DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA

AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
TEMA: “EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA Y
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO”

BIOQUÍMICA I

INTEGRANTES: GRUPO N° 1
Omar Arias
Alejandra Muñoz
Sasha Sigüenza
Jennifer Tapia

TUTOR: Ing. Petronio Gavilanes

 PRACTICA # 1
(Tercer parcial)
TEMA: EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO

FORMULACIÓN DE OBJETIVOS:
Objetivo General:

 Determinar el punto isoeléctrico de la caseína, una vez que esta ha sido extraída
mediante procedimiento químico de la leche entera líquida.

Objetivos Específicos:

 Obtener la caseína a partir de una muestra de leche.

 Observar y determinar experimentalmente el efecto de pH sobre las proteínas de la
leche.

PREGUNTAS PROPUESTAS:

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA:

¿Qué papel desempeña la caseína en la leche y cuáles son sus características?
¿Qué se puede decir, de la solución de caseína y sus puntos de absorbancia encontrados?

INVESTIGACIÓN TEÓRICA CONCERNIENTE AL CASO:

Las proteínas son compuestos químicos muy complejos que se encuentran en todas
las células vivas: en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas y pólenes.
Hay ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de proteínas los
contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrógeno,
así como de oxígeno, hidrógeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre, y en
algunas fósforo y hierro. (Arboledas, 2008)

Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de ciertas sustancias más simples
llamadas aminoácidos, que los vegetales sintetizan a partir de los nitratos y las sales
amoniacales del suelo. Los animales herbívoros reciben sus proteínas de las plantas; el
hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero las proteínas de origen animal
son de mayor valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe a que, de los aminoácidos que se
conocen, que son veinticuatro, hay nueve que son imprescindibles para la vida, y es en las
proteínas animales donde éstas se encuentran en mayor cantidad. (Greg, 2005)

La caseína está formada por dos proteínas, siendo las más abundantes en la leche las
fosfoproteínas como son: caseína α5 y caseína β; la caseína k es una fosfoglicoproteína, también
contiene calcio con el cual forma un complejo calcio-caseína. La caseína es el componente
principal de la proteína de la leche y representa cerca del 80% de la proteína total, se
encuentra en forma de pequeñas partículas o micelas de caseína en suspensión y carece de
homogeneidad, dentro de la industria es utilizada en la fabricación de quesos. (Tecnología de la
Leche, s. f.)

En las proteínas, como en los aminoácidos y en cualquier molécula anfótera, las cargas pueden
ser neutralizadas de manera tal que la carga neta sea igual a cero obteniéndose el punto
isoeléctrico. Este proceso se lo realiza modificando el pH del medio en el que se encuentren
estas moléculas. Si en una mezcla de proteínas se alcanza el punto isoeléctrico de una de ellas,
esta se precipita mientras el resto queda disueltas. En el caso de la caseína precipita en un pH
de 4,8. Esta propiedad se puede explotar para purificarla simplemente al acidificar el medio.
(Manual de Practicas Biologia Molecular de la Celula L, 2005).

Para estudiar a las proteínas se las obtienen puras, cuya liberación se la debe realizar si causar
daño a su actividad biológica, por lo cual su manipulación debe realizarse en condiciones
reguladas de pH, temperatura, grado de oxidación y fuerza iónica. (Alais & Godina, 1985).

PUNTO ISOELÉCTRICO

Las proteínas juegan un papel importante crucial en casi todos los procesos biológicos, tales
como catálisis, y transporte, movimiento coordinado, excitabilidad y control de crecimiento y
diferenciación, entre otros. (Pena, 1988)

La caracterización de las proteínas es importante debido a que el conocimiento de sus

propiedades permite, entre otras cosas, poder manipularlas y darles un uso práctico. Existen
varias técnicas para caracterizar las proteínas en base a su peso, carga, interacción con otros
compuesto. Por ejemplo, el enfoque isoeléctrico (determinación del punto isoeléctrico) y la
cromatografía por intercambio iónico, parte de su principio está basado en la carga de las
proteínas. La carga de las proteínas puede ser manipulada por cambios de pH. (Berg, Stryer, &
Tymoczko, 2007)El punto isoeléctrico (pI) es el pH en que la carga neta total de una molécula es
igual a cero y no migra en un campo eléctrico. Un fenómeno físico importante es que cuando
una molécula está en su punto isoeléctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio
importante de separación de proteínas. Si se quiere determinar con exactitud el pI de una
proteína se usa frecuentemente enfoque isoeléctrico, en el cual se usa un gradiente de pH
creado por anfolinas. Sin embargo, esta técnica resulta costosa y es casi de uso exclusivo para
los laboratorios de investigación. Por otro lado, si se conoce la secuencia de una proteína
existen programas que permiten conocer el punto isoeléctrico, tales como el EditSeq de DNA
star. Ya que una proteína precipita en su punto isoeléctrico, en esta práctica determinaremos el
punto isoeléctrico aproximado de la caseína (proteína mayoritaria en la leche) al colocarlos en
soluciones con diferentes valores de pH.(Harris, 2006)
MATERIALES Y MÉTODOS:
 Muestras: Leche entera corriente
 Equipos:
1. Balanza analítica
2. Potenciómetro (pH-metro)
 Materiales de protección personal: Mandiles. Mascarillas con filtro de gases. Guantes
de látex.
 Reactivos:
o Agua destilada o NaOH 1N
o Acetato sódico 0,1 N o Éter etílico
o Ácido acético 0,01 N o Etanol al 70%
o Ácido acético 0,1 N o Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para
o Ácido acético 1,0 N calibrar el potenciómetro

Materiales e insumos:
o Diez vasos de precipitación de 25 ml
o Dos vasos de precipitación de 50ml
o Un vaso de precipitación de 250ml
o Probeta de 50ml
o Matraz aforado de 50 ml
o pipeta graduada de 5,0 ml
o pipeta graduada de 1,0 ml
o pipeta graduada de 10,0 ml
o Embudo de vidrio mediano
o Papel de filtro
o Termómetro

Organismos: No aplica

PROCEDIMIENTO:
A. Aislamiento de la caseína:

- Caliente en un vaso de precipitado 150ml de agua destilada a 38ºC, añada 50ml de

leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que
observe que se forma un precipitado (la leche se corta).
- Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
- Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro.
- Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
- Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado,
vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico.
- Filtre nuevamente.
- Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la
caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:

 - Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml.
- Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución
total de la caseína.
- Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de
ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien.
- La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. Determinación del pI de la caseína:

En diez vasos de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos
según la siguiente tabla:
TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1 N Acético 0.1 N Acético 0.01 N pH resultante

(aprox.)
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4.0
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

- Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, que debe cubrir un rango

aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que
deben ser semejantes a los expresados y en todo caso crecientes.

- Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.

- Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.

- Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1

cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo
para obtener una solución / suspensión homogénea antes de verter una parte en la
cubeta.

- Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI

aproximado de la caseína.

RESULTADOS PRIMARIOS:
DISCUSIÓN:
CONCLUSIONES:
 o Es posible la purificación parcial y el aislamiento de la caseína de la leche, utilizando
la poca solubilidad que esta proteína tiene cuando se le lleva hasta su punto
isoeléctrico. No obstante, el rendimiento puede ser variado si se considera que los
métodos de purificación son también variados. En la práctica llegamos a comprobar
todo lo que aprendimos en la teoría.
o Se aisló la caseína, misma que se manifestó a manera de un precipitado blanco de
fácil manipulación, resultado de la precipitación de la leche a mezclada con éter
etílico agrandes temperaturas.
o Se realizó correctamente la solución de caseína, solución que se identificó al lograr
que la solución de caseína NaOH y ácido acético, este completamente clara y limpia.
o Se determinó el punto isoeléctrico de la caseína que fue extraída y aislada de la
leche entera liquida.

RECOMENDACIONES:

CUESTIONARIO:
BIBLIOGRAFÍA:

Alais, C., & Godina, A. L. (1985). Ciencia de la leche: principios de técnica lechera. Reverte.

Berg, J. M., Stryer, L., & Tymoczko, J. L. (2007). Bioquímica. Reverte.

Harris, D. C. (2006). Análisis químico cuantitativo. Reverte.

Pena, A. (1988). Bioquímica. Editorial Limusa.

Tecnologia de la Leche. (s. f.). Bib. Orton IICA / CATIE.

Arboledas, D. (2008). Jerarquia estructural de las proteinas. España: Imprenta Gamma.

Greg, C. (2005). Proteinas Verdes. España: Editorial Gamma.

ANEXOS: