UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANALISIS

ESCUELA DE BIOANALISIS
ASIGNATURA: BIOTECNOLOGIA

ANTIC
UERP
OS
MON
OCLO
INTEGRANTES:
NALES
Ana García C.I. 19631606
Carla Finol C.I. 20938561
Zirley

MERIDA, ENERO 2014

Índice
GENERALIDADES................................................................................................................................4
ANTICUERPO MONOCLONAL.........................................................................................................5
HIBRIDOMA....................................................................................................................................5
ENZIMA HGPRT..............................................................................................................................5
ENZIMA TK.....................................................................................................................................5
MEDIO HAT....................................................................................................................................5
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ORIGEN MÚRIDO (DE RATONES)..................6
INMUNIZACIÓN..............................................................................................................................6
FUSIÓN...........................................................................................................................................7
SELECCIÓN......................................................................................................................................7
EVALUACIÓN DE LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO.....................................................................8
CLONAMIENTO...............................................................................................................................9
ESCALAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES...................................9
CONCLUSION....................................................................................................................................11
BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................................12
Grande, L. (1999). El Sueño de lo Posible: Bioética y Terapia Génica. Madrid: Universidad Pontifica
Comillas............................................................................................................................................12
 INTRODUCCION

El descubrimiento y caracterización de los anticuerpos tiene una larga historia, que

es la de la propia inmunología, y se remonta a finales del siglo XIX. En esa época,
los microbiólogos estudiaban los mecanismos de defensa del organismo contra los
agentes microbianos, en particular contra las toxinas bacterianas. Von Behring y
Kitasato sentaron en los años noventa del siglo xix las bases de la inmunidad
humoral al descubrir que el suero producía sustancias que antagonizaban toxinas
como la diftérica o la tetánica. Ehrlich, a finales de siglo, consolidó la idea de que
las toxinas generaban antitoxinas séricas que se comportaban según las leyes de
la química; las células de la sangre eran capaces de producir unas cadenas
laterales que reaccionaban frente a las toxinas de manera específica como una
llave con su cerradura. Por las distintas propiedades de reaccionar las antitoxinas
se denominaban de varias maneras: aglutininas, opsoninas, etc. (Garcia, 2011).

En los años treinta del siglo xx Landsteiner, el descubridor del sistema ABO,
identifica todas esas funciones y las centra en una sola molécula, los anticuerpos,
y al tiempo va sustituyéndose el nombre de toxina por el de antígeno. Años más
tarde, este mismo autor, junto con Pauling, desarrolla la teoría instruccionista de
formación de los anticuerpos, según la cual los antígenos determinarían la
conformación de los anticuerpos acomodándola a su estructura. A finales de los
cuarenta se descubre el origen celular de los anticuerpos en las células B y
plasmáticas. Años más tarde se describen las cadenas ligeras y se identifican las
inmunoglobulinas A, D y E (García, 2011).

Actualmente después de muchos avances científicos existen los anticuerpos

monoclonales que son una poderosa herramienta para el diagnóstico de
laboratorio y un instrumento cada vez más utilizado en el tratamiento de diversas
enfermedades, los cuales se definirán durante el desarrollo de este trabajo.
 GENERALIDADES

ANTICUERPO
Son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma
soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de
una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados
por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales
como bacterias, virus o parásitos (Figura 1).

En esencia, las moléculas de anticuerpos llevan a cabo dos funciones principales

en la defensa inmunitaria. La primera es reconocer y unirse al material extraño (el
antígeno). Esto significa la unión a estructuras moleculares en la superficie del
material extraño (determinantes antigénicos) que difieren de las estructuras
moleculares elaboradas por las células del huésped. Esos determinantes
antigénicos suelen expresarse en copias múltiples sobre el material extraño, por
ejemplo, proteínas o hidratos de carbono de la superficie de la célula bacteriana o
en las espículas de la envoltura sobre la superficie de un virus. Los anticuerpos del
huésped pueden reconocer una variedad grande de estructuras diferentes: el ser
humano es capaz de producir anticuerpos contra miles de millones de estructuras
moleculares distintas. Esto se describe como diversidad del anticuerpo y es
necesario para responder a la enorme diversidad de estructuras moleculares
asociadas con patógenos (a menudo con alto poder de mutación). (Delves, Martin,
Burton y Roitt, 2008).

El simple acto de unión del anticuerpo puede ser suficiente para inactivar a un
patógeno o mantener inocua a una toxina. Por ejemplo, el anticuerpo que recubre
un virus puede impedir que este ingrese en las células diana y “neutralizar”, por
consiguiente, el virus. Sin embargo, en muchos casos se despliega una segunda
función de la molécula de anticuerpo para activar la eliminación del material
extraño. En términos moleculares, esto implica la unión de ciertas moléculas
(moléculas efectoras) al material extraño recubierto por anticuerpos para activar
los mecanismos complejos de eliminación, por ejemplo, el sistema de proteínas
del complemento o la fagocitosis por las células del sistema inmunitario del
huésped, como neutrófilos y macrófagos. Los sistemas efectores poderosos son
generalmente activados solo por moléculas de anticuerpos agrupadas sobre la
superficie celular extraña y no por el anticuerpo libre no unido al ligando. Esto es
crucial si se consideran las concentraciones típicamente elevadas de anticuerpos
séricos. (Delves, Martin, Burton y Roitt, 2008).
ANTICUERPO MONOCLONAL
Se denomina anticuerpo monoclonal al producido mediante el cultivo de un solo
tipo o clon de células hibridas (hibridoma), entre células capaces de producir
anticuerpos y células de mieloma; por tanto, está constituido por moléculas de una
sola especie de inmunoglobulina que provienen de un único clon (S.E.C.H., 1999).

Este clon de “linfocitos B” fabrica anticuerpos idénticos y específicos para un

antígeno. Con esto se consigue producir anticuerpos monoclonales, muy útiles y
utilizados en biomedicina y en biología molecular. En medicina se utilizan, por
ejemplo, para detectar la presencia y cantidad de una sustancia en la sangre
(S.E.C.H., 1999).

HIBRIDOMA
Un hibridoma es una célula híbrida (quimera) producto de la fusión de una célula
mieloma (un tumor que produce anticuerpos) y una célula plasmática. Cada clon
de hibridomas produce un tipo de anticuerpo de la célula plasmática: un anticuerpo
monoclonal. (Grande, 1999).

ENZIMA HGPRT
La Hipoxantina Guanina Fosforibosil Transferasa es una enzima codificada en
humanos por el gen HPRT1.
HGPRT es una transferasa que juega un papel central en la generación de
nucleótidos de purina a través de la vía de recuperación de purina.
Las células B contienen esta enzima, lo que les permite sobrevivir cuando se
fusionan con las células de mieloma cuando se cultivan en un medio HAT para
producir anticuerpos monoclonales (García, 2011).

ENZIMA TK
La Timidina Quinasa es una enzima que permite a una célula utilizar una vía
metabólica alternativa para incorporar timidina en el ADN. Se utiliza como
marcador seleccionable para identificar las células eucarióticas transfectadas
(García, 2011).

MEDIO HAT
Es un medio de cultivo especial que contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina,
que se utiliza para seleccionar las células hibridas durante el proceso de
anticuerpos monoclonales destruyendo las células de mieloma deficientes de TK
(Timidina Quinasa) o aquellas deficientes de HGPRT (Hipoxantina Guanina
Fosforibosil Transferasa).

Las células de mioloma carecen de la enzima HGPRT o de TK durante este

proceso y a raíz de ello se cultivan en este medio pues estas enzimas sintetizan
purinas utilizando como fuente precursora a la hipoxantina. La ausencia de estas
enzimas no perjudica el crecimiento de estas células de mieloma ya que en
ausencia de la enzima utilizan un camino metabólico alternativo para sintetizar
purinas. Sin embargo, la presencia de aminopterina en el medio HAT anula la
posibilidad de sobrevida y hay una total dependencia del compuesto (HGPRT o
TK) (García, 2011).

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ORIGEN MÚRIDO

(DE RATONES)

INMUNIZACIÓN
En teoría, es factible producir anticuerpos monoclonales específicos para cualquier
antígeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la inmunización es
conveniente el uso de preparaciones puras de antígeno en las cuales el peligro de
competencia antigénica, que pudiese desviar la respuesta inmune humoral hacia
una molécula irrelevante, no existe. Pero en muchos casos el antígeno de interés
se encuentra en una molécula de la superficie celular difícil de aislar, lo que obliga
a la utilización de células Completas o extractos de membranas para la
inmunización. En otros casos, por ejemplo cuando se trata de drogas o moléculas
pequeñas, éstas deben ser conjugadas a portadores, y son estos conjugados las
preparaciones usadas para la inmunización (Montaño y Romano, 1995).

A menos que se trate de moléculas poco inmunogénicas, la inmunización se

realiza rutinariamente mediante la inyección del antígeno por vía subcutánea o
intraperitoneal y en la forma de una emulsión. Ello permite la liberación lenta y
constante del antígeno, asegurando una estimulación permanente. Esta
inmunización se efectúa en múltiples ocasiones, normalmente en intervalos de dos
semanas, para asegurar una buena estimulación y amplificación de los clones de
linfocitos B específicos para el antígeno de interés. La última estimulación
usualmente se hace tres días antes de la fusión y por vía intravenosa para así
obtener, en el bazo del animal inmunizado, una máxima respuesta y una población
de células respondientes en fase de división (Montaño y Romano, 1995).
FUSIÓN
Luego de culminado el protocolo de inmunización y que se tiene la certeza de que
el mismo ha sido efectivo, el animal experimental es sacrificado y se le extrae el
bazo. Los linfocitos B, bien como parte del total de la suspensión de células
esplénicas o previamente purificadas, se mezclan con un número apropiado de
células de mieloma que se mantienen creciendo exponencialmente in vitro. Lo que
sigue a continuación es el proceso de fusión en sí, el cual debe realizarse a 37º y
consiste en añadir a la mezcla de células un pequeño volumen de un agente
fusógeno denominado polietilenglicol (PEG), mezclando suavemente por espacio
de uno a tres minutos. En estas condiciones, las membranas de algunas de las
células se fusionan, uniéndose los citoplasmas y formándose los hibridomas. El
PEG luego se elimina por lavado y las células fusionadas se siembran en
microplacas de cultivo (Montaño y Romano, 1995).

El proceso de fusión es muy ineficiente: en general, menos del 1% de las células

terminan fusionándose. Esto trae como consecuencia que se requiera de un
número de células relativamente alto para el proceso de fusión (un bazo de ratón
contiene del orden de 101 células). En algunas circunstancias es posible
enriquecer la población de linfocitos B específicos para el antígeno, lo cual se
logra asociando el antígeno a una fase sólida y utilizando procedimientos de
aislamiento como separación inmunomagnética o roseteo con glóbulos rojos
recubiertos con el antígeno de interés. De tenerse el equipo necesario, en los
casos en los que se dispone de pocas células, es preferible realizar la fusión
mediante el proceso denominado electrofusión, el cual resulta mucho más
eficiente (Montaño y Romano, 1995).

SELECCIÓN
Dado que la fusión es un evento completamente al azar, la mezcla de células
obtenidas luego de la misma estará formada por esplenocitos, células de mieloma,
esplenocitos fusionados entre sí, células de mieloma fusionadas entre sí y además
por los hibridomas linfocito B-célula de mieloma. En cultivo, los esplenocitos no
fusionados mueren con el tiempo por ser células normales. Sin embargo, las
mielomatosas al ser células tumorales pueden vivir indefinidamente y como se
replican con mayor rapidez que los hibridomas, crecerían en forma predominante,
"ahogando" al resto de las células (Montaño y Romano, 1995).

De lo anterior se desprende la necesidad de disponer de un mecanismo de

selección que permita solamente el crecimiento de los hibridomas, eliminando a
las células mielomatosas. Esto se obtiene con el llamado medio HAT y el
fundamento en que se basa es el siguiente: Las células eucariotas disponen de
dos vías para la síntesis del ADN. Una es la llamada "vía principal o de novo" y la
otra es la "vía de rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantina-guanina-
fosforibosil-transferasa (HGPRT). La clave de la selección está en que las células
de mieloma que se utilizan para la fusión son deficientes en la enzima HGPRT, es
decir, que sintetizan su ADN únicamente por la vía principal. Esta vía principal
puede ser bloqueada por la adición de la droga aminopterina. De manera que, si al
medio de cultivo en el que crece el producto de fusión se añade aminopterina, las
células mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre sí morirán, ya que serán
incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las células híbridas, éstas
tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las células mielomatosas,
pero también tienen el gen que codifica la enzima HGPRT, heredado de los
linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la vía de rescate. De esta forma,
en presencia de Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT) las únicas células con
capacidad de crecimiento, "seleccionadas" gracias a un fenómeno de
complementación génica, son las híbridas (Montaño y Romano, 1995).

Existe aún otro evento de selección, el cual está destinado a identificar y aislar, del
total de híbridos producidos, a los hibridomas productores de los anticuerpos de
interés. La identificación se logra con un método apropiado para la evaluación de
los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se realiza mediante el clonamiento
(Montaño y Romano, 1995).

EVALUACIÓN DE LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO

Luego de unos siete a diez días post-fusión, en cada pozo de cultivo habrá varios
híbridos creciendo, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y será necesario
aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para determinar en
cuáles cultivos se encuentran los anticuerpos con la especificidad deseada, y por
ende las células productoras de los mismos, se realizan ensayos de evaluación o
"screening" en los sobrenadantes de cultivo. La forma que toman estos ensayos
de identificación es variada y depende en buena medida del antígeno emulado.
Las más usadas son pruebas tipo ELISA, "dot-blot" o radioinmunoensayo cuando
se trata de antígenos solubles, y pruebas de inmunofluorescencia,
inmunohistoquímica o de aglutinación si el antígeno está asociado a la membrana
celular. En todo caso, embarcarse en la tarea de producir anticuerpos
monoclonales de una especificidad dada sin antes tener un procedimiento de
prueba o screening para dicho anticuerpo que sea rápido, sencillo, específico,
sensible y aplicable a un número elevado de muestras, es una tarea destinada al
fracaso (Montaño y Romano, 1995).
CLONAMIENTO
Para obtener una preparación monoclonal de anticuerpos, es necesario aislar
clones de células, en los que cada una es réplica exacta de la otra. El
procedimiento mediante el cual se obtienen muchas células idénticas por
replicación a partir de una sola se denomina clonamiento. El método más común
consiste en sembrar suspensiones celulares a gran dilución de manera que en un
volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a, es que las células no
crecen bien cuando están aisladas. La manera usual de resolver este problema es
utilizar células nodrizas, generalmente fibroblastos o macrófagos, que proveen la
ayuda necesaria para el crecimiento a baja densidad. Otro procedimiento menos
empleado para el aislamiento de los hibridomas es la siembra en medios
semisólidos de cultivo, la posterior toma de las colonias y su siembra en medio
líquido (Montaño y Romano, 1995).

ESCALAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Una vez que se han superado todos los inconvenientes y se ha logrado obtener el
hibridoma productor del anticuerpo deseado, el próximo paso es su cultivo a
escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La producción a
mediana escala de los anticuerpos se puede efectuar inoculando el hibridoma
correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singénicos a la línea de
mieloma utilizada para la fusión y haciéndolo crecer como un tumor mielomatoso,
obteniéndose el anticuerpo en forma de líquido ascítico. A otra escala de
producción, el cultivo se puede hacer en botellas rotatorias, en fibras huecas o en
fermentadores especiales diseñados para tal fin. Para aplicaciones clínicas el
anticuerpo debe estar caracterizado tanto química como funcionalmente y con un
alto grado de pureza. Otro aspecto de importancia para la producción es et
almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en tanques
especiales de nitrógeno líquido, en los cuales las células son congeladas cuando
se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto ponerle de viabilidad
(Montaño y Romano, 1995) (En la figura 2 se muestran los pasos necesarios para
el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratón).
CONCLUSION

Los anticuerpos monoclonales han producido desde su descubrimiento una

revolución de gran calado en el diagnóstico y el tratamiento de numerosas
enfermedades. La utilización de anticuerpos monoclonales humanizados y
humanos ha mejorado notablemente su tolerancia. La tecnología actual de
fabricación de estos anticuerpos permite nuevos diseños que pueden ampliar sus
posibles aplicaciones en medicina.
BIBLIOGRAFIA

Montaño, F. y Romano E. (1995). Anticuerpos Monoclonales y su Aplicación en

Hematología. Consulta Online (http://www.interciencia.org.ve)

García, A. (2011). Anticuerpos monoclonales: Aspectos básicos. Neurología, 26

(05). Consulta Online: (http://zl.elsevier.es/es/revista/neurologia-295)

Delves, P.; Martin, S.; Burton, D. y Roitt, I. (2008). Inmunología: Fundamentos.

Argentina: Editorial Medica Panamericana.

Sociedad Española de Ciencias Hortícolas (S.E.C.H.). (1999). Diccionario de

Ciencias Hortícolas. Consulta Online: (http://books.google.es/books?
id=oW6dbRgw62gC&hl=es)

Grande, L. (1999). El Sueño de lo Posible: Bioética y Terapia Génica. Madrid:

Universidad Pontifica Comillas
ANEXO
Fig. 1: Disposicion global simplificada de la estructura del anticuerpo

Fig. 2: Resumen del Proceso de Producción de un Anticuerpo Monoclonal

Múrido