Fundamentos de las pruebas

bioquímicas y sus aplicaciones

en biotecnología
● Roberto Alan Díaz Cervantes
● Abraham Jerez Trigueros
● Cesia Daniela Pérez Aguilar
● Jesús Ernesto Ramírez Nieto
● Alejandra Vera Juárez
 Índice
1. Objetivos
2. El metabolismo bacteriano
3. Pruebas bioquímicas
4. Fundamento
5. Clasificación
a) Universales
b) Diferenciales

6. Aplicaciones de las pruebas bioquímicas en la biotecnología.

7. Bibliografía
 Objetivos

● Conocer las diferentes pruebas químicas utilizadas en la

identificación de distintas rutas metabólicas.
● Entender conceptos claves de metabolismo microbiano.
● conocer algunas aplicaciones en biotecnología de las pruebas
bioquímicas.
 Metabolismo microbiano
Conjunto de procesos por los cuales un
microorganismo obtiene la energía y los
nutrientes

Las características metabólicas ayudan a

determinar:

● Su papel ecológico
● Su responsabilidad en los ciclos
biogeoquímicos
● Su utilidad en los procesos
industriales.
Flujo metabólico
El flujo neto de una vía metabólica
está determinado por la velocidad a
la que los enzimas y transportadores
de la vía catalizan reacciones o
facilitan procesos de transporte.
 Pruebas bioquímicas
Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Este tipo de
pruebas son ampliamente utilizadas en microbiología para la
identificación y clasificación de microorganismos.
 Fundamento
E + S ↔ ES ↔ E + P
Deberá contener los siguientes componentes:

● Sustrato
● Enzima o vía metabólica
● Producto
● Revelador y/o indicador
 Clasificación

UNIVERSALES: se pueden realizar a cualquier muestra y orientan al

microbiólogo sobre los siguientes ensayos bioquímicos que deben
realizarse para obtener una identificación confiable.

Ejemplos:

● Prueba de la catalasa
● Prueba de la oxidasa
 Prueba de la catalasa
Demuestra la presencia de enzima
catalasa mediante la descomposición
del peróxido de hidrógeno en oxígeno
y agua.

2 H2O2 ⇋ 2 H2O + O2

Útil en la identificación de
Stapylococcus (+) y Streptococcus (-).
 Prueba de la oxidasa
Se usa para identificar microorganismos que contienen la enzima citocromo oxidasa.

Prueba (+): Ej. Géneros Neisseria y

Moraxella.

Prueba (-): Ej. Familia

Enterobacteriaceae
 Diferenciales
Se realizan para identificar los microorganismos presentes en la muestra hasta el nivel de
especie.

La identificación se hace con base en los resultados de una combinación de pruebas, ya

que los resultados individuales no son lo suficientemente informativos para hacer la
identificación.

Ejemplos:

● Pruebas IMViC
● Pruebas de utilización de azúcar
 Pruebas IMViC
Se emplean fundamentalmente para
la identificación de las
Enterobacterias.

Se compone de cuatro pruebas:

Indol, Rojo de metilo,
Voges-Proskauer y Citrato.

Su finalidad es identificar un
organismo del grupo de los
coliformes. La presencia de estos
indica contaminación fecal.
 Prueba de Indol
Prueba realizada en especies
bacterianas para determinar la
habilidad del organismo de romper
el indol del aminoácido triptófano.

Esta división molecular es lograda

por una serie de enzimas llamadas
triptofanasa.
 Prueba del rojo de metilo

Si el microorganismo consume el hidrato de carbono del medio (glucosa)

habrá producción de ácido, y ésto se pondrá de manifiesto mediante el
indicador Rojo de Metilo.
Prueba de Voges-Proskauer
Estudia la fermentación butanodiólica con
formación de un metabolito intermediario
neutro.
Técnica: Sembrar la muestra en el medio e
incubar de 24 a 48h a 37 °C. Según el
volumen del medio añadir a partes iguales
el volumen de los reactivos, agitar para
exponer el medio al O2. VP POSITIVO: Color
rojo-rojizo en menos de 1h. VP NEGATIVO:
Amarillo en superficie.
 Prueba del Citrato
Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer con citrato como
única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente de nitrógeno, provocando la
alcalinización del medio. El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio,
fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH.
 Prueba de la Ureasa
La ureasa hidroliza la urea en amoníaco,
agua y dióxido de carbono.

Se detecta el amoníaco a través del

aumento del pH del medio.

La prueba ayuda a identificar ciertas

especies de Proteus y otras bacterias
importantes como Corynebacterium
urealyticum y Helicobacter pylori.

Corynebacterium
Helicobacter pylori.
urealyticum
 Hidrólisis del Hipurato
Hipuricasa es una enzima que hidroliza el
hipurato para producir el aminoácido glicina.

Oxidación de glicina con reactivo ninhidrina

= color violeta oscuro.

Identificación de Streptococcus agalactiae,

Campylobacter jejuni y Listeria
monocytogenes

Streptococcus agalactiae Campylobacter jejuni

Pruebas para establecer la presencia de vías
metabólicas
Uso de un microorganismo y de un sustrato que es procesado a través de estas
vías .

Producto final determinado con sistema de comprobación

Tres tipos de pruebas:

● Pruebas con uso de azúcar

● Degradación de aminoácidos
● Uso de sustrato individual
 Pruebas de utilización de azúcar
Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o
fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de
ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol).

El metabolismo de un glúcido puede seguir la vía oxidativa o fermentativa. En vía

oxidativa el aceptor final de electrones debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso
es aerobio y produce poca acidez, mientras que en vía fermentativa el aceptor final de
electrones es un compuesto orgánico y el proceso es anaerobio, originando mucha
acidez en poco tiempo.

Vía
Vía oxidativa
fermentativa
 Degradación de aminoácidos
Descarboxilación de aminoácidos
La descarboxilación es un proceso anaerobio
que requiere un ambiente ácido.
Se usa la base de descarboxilasa de Moeller,
compuesta de Glc, el a.a de interés y un
indicador de pH.
Al descarboxilar el a.a el pH aumenta y el color
del indicador se vuelve violeta.
Prueba de la Fenilalanina desaminasa
Determina la capacidad de desaminar
Fenilalanina en ácido fenilpirúvico por la
actividad de la enzima fenilalanina desaminasa.
La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba
positiva) se manifiesta por la aparición de un
color verde oscuro.
Uso de un sustrato individual
Inoculación de microorganismos en un medio que contenga un solo nutriente.

Determinación del crecimiento empleando un indicador de pH para detectar productos

finales del metabolismo .

Ejemplo:

Prueba del malonato

Identificación de enterobacterias
Azul (+)
Verde y amarillo (-)
 Pruebas bioquímicas en la biotecnología
La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice
sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la
creación o modificación de productos o procesos para usos
específicos.
La bioquímica se encarga de estudiar la

composición química de los seres vivos. Se

focaliza principalmente en las proteínas, los

carbohidratos, los lípidos y los ácidos

nucleicos. Su interés está en los procesos

en los que participan estos compuestos.

Entre estos destacan el metabolismo, el

catabolismo (proceso de obtención de

energía) y el anabolismo (la generación de

biomoléculas propias).
Una aplicación de la bioquímica
en la biotecnología es que, las
pruebas bioquímicas nos
permiten identificar cepas
bacterianas así como sus
requerimientos metabólicos, esto
relacionado con la biotecnología
nos permite el desarrollo de
métodos de defensa ante el
peligro que puedan representar
estos microorganismos.
Probióticos
El consumo de bacterias lácticas permite el mantenimiento de
la microbiota intestinal. Alimentos complementados con estos
microorganismos ayudan a la buena digestión.

Además, las investigaciones en estos microorganismos

buscan aislar diferentes bacterias lácticas productoras de
biocinas de sustratos tales como materia fecal con el fin de
obtener microorganismos iniciadores que sean usados para
aumentar el periodo de utilidad del producto.
Biosensor para detectar Salmonella typhi
El biosensor se basa en mediciones
electroquímicas por medio de nanotubos de
carbono equipados con aptámeros.

Los aptámeros son fragmentos artificiales de ADN

o ARN que se adhieren específicamente a una
determinada molécula o célula.
 Usos de las pruebas bioquímicas
Diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas y su control epidemiológico

La identificación de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infección es uno de

los instrumentos principales del diagnóstico de enfermedades infecciosas.

El conocimiento de éste nos lleva a saber con lo que se enfrenta el paciente, y saber de
qué armas se dispone para ayudar a combatir la enfermedad. Por ejemplo, utilizando
antimicrobianos u otras terapias antiinfecciosas, y sobre todo procurando el menor
coste posible.

VS
Desarrollo de vacunas.

Durante la etapa de desarrollo y prueba de vacunas, es necesario identificar distintos

antígenos, estos pueden ser virus o bacterias debilitados. Estos tienen que ser
ampliamente estudiados, desde su composición interna y externa, hasta los procesos
metabólicos que estos lleven a cabo. Para dichos procesos se usan las pruebas
bioquímicas de identificación bacteriana o vírica. Des esta manera se garantiza que los
antígenos usados sean seguros para el ser humano.
Bibliografía
● Colaboradores de Wikipedia. (2020, 5 marzo). Metabolismo microbiano -
Wikipedia, la enciclopedia libre. Recuperado 6 marzo, 2020, de
https://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo_microbiano
● Cascante, M. C. Marta. (s.f.). Modelización de flujos metabólicos: la era de la
fluxómica | Revista de la Sociedad Española de Bioquímia y Biología Molecular
| SEEBM. Recuperado 6 marzo, 2020, de
https://www.sebbm.es/revista/articulo.php?id=45
● Colaboradores de Wikipedia. (2020b, 5 marzo). tecnología basada en la
biología. Recuperado 6 marzo, 2020, de
https://es.wikipedia.org/wiki/Biotecnolog%C3%ADa
● Forbes, Betty A.; Sahm, Daniel F. y Weissfeld, Alice S.; (2009); Diagnóstico
microbiológico; 12ª edición; Argentina; Editorial Médica Panamericana. Págs.
110-112
● S/A; (s.f.); Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias. Recuperado 6
de marzo, 2020 de:
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas_bioquimicas_de_identificacion_de_bacterias.pdf
● Alegria Coto, Jorge Roberto (7/03/2012); Importancia de la biotecnología
microbiana: Bioinformática; Universidad de El Salvador. Recuperado 6 de
marzo, 2020 de :
http://www.redicces.org.sv/jspui/bitstream/10972/2581/1/120307%20RA142%20UES%20Imp%20Biotec%20Microbiana_Bioinfo
rmatica.pdf
● SINC; (08/09/2009); Biosensor detecta Salmonella typhi en segundos.
Recuperado 6 de marzo, 2020 de:
https://higieneambiental.com/higiene-alimentaria/biosensor-detecta-salmonella-typhi-en-segundos