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Tema 3 Protein As Alum No
Tema 3 Protein As Alum No
INTRODUCCIÓN
A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos
permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido
proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en el estudio
de las proteínas plasmáticas.
Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos
corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido
cefalorraquídeo (15-45 mg/dL).
Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar:
• Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma.
• Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma
por rotura de otras células.
• Método de Lowry
Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra.
Consiste en dos reacciones:
1. Reacción de Biuret
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2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los
aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2 ,
reducen el reactivo de Folin generando un color azul.
Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.
• Turbidimetría
Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas
• Absorción en el ultravioleta
Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los
anillos aromáticos de triptófano y tirosina.
• Métodos de unión a colorantes
1. Turbidimetría y nefelometría
2. Inmunodifusión
3. Electroforesis
4. Inmunoelectroforesis
5. Inmunoelectroforesis en cohete
6. Inmunofijación
7. Cromatografía
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz
se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
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1.1. La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través
de una suspensión de partículas utilizando para ello un
espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se
mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que
haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. determinación
de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las
proteínas precipiten con TCA o ácido
sulfosalicílico).
Aspectos prácticos:
• Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que
produzcan una dispersión de luz no deseada ej. lipoproteínas,
quilomicrones También puede interferir la suciedad.
• La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las
proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta (? <
300nm) y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello
se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm.
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• Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno que reconoce y
se une al anticuerpo.
• Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas llamadas inmunoglobulinas,
producidas por linfocitos B y su progenie (células plasmáticas) que se
combinan específicamente con los antígenos.
2.- INMUNODIFUSIÓN
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a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: se forman
pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se
depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los
estándares de proteínas y los problemas en los pozos
circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el
anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman
bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda
se determinan según la concentración del antígeno y del
anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con
respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad
de antígeno presente.
Inconvenientes de la inmunodifusión:
2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran
tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede
redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de
concentración de Ag o Ac en el gel.
3. ELECTROFORESIS
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(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y
quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.
A pH 8,6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen carga
global negativa). La albúmina, con pI de 4,7 tendrá una mayor carga
negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo
anterior explica que la albúmina recorra una mayor distancia que la
gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico.
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1. Separación electroforética mediante un campo eléctrico
2. Fijación de las proteínas sobre el soporte
3. Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación.
Se realiza mediante colorantes ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que
se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso de
colorante se arrastra con mezclas acético -agua, o metanol-acético, según
el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del
colorante fijado a las proteínas.
4. Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros
especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a
diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la representación
gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las
fracciones proteícas del suero sanguíneo).
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• La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto
al punto de aplicación de la muestra (cátodo)
• Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1
(a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%),
beta (ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas,
inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos
se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha).
Es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por
un conjunto de proteínas con una movilidad electroforética
semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y
función. Además, excepto la albúmina, el resto de las fracciones
corresponden a grupos de proteínas, por ello , aunque el resultado de la
fracción sea normal, puede existir variación porcentual en sus componentes.
Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos
inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la
inmunoelectroforesis.
4. INMUNOELECTROFORESIS
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difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se
forman bandas de precipitación.
5. INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE
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6. INMUNOFIJACIÓN
Preguntas de revisión
8. La nefelometría mide:
a) La luz dispersada
b) La luz transmitida
c) La disminución de la luz transmitida
d) La disminución de la luz dispersada
e) La luz reflejada
9. La turbidimetría mide
a) La luz dispersada
b) La luz transmitida
c) La disminución de la luz transmitida
d) La disminución de la luz dispersada
e) La luz reflejada
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11. La turbidimetría se puede medir:
a) En turbidímetros especiales.
b) En aparatos con un monocromador de turbidez.
c) En aparatos con un detector especial para la luz dispersa.
d) En cualquier espectrofotómetro o analizador de química clínica.
e) En aparatos con cubetas especiales
18. En un campo eléctrico, una molécula cargada negativamente migra hacia el:
a) Ánodo
b) Cátodo
c) Polo negativo
d) Polo positivo
e) a y d
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e) ay b
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