Los componentes del aparato de extracción de proteínas de Pseudomonas aeruginosa son

procesados por la prepilina peptidasa tipo IV.

RESUMEN En el patógeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa, mutantes en el gen de la

prepilina peptidasa (pilD) son pleiotrópicos, ya que no sólo no procesan el pilin, sino que
además se acumulan en el periplasma, en su forma madura, varios toxinas y enzimas
hidrolíticas que normalmente se exportan a el medio externo (excretado). Hemos sugerido
que este El defecto de excreción se debe a la falta de procesamiento dependiente de PilD. de
proteínas que comparten secuencias en común con la prepilina y que sean componentes de
una máquina de extracción de proteínas. En este trabajo reportamos el aislamiento y la
caracterización de mutantes de excreción inducida por transposones con fenotipos similar al
de un mutante de un gen pilD. Uso de oligonucleótidos sondas diseñadas para reconocer las
secuencias que codifican la de escisión de las prepilinas tipo IV, hemos aislado cuatro
relacionó genes con la supuesta división dependiente de PHD predicha sitio. Las mutaciones
específicas del sitio dentro de estos genes han mostrado que son necesarios para la excreción
de proteínas, y PilDdependent el tratamiento de al menos uno de los cuatro datos codificados
proteínas fue demostrada. La evidencia sugiere que similares los componentes juegan un
papel en la excreción de proteínas en una amplia variedad de Bacterias gramnegativas.
Translocación de una proteína a través del citoplasma bacteriano la membrana requiere su
interacción con el celular de exportación maquinaria. En los estudios genéticos y bioquímicos
(1, 2), la sec (o pro genes de Escherichia coli se ha demostrado que codifican proteínas que
facilitan esta translocación al interactuar con Secuencias de señales de los terminales N,
manteniendo los polipéptidos en un forma competente para la exportación durante la
translocación o el suministro de energía para el proceso de exportación. Excreción de
proteínas al exterior de Gram-negativo las bacterias requieren translocación a través de una
doble membrana barrera. La excreción por E. coli de hemolisina, una proteína sintetizado sin
una secuencia de líder N-terminal, requiere las funciones de al menos tres productos génicos,
HlyB, HlyD, y TolC (3, 4). Un número de otras proteínas bacterianas aparecen para ser
excretado por un mecanismo similar, incluyendo el adenilato ciclasa de Bordetella pertussis
(5, 6) y las metaloproteasas de Erwinia chrysanthemi (7). En contraste, la pullulanasa de
Klebsiella oxytoca se sintetiza con un típico N-terminal secuencia líder y requiere 13
productos génicos (PulC-O) para la excreción (8). Pseudomonas aeruginosa, un patógeno
oportunista, excreta un número de enzimas que son importantes para la virulencia. Varios
laboratorios han aislado y caracterizado a los mutantes que son defectuosos en la excreción
de proteínas (9-12). Tenemos ha demostrado previamente que uno de estos mutantes, en el gen
pilD, es defectuoso en el procesamiento de las prepilinas de tipo IV y la producto de este gen
es la prepilina líder peptidasa (13, 14). Las inserciones de transposiciones en el pilD conducen
a una acumulación de proteínas normalmente excretadas en el espacio periplásmico de las
organismo (12). Para explicar el papel del gen pilD en la excreción de proteínas, hemos
propuesto que la la maquinaria de excreción contiene componentes que dependen en la
prepilina peptidasa para su escote. Aquí tenemos de la identificación y caracterización de
cuatro especies de genes vinculados que codifican dichas proteínas.*

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. Cepa de E. coli DH5a (hsdR
recA lacZYA 480dlacZAM15) se utilizó como un anfitrión de todos los experimentos de
clonación. La construcción de P. aeruginosa pilD mutantes B30 y 2B18 y pilA mutante NP ha
sido descrito (13, 15). Las culturas se cultivaban rutinariamente en caldo de Luria (16) o sales A
mínimas (17) complementadas con 50 mM de glutamato monosódico y 1% (vol/vol) de glicerol.
Manipulaciones, secuenciación y análisis de ADN. plásmido ADN de E. coli (18) y ADN
cromosómico de P. aeruginosa (19) se purificaron según lo descrito. Gel de agarosa
electroforesis y purificación del ADN por electroelución (20), Las hibridaciones de manchas de
ADN (21) y la secuenciación de ADN (13) fueron hecho como se describe. Construcciones de
plásmidos. El vehículo de entrega de transposones pRK2013::TnSG se construyó de la siguiente
manera. plásmido ColEl::TnS (proporcionado por M. Yanofsky, Universidad de Washington) fue
digerido con Bgl II y el fragmento central de TnS, codificando la resistencia a la kanamicina,
reemplazada por la ligadura a un cartucho de resistencia a la gentamicina BamHI de pPC110
(incluido en el volumen de suministro) por P. Christie, Universidad de Washington). Esta
construcción fue digerido con EcoRI y usado para reemplazar el Secuencias de ColEl del
pRK2013 (22) digerido por EcoRI, resultando en el plásmido pRK2013::TnSG. Un plásmido para
sobreexpresar la P. aeruginosa fosfolipasa C se construyó de la siguiente manera. La base de 4
kilobase (kb) Sma El fragmento I-BamHI de pSL2 (23) fue clonado en el Sma I-BamHI sitio de la
pUC18 (24). El fragmento clonado fue extirpado como un fragmento de EcoRI-HindIII y ligado
en pMMB66EH (25) digerido por EcoRI/HindIII, lo que da como resultado un plásmido pMMSL2.
El fragmento EcoRI de 9,2 kb que contiene la inserción de la Tn5G T9 y secuencias
cromosómicas laterales fue clonada por digiriendo el ADN cromosómico de este mutante con
EcoRI. El fue ligado en el sitio de EcoRI de la pUC13Cm, y E. coli DH5a resistente a la
gentamicina y al cloranfenicol se seleccionaron transformadores. Tres sondas de
oligonucleótidos degenerados fueron diseñadas para reconocer la secuencia que codifica la
división de consenso de PilD sitio, Gly-Phe-Thr-Leu-(Leu/Ile)-Glu, que fue determinado para ser
compartido por los pilotes tipo IV, PulG-J de K. oxytoca, y tres proteínas ComG deBacillus
subtilis (14, 26, 27). Los tres oligonucleótidos[no. 1, GG(C/T)TT(C/T)- ACCCTG(C/G/T/A)T(C/G)GA;
nº 2, GG(C/T)TT(C/T)-C ACCCTC(C/G/T/A)T(C/G)GA; no. 3, GG(C/T)TT(C/T)-
ACCTTG(C/G/T/A)T(C/G)GA] se sintetizaron en un informe de investigación biológica. modelo
8600 sintetizador de ADN.
Un plásmido que contiene la secuencia del gen pddC clonado en el pDN18 (13) se construyó de
la siguiente manera. El Xho de 1.2-kb Mi fragmento fue clonado en Sal I digerido M13mpl9 (24),
y uracilo que contenía ADN de una sola cadena. Un mutagénico oligonucleótido se utilizó para
introducir un ribosomebinding y EcoRV antes de la iniciación del codón de pddC. Se preparó
ADN de doble cadena, digerido con EcoRV y Xba I, y religioso después de que el final de Xba I
se llenó en. El plásmido religioso fue digerido con EcoRI y HindIII, y el fragmento que contenía
pddC fue ligado a EcoRI/HindIII digerido pDN18, resultando en pDN18pddC. El plásmido
expresor de polimerasa del ARN T7, pMMBT7, fue construido ligando un fragmento de EcoRI-
HindIII de la forma replicativa de M13mpGP1-2 (proporcionada por S. Tabor, Harvard Medical
School), que contiene el gen del ARN T7 polimerasa, en pMMB66EH digerido por EcoRI/HindIII.
El plásmido pUC7G se construyó mediante la purificación en gel del Cassette de 1,8 kb de
resistencia a la gentamicina digerido por BamHI pPC110. Los extremos del fragmento
purificado fueron rellenados con el Fragmento de Klenow de ADN polimerasa, enlaces Pst I
(Promega), y el fragmento fue clonado en el Primer sitio de la pUC7 (24). Un fragmento de 2,1
kb que contiene secuencias que codifican PddA-D fue generado por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (28) utilizando los dos cebadores resaltados en la Fig. 3. El 5' primer fue
sintetizado con una extensión que contenía un EcoRI, y la cartilla de 3' fue sintetizada con un
que contiene un sitio Xba I. El producto de PCR fue amplificado a partir del fragmento EcoRI de
9,2 kb que contiene el T9 inserción. El producto PCR de 2,1 kb fue digerido con EcoRI y Xba I y
ligado a EcoRI/Xba I-digerido pDN18, a dé pDN18PCR. Generación de Mutantes de Excreción de
Proteínas de P. aeruginosa. A biblioteca aleatoria de inserciones de transposón TnSG en el
cromosoma de P. aeruginosa fue generado por la conjugación de E. coli DH5a que contiene el
plásmido suicida pRK2013: :TnSG con la cepa PAK-NP de P. aeruginosa. Aproximadamente
70.000 se obtuvieron exconjugantes resistentes a la gentamicina. Mutantes de inserción
definidos de P. aeruginosa PAK (PAKXG1, -XG2, y -XG9, Fig. 1A) se generaron de la siguiente
manera. El fragmento EcoRI-BamHI de 7.2 kb fue subclonado en pBR322 (29) y esta
construcción fue parcialmente digerida con A Ikb
EcoRI
X~hoI BamHI
XhoI XhoI
PstlI PstI PstI
T9T4
Sal
T2 TI 2XGgTT24TIO
SalI XGI XG2
B
Xho I Los fragmentos linealizados fueron purificados por electroelución y ligado a un cassette
resistente a la gentamicina purificado de un resumen de Sal I de PUC7G. Se seleccionaron
clones que contenían plásmidos con una sola inserción en cualquiera de los dos sitios de Xho I
(pXG1 y pXG2) o un borrado y reemplazo con la opción cartucho del gen de resistencia a la
gentamicina del fragmento Xho I de 1,2 kb entre los dos sitios (pXG9). Las tres construcciones
se movilizaron individualmente en el PAK y, por un solo paso procedimiento de reemplazo
genético (13), el correspondiente se introdujeron las inserciones (XG1 y XG2) y la supresión
(XG9) en el cromosoma.

T7 Experimentos de Expresión. Un ARN T7 de amplio rango polimerasa/promotor del sistema

de expresión génica se utilizó para expresar las proteínas codificadas por el pDN18-PddC en
una forma salvaje. y mutante de P. aeruginosa PAK. El procedimiento utilizado fue una
modificación de la descrita originalmente por Tabor y Richardson (30). Células que contienen
pDN18 y pMMBT7 o pDN18PddC y pMMBT7 se cultivaron en un medio mínimo. A complementado
con 50 mM de glutamato monosódico, 1%. (vol/vol) glicerol y una mezcla de aminoácidos sin
metionina y cisteína. Isopropil f8-D-tiogalactopiranosido se agregó a los cultivos en
crecimiento para inducir 17 RNA expresión de la polimerasa a partir de pMMBT7 y, tras la
adición de rifampicina, las proteínas fueron etiquetadas con[35S]metionina y[35S]cisteína
(Trans35S-label; ICN). RESULTADOS Aislamiento de P. aeruginosa Protein-Excretion Mutants.
Mutantes resultantes de la inserción de transposones en los genes que codifican componentes
de un aparato de excreción procesados por el la prepilina peptidasa no debería poder
excretar la exotoxina A, elastasa, fosfatasa alcalina y fosfolipasa C, que muestra un fenotipo
similar al del mutante pilD (12). Para probar esta hipótesis, una biblioteca aleatoria de
transposones cromosómicos Las inserciones de TnSG se generaron en P. aeruginosa PAKNP, un
mutante no afiliado a PAK. Para facilitar el aislamiento de mutantes de excreción solamente, y
no mutantes en estructuras o genes reguladores, pMMSL2, un plásmido que sobreexpresa el
fosfolipasa hemolítica C, se introdujo en el P. biblioteca de mutantes de aeruginosa TnSG.
Colonias no hemolíticas fueron identificados después del recubrimiento de los exconjugantes
en bloodagar platos. Se identificaron 21 clones que fueron reproduciblemente no hemolítica.
Para mapear los sitios de las inserciones, el ADN cromosómico fue
preparado a partir de cada uno de los mutantes y restringido con BamHI
o EcoRL. Los digeridos individuales se separaron en agarosa
geles, secados a nitrocelulosa, y probados con radiomarcados
pRK2013::ADN de TnSG. Los 21 mutantes contenían transposones
en un fragmento común de EcoRI de 9,2 kb. Además
el mapeo de restricciones y los análisis de hibridación mostraron que
6 transposiciones independientes (T9, T4, T2, T1, T24,
y T10) se representaron y abarcaron una región de -6,5 kb
dentro del fragmento EcoRI de 9,2 kb. La ubicación de las inserciones
y un mapa de restricciones del fragmento EcoRI de 9,2 kb son
que se muestra en la Fig. 1A.
Cuatro de los mutantes de inserción (T1, T2, T9 y T10) fueron
se caracterizan por su capacidad de excretar fosfatasa alcalina,
fosfolipasa C, y exotoxina A. Para los dos primeros,
se cultivaron cultivos de cada mutante, se cosecharon células,
y la actividad enzimática de estas proteínas fue ensayada en
las fracciones extracelulares y asociadas a las células. Tabla 1, experimento
A, muestra que los mutantes de inserción son deficientes en
la excreción de estas dos proteínas.
Para la exotoxina A, el plásmido sobreexpresor de exotoxina A
pMMD4 (12) fue introducido en cada uno de los cuatro mutantes por
y los cultivos resultantes fueron inducidos con
isopropil P-D-tiogalactopiranosido y fraccionado (Fig.
2). La localización de la exotoxina A se determinó por
análisis de fracciones por inmunotransferencia con exotoxina A específica
antisueros. A diferencia de la PAK de tipo salvaje, la exotoxina A sintetizada
por la mutante T9, así como T1, T2 y T10, fue encontrada
exclusivamente en la fracción periplásmica. Por lo tanto, con respecto a la
excreción de proteínas, los mutantes de transposón tienen la misma
como el mutante de pilD.
Aislamiento y caracterización de secuencias que codifican PilDDependent
Proteínas. Identificar los genes que codifican la propuesta
Proteínas blanqueables de PilD, tres oligonucleótidos degenerados.
fueron diseñados para reconocer secuencias de ADN que codifican la
Región de consenso de los terminales N compartida por los pilins de tipo IV y
varias otras proteínas necesarias para el transporte macromolecular
(14). Cada uno de los oligonucleótidos estaba etiquetado con
y-32P]ATP y usado para sondear una mancha de restricción sureña
digeridos del fragmento de EcoRI clonado de 9.2-kb que contiene el T9
inserción y secuencias de flanqueo. Los fragmentos de restricción
representado en la Fig. 1B hibridado a la sonda de oligonucleótido 1.
Las sondas 2 y 3 dieron patrones similares de hibridación. Hibridación
a los diversos compendios de restricciones sugirió que
una o más secuencias homólogas del oligonucleótido
se localizaron en el fragmento de Xho I de 1,2 kb.
La secuencia de ADN del fragmento de Xho I de 1,2 kb y
se determinaron las regiones río arriba y río abajo (Fig. 3).
Cuatro marcos de lectura abiertos, codificando proteínas con las predicciones
sitio de clivaje de consenso, fueron designados pdd (pilDdependent)
y potencialmente codificar proteínas con tamaños de 15.4
(PddA), 18,2 (PddB), 14,4 (PddC) y 24,5 (PddD) kDa.
Expresión y división de las proteínas de excreción. Para demostrar
que el escisión de las proteínas recientemente identificadas es dependiente
sobre la expresión del producto del gen pilD, un
T7 RNA polimerasa/promotor del sistema se utilizó para expresar
PddC in vivo. Plasmido pDN18pddC (ver Materiales y Métodos
para la construcción) se conjugó en PAK de tipo salvaje y
el mutante pilD 2B18 y, tras la inducción del ARN T7
polimerasa, las proteínas se expresaron selectivamente a partir de
el ADN clonado y radiomarcado.
La división de la PddC (y la de la prepilina) requiere la PilD
prepilina peptidasa, ya que la cepa mutante pilD produjo una
forma más grande de la proteína (Fig. 4). Intentos similares de expresar
niveles detectables de PddA, -B y -D no tuvieron éxito.
Generación de mutaciones definidas en la proteína de excreción
Genes. Para asegurar que el defecto de excreción del transposón
mutantes se debió a la inactivación de los genes de la pdd.
mutantes se generaron en las secuencias del gen pdd en un
cepa silvestre. Las mutantes XG1 y XG2 contienen inserciones de
Tabla 1. Fenotipos y complementación de
excreción - mutantes defectuosos
Alcalino
fosfatasa Fosfolipasa C
Célula extra, célula extra, célula extra.
Cepa* celular asociada a la célula asociada a la célula asociada a la cepa
Experimento A
Wt PAK 2010 197 27,7 6,0
PILD B30 17 5036 0,4 84,2
T9 22 6842 0.7 124.6
T2 22 6431 0.3 107.6
Ti 20 6548 0,4 105,6
T10 19 5733 1.6 102.4
Experimento B
XG1 19 5838 2,4 91,6
XG2 20 5376 1,8 93,3
XG9 20 4926 0,6 95,3
Experimento C
Peso PAK(pDN18) 957 111 10,7 1,0
Wt PAK(pDN-PCR) 671 227 7,2 1,8
XG9(pDN18) 4 2811 0,1 39,8
XG9(pDN-PCR) 336 1433 4,7 10,3
Las unidades de fosfatasa alcalina son las definidas por Brickman y Beckwith (31). Las unidades
de fosfolipasa C son las definidas por Berka et al. al. (32), multiplicado por 10. *Wt, tipo
salvaje. un casete de codificación resistente a la gentamicina en la codificación de pddA y
pddD, respectivamente (Figs. 1 y 3). Mutante XG9 tiene una eliminación de las secuencias entre
el Xho I y la sustitución con el cartucho de gentamicina, resultando en una pérdida de la
secuencia de 3' de pddA, todos los pddB y -C y la secuencia de 5' de pddD
Complementación de Mutantes. Para proporcionar más pruebas
para el requerimiento de las proteínas Pdd para la excreción, complementación experimentos
con cepas defectuosas de excreción se llevaron a cabo. Un fragmento de ADN de 2,1 kb que
contiene sólo secuencias que codifican PddA-D fue generada por la PCR y subclonado en
pDN18, resultando en pDN18- PCR. Los plásmidos pDN18 y pDN18-PCR fueron introducidos por
conjugación en la mutante de borrado XG9, mutantes de transposón T9 y T10, el mutante pilD
B30 y el PAK salvaje. Cada se probó la capacidad de excretar fosfatasa alcalina y fosfolipasa C
(Tabla 1, experimento C). La introducción de las secuencias que codifican la excreción
restaurada de PddA-D (aunque de forma incompleta) hasta la supresión del mutante XG9.
Plasmido pDN18- La PCR no restauró la excreción del mutante o transposón en elpilD mutantes
T9 o T10, ya que el producto PCR no contenía secuencias afectadas en estos mutantes (datos no
mostrados). Estos los resultados demuestran que al menos uno de los genes pdd (pddD) es
esencial para la excreción de proteínas y que el gen descendente no se ve afectada en el
mutante XG9. DISCUSIÓN Anteriormente propusimos que uno o más componentes de la la
maquinaria de excreción de proteínas de P. aeruginosa se dividen por la PilD prepilin
peptidasa (12, 14). Esta conclusión fue basado en el defecto de exportación pleiotrópico de los
mutantes en la PVD y las similitudes de la pilina tipo IV con las proteínas requerido para la
excreción de pullulanasa por K. oxytoca (PulG-J) y captación de ADN por B. subtilis (ComG open
marcos de lectura 3-6) (14, 26). En este estudio hemos aislado varios mutantes defectuosos de
la excreción y oligonucleótidos usados sondas para identificar los genes de cuatro proteínas
que se requieren para la excreción de proteínas. Estas proteínas, PddA-D, comparten al menos
sintetizadas con una secuencia líder corta y básica que precede al sitio de clivaje predicho
dependiente de PilD (Fig. 5). Además, los 16-20 residuos que siguen muestran la pronunciada
hidrofobia que se ve en la subunidad de pilin tipo IV. Hemos demostrado que el procesamiento
de al menos una de las proteínas (PddC) requiere el producto del gen pilD. Este resultado
sugiere fuertemente que la excreción previamente reportada el defecto de la mutante pilD se
debe a la incapacidad de los mutante para procesar las formas precursoras de la PddA-D,
impidiendo que se localicen y/o ensamblen correctamente en un aparato de extracción de
proteínas. Es probable que, como el pilin monómero, estas proteínas se encuentran en la
célula bacteriana antes de su escisión y ensamblaje, así como la el carácter hidrofóbico de los
N termini conservados actúa como un señal de localización de membrana (34). El N-terminal
hidrofóbico región de pilin maduro también ha sido implicada en la interacciones subunidad-
subunidad durante el ensamblaje del pilus (35). Del mismo modo, la región hidrofóbica de las
proteínas PddA-D puede juegan un papel en su ensamblaje en una estructura macromolecular
esencial para la excreción de proteínas. El ensamblaje de tal estructura requerirá, sin duda,
las funciones de proteínas. Análisis preliminar de la secuencia de ADN de la región aguas
arriba de los genes pdd ha mostrado la presencia de dos marcos de lectura abiertos que
codifican las proteínas con una cantidad significativa de información general homologías a la
biogénesis de pilus descrita anteriormente PilB y PilC (13), lo que sugiere que los homólogos
de PilB y PilC son necesarios para el montaje de una excreción. aparatos que contengan PddA-
D. Los mutantes de extracción de proteínas aislados en este estudio todos resultado de
inserciones de transposones dentro de una región de 6,2 kb de el cromosoma P. aeruginosa.
Este tamaño sugiere que se requieren productos génicos adicionales en esa región para
excreción de proteínas. La agrupación recuerda a la de los 13 genes necesarios para la
excreción de la pullulanasa por K. oxytoca (8). Dos genes de este grupo, pulE y pulF, se
localizan inmediatamente aguas arriba de los genes pulG-J y codifican las proteínas que
muestran una homología significativa con el PilB (39% de identidad) y PilC (30% de identidad),
respectivamente. Estas observaciones sugieren que la expresión, el escote y el ensamblaje de
la forma de pilín proteínas en un aparato de excreción propuesto requiere el funciones de un
gran número de productos génicos accesorios (en K. oxytoca, PulE, -F, -G, -H, -I, -J y -0; en P.
aeruginosa, Homólogos de PilB y PilC, PilD y PddA-D). El efecto principal de las mutaciones en
los genes pdd es un defecto de exportación que da lugar a la acumulación periplásmica de
proteínas que normalmente se excretan. Las proteínas acumuladas parecen ser procesados
correctamente por la señal peptidasa I y están completamente plegadas, lo que sugiere que la
P. aeruginosa funciones del aparato de excreción para facilitar la excreción de proteínas
después de haber sido translocadas a través del citoplasma a través de la vía de exportación
primaria. Las proteínas PddA-D de P. aeruginosa podrían jugar un papel importante en el
desarrollo de la enfermedad. función estructural en un aparato de extracción de proteínas al
servir para puentear las membranas internas y externas, creando una adhesión de Bayer (36),
que anteriormente han sido implicados en la excreción de proteínas (37). Alternativamente,
estos las proteínas pueden jugar un papel más activo en la excreción al servir como un
conducto, generado por la polimerización continua de los subunidades, a través de las cuales
o sobre las cuales las proteínas excretadas son transportado fuera de la celda. Porque la
energía es muy probable requerido para el proceso de excreción, este modelo permitiría
Acoplamiento físico de un protonotivo interno derivado de la membrana. fuerza a la
excreción al proporcionar energía para conducir polimerización de las proteínas PddA-D del
citoplasma membrana. Obviamente para que este proceso ocurra y sea continua, la
despolimerización de la proteína PddA-D subunidades es esencial. Se puede proporcionar
apoyo para este modelo por la aparente capacidad de la subunidad de P. aeruginosa pilin para
polimerizar en un pilus maduro y despolimerizar durante el curso de la retracción del píldora
(38).