Análisis de pedigrí
Realizamos un análisis de PCR en tres conjuntos de muestras de ADN familiar compuestos por los padres y un
total de 15 progenies para determinar el modo de herencia de algunos de los miembros de la familia Alu
recientemente amplificados (TPA 25, HS C4N2, C4N5 y C4N8). El miembro de la subfamilia TPA 25 demostró
un patrón de herencia consistente con la herencia codominante mendeliana normal (Figura 1). Los otros tres
mostraron tanto las bandas grandes como las pequeñas de la PCR en todas las muestras analizadas. En la Figura 2
se muestra un pedigrí representativo y una cromatografía de los productos de PCR resultantes del locus HS C4N5.
Estos datos muestran que el miembro de la subfamilia HS C4N5 de una familia representativa muestra ambas
bandas en cada individuo probado. Un análisis de Chi-cuadrado mostró que la proporción observada de la progenie
(0:1:0) era significativamente diferente de la esperada (1:2:1) de un cruce de dos individuos heterocigotos en un
solo locus (X2 =15, d.f.=2, P<0.001). Los miembros de la subfamilia HS C4N2 y C4N8 también mostraron ambas
bandas en todos los individuos analizados (Tabla 1).

Análisis del sitio antes de la integración

Los sitios de preintegración predichos (las secuencias que flanquean a los miembros de la familia Alu) para HS
C4N2, C4N5 y C4N8 se buscaron entonces en la base de datos EMBL (versión 21) para identificar cualquier
identidad nucleotídica significativa con regiones del genoma humano previamente analizadas. Los miembros de
la subfamilia HS C4N2 y C4N5 no mostraron ninguna similitud de secuencia significativa con ninguna región del
genoma previamente analizada. Sin embargo, HS C4N8 compartió un 73,7% de identidad nucleotídica con un
elemento repetitivo de la Línea 1 (LI) humana de la región intergénica de los genes de la globina e y g (secuencia
EMBL HSHBEG). Por lo tanto, creemos que HS C4N8 se insertó en un miembro de la familia LI dentro del
genoma. La inserción en una región altamente repetitiva del genoma, como una secuencia LI (aproximadamente
100.000 copias) (23), explicaría la presencia de ambas bandas en todos los ensayos de PCR. La banda de 150 pb
(ningún miembro de la familia Alu) sería el resultado de cualquier número de las 100.000 copias (loci) de LI que
no han divergido lo suficiente como para que los cebadores de oligonucleótidos sean ineficaces, mientras que la
banda de 400 pb es el resultado de la amplificación de un único miembro de la familia Alu que es relativamente
monomórfico en toda la población. Sin embargo, la verdadera frecuencia alélica del locus de inserción
(retroposición) del miembro de la familia Alu (dentro de un único elemento LI) sigue siendo desconocida debido
a las limitaciones de la técnica PCR. Dado que la banda de 400 pb está presente en todas las muestras analizadas,
está claro que el alelo de 400 pb tiene una frecuencia muy alta, pero no podemos determinar directamente cuál de
las muestras, si es que hay alguna, puede ser heterocigota para este alelo específico. Sin embargo, podemos poner
un límite superior de confianza del 95 % en la frecuencia de homocigotos raros y no detectados para la banda de
150 pb en los 71 individuos no relacionados, que es de 1-0,051/71 = 0,041. La frecuencia esperada de la banda de
150 pb correspondiente a este límite superior es de 0,0411/2 = 0,203.

Análisis de líneas celulares híbridas

Los datos anteriores sugerían que todos los miembros de la subfamilia HS que muestran ambas bandas de PCR en
todos los individuos analizados (HS C4N2, C4N5 y C4N8) representaban integraciones en secuencias de ADN
repetidas preexistentes. Para confirmar aún más esto para HS C4N2, también amplificamos un panel de ADN de
líneas celulares híbridas humano-hámster para determinar la distribución de secuencias relacionadas con el sitio
de pre-integración (objetivo) de HS C4N2. La amplificación del panel (datos no mostrados) mostró que una banda
de 150 pb (ningún miembro de la familia Alu) fue amplificada de cada línea celular híbrida del panel, demostrando
que el sitio de pre-integración es una secuencia repetida localizada en muchos cromosomas. La banda de 400 pb,
que contiene el miembro de la subfamilia HS, sólo se localizó en los híbridos que contienen el cromosoma 13, el
14 o ambos cromosomas, con la excepción de la línea celular híbrida 968, que contiene el cromosoma 13 y sólo
tiene la banda de 150 pb. Este último resultado hace imposible una asignación cromosómica definitiva del miembro
de la subfamilia HS C4N2. Puede deberse a una deleción o reordenación no detectada previamente dentro de una
de las líneas celulares híbridas, o puede representar un dimorfismo en la presencia de esta secuencia de HS en un
cromosoma humano. Sin embargo, junto con la amplificación de 65 individuos no relacionados y el análisis de
pedigrí en el que cada individuo amplificó ambas bandas, estos datos demuestran claramente que la HS C4N2 se
retropuso en una región repetitiva del genoma que estaba dispersa en varios cromosomas humanos antes de la
inserción de este miembro de la familia Alu. Por lo tanto, concluimos que la inserción de HS Alu se produjo en
una secuencia repetitiva no caracterizada previamente, lo que interfiere con el análisis de la PCR. Sin embargo, al
igual que HS C4N8 y C4N5, el alelo de 400 pb debe estar presente en una frecuencia muy alta para que no haya
individuos homocigotos por su ausencia (Tabla 1).

DISCUSIÓN
El alto porcentaje (3 de 11, véase más abajo) de miembros de la subfamilia HS recientemente insertados en
regiones duplicadas del genoma sugiere que este tipo de eventos se producen con una frecuencia relativamente
alta. Aunque los miembros de la familia Alu están distribuidos por todo el genoma, se ha demostrado que se
agrupan dentro de regiones específicas, por ejemplo los intrones de los loci humanos de la timidina quinasa (tk),
la β-tubulina y el inhibidor C-1 (24, 25 y 26, respectivamente). Sin embargo, se ha demostrado previamente poco
más que una preferencia de sitio objetivo rico en A+T para las inserciones de miembros de la familia Alu (6, 27,
28). La agrupación de los miembros de la familia Alu puede ser el resultado de la inserción aleatoria en sitios diana
adicionales ricos en A+T (región media rica en A y cola 3' oligo-dA) creados por retroposiciones anteriores de
miembros de la familia Alu, alguna especificidad más general de los sitios de inserción, como dominios
cromosómicos específicos, o la presión selectiva contra la inserción en regiones del genoma que codifican
proteínas. La inserción de una proporción tan alta (3/11) de miembros de la familia Alu recientemente amplificados
en regiones duplicadas del genoma sugiere que puede haber una característica cromosómica general que favorezca
las inserciones de retroposones y/o otras duplicaciones de secuencias. Una vez que una secuencia se inserta o
duplica en una de estas regiones, la preferencia debe seguir existiendo para favorecer una segunda inserción dentro
de la misma región general.
Estos estudios demuestran la edad relativa de cada miembro de la subfamilia HS. Los miembros monomórficos de
la subfamilia (HS C3Nl y C4N6) constituyen el grupo más antiguo de los miembros de la subfamilia HS. La
naturaleza monomórfica de estos miembros de la subfamilia sugiere que son anteriores al origen del hombre
moderno hace 200.000-1 millón de años (29). Sin embargo, se ha demostrado que los miembros de esta subfamilia
son posteriores a la divergencia entre el hombre y el gran simio (17), que se cree que ocurrió hace 4-6 millones de
años (30). Los estudios basados en las sustituciones de nucleótidos de diagnóstico también sugieren que la edad
media de los miembros de la subfamilia HS es de 2,8 millones de años (6). Por lo tanto, concluimos que estos
miembros de la subfamilia se retropusieron en el genoma humano hace entre 200.000 y 6 millones de años, después
de la divergencia entre humanos y grandes simios y antes de la radiación del hombre moderno.
La baja frecuencia de retroposiciones de miembros de la familia Alu (aproximadamente 100-200/millones de años)
(17, 31) sugiere que las inserciones individuales de miembros de la familia Alu (retroposiciones) representan
eventos de inserción únicos e independientes que han ocurrido sólo una vez en la población humana. Estudios
anteriores sobre los grupos de genes de globina de los primates han demostrado que los miembros individuales de
la familia Alu permanecen en los genomas de los primates después de su inserción inicial y no están sujetos a
niveles significativos de conversión genética o eliminación de secuencias, por lo que representan marcadores
genómicos estables (32, 33, 34). Esto distingue los dimorfismos de inserción de los miembros de la familia Alu
de otros polimorfismos genómicos como el RFLP (35), el VNTR (36) y el AluVpA (37), que pueden ser de origen
múltiple y menos estables.
Dada la naturaleza única y la estabilidad de las inserciones de los miembros de la familia Alu (33), el estado
altamente dimórfico de la inserción TPA 25 dentro de varios grupos humanos sugiere que este miembro de la
subfamilia es de origen muy reciente. Anteriormente, se demostró que el miembro de la subfamilia TPA 25 es
posterior a la divergencia entre humanos y grandes simios, que se cree que ocurrió hace 4-6 millones de años (30),
y se clasificó como miembro de la subfamilia HS-2 (6, 17) o PV (18). Estos estudios muestran que sólo está
presente en aproximadamente la mitad de los alelos, lo que sugiere que se insertó después de la formación del
hombre moderno. Los estudios sobre el ADN mitocondrial han sugerido que el hombre moderno se originó en
África hace 200.000-1 millón de años (29), lo que implica que el miembro de la familia TPA 25 Alu se insertó en
el genoma humano en los últimos 200.000-1 millón de años. Anteriormente, otros tres miembros de la subfamilia
HS (PV 92, MLVI-2 y APO) también han sido clasificados como dimórficos dentro del genoma humano. El PV
92 mostraba un alto grado de dimorfismo en un número limitado de individuos (16), mientras que el MLVI-2 sólo
estaba presente en uno de 59 individuos no relacionados (38). El miembro de la subfamilia APO HS (18), situado
cerca del clúster de genes de la apolipoproteína humana AI-CIiI-AIV, se analizó mediante un análisis RFLP (39,
40), y se encontró que tenía un grado moderado de heterocigosidad. Por lo tanto, el 55% (6/11) de los miembros
de la familia HS Alu seleccionados al azar parecen ser dimórficos, con un 18% (2/11) monomórficos y el 27%
restante (3/11) con inserción en regiones duplicadas del genoma humano. Aproximadamente el 27% de los
miembros de la subfamilia HS (aproximadamente 135 de los 500 miembros de la subfamilia HS) pueden ser loci
informativos (altamente dimórficos) para los estudios de poblaciones humanas. La frecuencia alélica de los
miembros de la subfamilia TPA 25 fue significativamente diferente en grupos humanos de origen africano y no
africano. Estas diferencias pueden reflejar que esta inserción se produjo cerca del momento de la migración del
hombre moderno fuera de África, o simplemente reflejar que la deriva genética en estas poblaciones ha fijado el
alelo de inserción Alu en diferentes frecuencias. Un solo locus en esta población de tamaño relativamente limitado
no proporciona la suficiente resolución para diferenciar entre las distintas posibilidades. El aislamiento y la
caracterización de otros miembros altamente dimórficos de la familia Alu en grupos de población humana bien
definidos debería proporcionar una herramienta útil para comprender la evolución temprana del hombre moderno
y la dinámica de la población que se produjo.

AGRADECIMIENTOS
Nos gustaría agradecer a los doctores V. K.Slagel, G.R.Daniels y Bronya Keats la revisión crítica de este
manuscrito. Al Dr. J.Craig Cohen y a la Sra. Jane Thompson por facilitarnos numerosas muestras biológicas.
También nos gustaría agradecer al Sr. James Carlton de los laboratorios centrales del LSUMC por la síntesis de
oligonucleótidos. Los servicios fotográficos fueron proporcionados por el departamento de servicios fotográficos
del LSUMC. J.C.M. recibió el apoyo del programa de investigación de verano para estudiantes de medicina de la
LSU. Esta investigación fue apoyada por la subvención del USPHS número ROl HG00340 a P.L.D. y RR 08205
a R.J.H., y una subvención de los Cancer Crusaders a M.A.B.

Figura 1. Herencia del miembro de la subfamilia TPA 25. Pedigrí de una familia ensayada para la transmisión del
miembro de la subfamilia TPA 25 y un gel de agarosa de los productos de PCR de la amplificación del miembro
de la subfamilia TPA 25. Los marcadores de longitud de los fragmentos (carriles exteriores, ADN ΦX174 RF
digerido por Hae III) se indican en pb. Los carriles experimentales 1 y 2 representan a los progenitores, y los
carriles 3-8 a la progenie, como se indica. La nube y la banda inferiores también estaban presentes en los
experimentos de control que no contenían ADN genómico y representan el exceso de cebadores, nucleótidos y
amplificación de dímeros de cebadores, respectivamente. El carril parental 1 representa un heterocigoto, con las
bandas de 150 y 400 pb. El carril parental 2 representa la homocigosidad para la banda de 150 pb. Los carriles de
la progenie muestran todos uno de estos dos patrones.

1.2
Tabla 1. Distribución de los miembros de la familia Alu recientemente amplificadost

Figura 2. Herencia del miembro de la subfamilia HS C4N5. Pedigrí de una familia ensayada para la transmisión
del miembro de la subfamilia HS C4N5 y un gel de agarosa de los productos de PCR de la amplificación del
miembro de la subfamilia HS C4N5. Los marcadores de longitud de los fragmentos (ADN FX174 RF digerido por
Hae III) se indican en pb. Los carriles I y 2 representan a los progenitores, y los carriles 4-9 a la progenie, como
se indica en el pedigrí.