UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
Resumen: Fructooligosaccharides production by Schedonorus arundinaceus
sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase constitutively expressed to high levels in Pichia
pastoris.

Nombres: Paúl Jácome, Melanie Ledesma Fecha: 13 de Diciembre de 2018

Anita Lema, Janine Peralta NRC: 3789
Andrea Pumisacho y Sasha Siguenza

3.2. El aumento de la dosis de genes aumentó considerablemente el rendimiento de

sa1-SSTrec en el sistema de expresión constitutivo.
El aumento en la dosis de genes recombinantes se abordó como una estrategia para mejorar
la expresión constitutiva de Sa1-SSTrec.

El fragmento BglII de 22.3 kb del plásmido pALS227 (Fig. 2a) que

comprende seis copias en tándem del casete de expresión Sa1-SST, el
gen his4 y las regiones 5 'y 3' flanqueantes de AOX1 se electroporó en la
cepa deficiente en his4 GS115. Todas las colonias complementadas con
histidina que acidificaron las placas SYP (fenotipo Suc +) secretaron Sa1-
SSTrec activa en cultivos de lotes con agitación. El clon con la mayor
actividad sucrolítica en el sobrenadante de cultivo se denominó PGFT6x.

Se intentó la retransformación del clon PGFT6x para aumentar aún más

la dosificación del gen. El plásmido pALS223 (Fig. 2a) que lleva el casete
de expresión Sa1-SST de seis copias y el gen de resistencia a la
higromicina (hygr) se linealizó con HpaI para favorecer un evento de
cruce único en la región 5 'AOX1 recombinante de PGFT6x genoma.
Algunas colonias resistentes a la higromicina mostraron el fenotipo Suc
+ incluso cuando el pH inicial del medio SYP de cribado se elevó a 8,5,
una condición subóptima para la actividad. En experimentos de lotes
con agitación, la suma del rendimiento de Sa1-SSTrec periplasmic y
extracelular en el clon retransformado de élite (denominado PGFT6x-
308) aumentó 1.9 veces y 5.3 veces en comparación con su predecesor
PGFT6x y el clon de copia única PGFT1x, respectivamente.

PGFT1x, PGFT6x y PGFT6x-308 contienen una, seis y nueve copias Sa1-SST,

respectivamente, según lo determinado por la PCR cuantitativa en tiempo real. Para una
caracterización genética más detallada, los tres clones se sometieron a análisis de
transferencia Southern genómica (Fig. 2b y c).

 El fragmento de hibridación tándem está ausente en la PGFT1x

Sa1SST de 2,82 kb que resulta de (Fig. 2b, carril 3).
la digestión con EcoRI de dos  En PGFT6x, la señal de este
casetes de expresión dispuestos en fragmento es de hecho
 aproximadamente 5 veces más
intensa que la del segundo
fragmento EcoRI (tamaño> 8 kb)
con la última copia del gen (Fig.
2b, carril 5).
 Consistentemente, la intensidad de
hibridación de la banda EcoRI-
XbaI de 1.65 kb que encierra toda
la región codificante de Sa1-SST
es equivalente a la integración de
seis copias de genes intactas (Fig.
2b, carril 6).
 En el clon PGFT6x-308
retransformado, la intensidad más
aumentada del fragmento de 2.82
kb y la presencia de una tercera
banda EcoRI (tamaño> 10 kb)
(Fig. 2b, carril 7) confirma la
integración de copias adicionales
de Sa1-SST.
 El inesperado segundo fragmento
EcoRI-XbaI (tamaño ∼3.5 kb) en
el patrón de hibridación del clon
PGFT6x-308 (Fig. 2b, carril 8)
revela que se produjo un
reordenamiento del gen durante la
integración del plásmido
pALS223.
El uso de la región 5 'del gen
AOX1 de P. pastoris como
segunda sonda de hibridación
permitió una caracterización
precisa de los eventos de
recombinación en los dos clones
multicopia. Como se esperaba, la
cepa de control GS115 y el clon
de copia única PGFT1 x que
llevaba el plásmido pALS214
insertado en el locus GAP
mostraron patrones de hibridación
de AOX1 idénticos (Fig. 2c,
carriles 1–4).
En el clon retransformado
PGFT6x-308, la retención del
fragmento EcoRI del hospedador
de aproximadamente 6 kb y la
adición de un segundo fragmento
EcoRI de hibridación de AOX1
(tamaño> 10 kb) (Fig. 2c, carril 7)
indica que el plásmido linealizado
HpaI pALS223 se insertó de
hecho en la región 5 'AOX1 del
clon PGFT6x.

3.3. Rendimiento del clon de nueve copias PGFT6x-308 en la fermentación por lotes
alimentados
El efecto de aumentar el número de copias del gen en la expresión constitutiva de Sa1-
SSTrec en la fermentación alimentada por lotes se evaluó primero utilizando glicerol como
fuente de carbono (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de la dosificación génica sobre la expresión constitutiva de Sa1-SSTrec en
clones de Pichia pastoris fermentados en lotes alimentados.
La capacidad adquirida del clon PGFT6x-308 para utilizar sacarosa nos llevó a evaluar el
uso alternativo del azúcar de caña como un sustrato más barato para el crecimiento celular
en la fermentación de lotes alimentados. El reemplazo de glicerol por azúcar de caña no
tuvo ningún efecto en el rendimiento de la biomasa, pero la actividad general de Sa1-
SSTrec se incrementó por encima de 3,2 veces, alcanzando el valor máximo de 102,1 U /
ml (Tabla 1). La productividad volumétrica del clon PGFT6x-308 al final de la
fermentación (72 h) fue de 437.2 y 1422.2 U / l / h para las células cultivadas con glicerol y
azúcar de caña, respectivamente.
3.6. Modelo de estructura tridimensional de sa1-SST.
Sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST)
pertenece a la familia de glucósido
hidrolasa 32 (GH32), contiene:
o Invertasas
o Sacarosa 6P hidrolasas,
o Fructanasas
o Fructosiltransferasas
eucariotas,
o Pero no
fructosiltransferasas
procarióticas (GH68)
Fig. 6. Modelo tridimensional de Sa1-SST.

Actualmente se han determinado tres estructuras cristalinas de GH32 de plantas, pero

ninguna de ellas corresponde a una (1-SST). Por esta razón se construyó un modelo
computacional de la estructura 3D de S. arundinaceus 1-SST (Sa1-SST) que comprende los
residuos Ala1-Leu548 (la numeración corresponde a la proteína madura) utilizando la
enzima 6-SST / 6-SFT de Pachysandra terminalis (PDB código 3UGF) como la plantilla
homóloga basada en su identidad de secuencia más alta (55%) con Sa1-SST.
La estructura 3D predicha de Sa1-SST muestra un pliegue bimodular que consiste en un
dominio catalítico de hélice β de cinco palas N-terminal (residuos Pro23-Asn336)
conectado a un dominio más corto de sándwich β C-terminal. La superposición del modelo
Sa1-SST 3D con estructuras cristalinas de GH32 disponibles reveló la conservación estricta
de tres residuos ácidos (tríada catalítica) en la parte inferior de la cavidad del sitio activo
involucrada en la escisión del enlace glicosídico del sustrato donador de fructosilo que
funciona como nucleófilo (Asp30), catalizador ácido / base general (Glu212) y
estabilizador del estado de transición (Asp154). Se forma un puente disulfuro estabilizador
de pliegues entre Cys401 y Cys447. La Sa1-SST madura contiene cinco sitios potenciales
de N-glicosilación. El primero (Asn222) está expuesto en la superficie del dominio de la
hélice β, lejos del bolsillo del sitio activo. Los otros cuatro (Asn351, Asn385, Asn400 y
Asn519) están posicionados en el dominio β-sandwich.
Discusión:
- Los fructooligosacáridos (FOS) poseen un grado de polimerización entre 3 y 5.
- Se producen comercialmente a partir de sacarosa utilizando biocatalizadores fúngicos.
- Para asegurar un efecto prebiótico eficaz y proporcionar un sabor dulce natural se requiere
una mezcla rica en trisacárido 1-kestosa (GF2). Para poder sintetizar 1-kestosa (GF2) se
requiere la enzima sacarosa: sacarosa 1- fructosiltransferasa. Sin embargo, los rendimientos
de 1-SST recuperados hasta ahora de fuentes naturales o recombinantes han permanecido
demasiado bajos para considerar esta enzima para aplicaciones biotecnológicas. En este
estudio, la expresión impulsada por el promotor de GAP de 1-SST madura de Schedonorus
arundinaceus (Sa1-SSTrec) en la levadura Pichia pastoris se incrementó secuencialmente al
aumentar la dosis del gen de una a seis y nueve copias.
-La intensificación proporcional observada de la actividad Sa1-SSTrec tanto en el
periplasma celular como en el sobrenadante del cultivo (Tabla 1) sugiere que la
transferencia a través de la pared celular no es un paso limitante en la secreción de
proteínas. Por el contrario, la tasa extracelular / periplásmica de Thermotoga maritima β-
fructosidasa (BfrA) en P. pastoris disminuyó en comparación con el aumento de la dosis del
transgen.
-El clon de nueve copias PGFT6x-308 adquirió la capacidad de crecer en sacarosa como
única fuente de carbono en la fermentación de lotes alimentados. El uso de azúcar de caña
en lugar de glicerol para el crecimiento celular redujo el costo del medio y, lo que es más
importante, aumentó 3 veces el rendimiento total de Sa1-SSTrec. Suponemos que la
liberación enzimática de glucosa durante el cultivo de levadura reforzó la transcripción del
transgén. Se sabe que el promotor GAP, aunque constitutivo, se comporta más fuerte en las
células cultivadas con glucosa. Los niveles de expresión aumentados en el clon PGFT6x-
308 no impidieron alcanzar un alto rendimiento de biomasa (106 g / l, peso seco) y una
actividad elevada de Sa1-SSTrec en ambas células intactas (38.9 U / ml) y el sobrenadante
de cultivo (63.2 U / ml) a un tiempo de fermentación relativamente corto (72 h). La
productividad volumétrica global de las células PGFT6x-308 desarrolladas con
sucrosificación fue 26 veces mayor y 18 veces mayor que la del clon constitutivo de una
copia PGFT1x cultivado con glicerol y el clon de una copia inductivo de metanol PAFT1x,
respectivamente.
-La 1-SST nativa de S. arundinaceus es una glucoproteína vacuolar que se procesa
rápidamente en dos subunidades de alrededor de 58 y 25 kDa. P. pastoris secretó Sa1-
SSTrec como una glicoproteína monomérica con una masa molecular estimada en el rango
de 80 a 90 kDa. La enzima intacta estaba completamente activa, apoyando el supuesto que
la escisión que se produce en la planta no es esencial para la actividad. El tratamiento con
N-desglicosilación de Sa1-SSTrec con Endo Hf causó una disminución dramática de la
estabilidad de la enzima, pero no tuvo influencia en el perfil del producto de la reacción con
la sacarosa.
-En el modelo estructural 3D, N222 reside en el dominio catalítico de la hélice β, pero no
cerca del bolsillo del sitio activo, mientras que los otros cuatro residuos de Asn glicosilados
se distribuyen a lo largo del dominio β-sándwich C-terminal. Nuestros hallazgos indican
que las cadenas de glicosilo unidas a N en Sa1-SSTrec contribuyen a la estabilización del
pliegue, pero no están directamente involucradas en la unión al sustrato o la catálisis.
-En las enzimas productoras de FOS fúngicas secretadas por hospedadores nativos o
levaduras recombinantes, la presencia de cadenas de glicosilo ligadas a N contribuye a la
termoestabilidad, pero en general no tiene efecto en las especificidades del sustrato /
producto.