Universidad Nacional de Ingeniería

Facultad de Ingeniería Química y Textil

Introducción a la bioingeniería
PI-521 A
Trabajo N°2
“INFLUENCIA DEL MATERIAL TRANSDUCTOR DE UN
MICROELECTRODO BIOSENSOR ENZIMÁTICO
AMPEROMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN IN VITRO DE
TRIFOSFATO DE ADENOSINA”
Integrantes – Grupo 10

-  Aparicio Huablocho Jordan Alexis                      20171295J

- Castillo Barzola Angie Lucerito 20172214C

- Terrones Fernandez Ersim Antony 20172648C           

Profesor responsable: Ing. Neira Montoya Enrique 

Fecha de entrega de la práctica: 25 / 06 / 2021

Periodo Académico 2021-I

Lima-Perú
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Índice
Resumen 3
Abstract 3
1. Introducción 4
2. Antecedentes 5
3. Fundamento teórico 5
3.1. Biosensor 5
3.1.1. Aplicación de biosensores 6
3.2. Biosensores enzimáticos amperométricos 7
3.2.1. Materiales Transductores 7
3.2.2. Transducción electroquímica 8
4. Metodología 9
4.1. Diseño de la investigación 9
4.2. Variables de investigación 9
4.3. Población y muestras de en estudio. 10
4.3.1. Población. 10
4.3.2. Muestra. 10
4.4. Procedimiento 10
4.4.1. Fabricación de los electrodos. 10
4.4.1.1. Microelectrodos de disco de platino. 10
4.4.1.2. Microelectrodos de pasta de carbono. 11
4.4.2. Estudios de estimación de áreas electronegativas y determinación del
potencial de oxidación de H2O2. 12
4.4.3. Inmovilización de enzimas. 12
4.4.4. Estudio del desempeño del componente GOx del biosensor. 12
4.4.5. Caracterización del biosensor de ATP. 12
4.4.6. Análisis de datos. 13
5. Resultados y Análisis de Resultados. 13
5.1. Método de preparación de las pastas de carbono 13
5.2. Áreas electroactivas 14
5.3. Demostración del potencial de detección de H2O2: 15
5.4. Estudio de sensibilidades y límites de detección para H2O2: 16
Bibliografía 21

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Índice de figuras

Figura 1. Estructura de un biosensor. 6

Figura 2. Microelectrodo de disco de platino. 11
Figura 3. Microelectrodo de pasta de carbono. 11
Figura 4. Resultado de comparaciones de corrientes de background entre los métodos de
mezcado en la obtención de pastas de carbono 14
Figura 5. Resultados de sensibilidades de los electrodos en la detención de H2O2 16
Figura 6. Respuestas electroquímicas a H2O2 16
Figura 7. Respuesta electroquímica a glucosa. 18
Figura 8. Respuesta electroquímica a ATP 19

Índice de tablasY

Tabla 1. Variables de investigación. 9

Tabla 2. Corrientes background y ruido para varios metales preparados para los dos
métodos. 13
Tabla 3. Cargas eléctricas y áreas electroactivas para varios materiales de electrodos. 14
Tabla 4. Potenciales de oxidación de H2O2 para varios metales transductores. 15
Tabla 5. Sensibilidades y límites de biosensor de ATP durante varios días de
funcionamiento 20

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Resumen
Los microelectrodos amperométricos biosensores enzimáticos son actualmente
atractivos en la monitorización del trifosfato de adenosina como un instrumento
analítico de bajo costo y corto tiempo con el potencial de ser miniaturizado

Para determinar qué material proporciona las respuestas analíticas las mejores
características en la detección de ATP en microelectrodos se han elaborado con tres
materiales de diferente amperometría: pasta de grafito platinizado, pasta platino vítrea y
discos de platino; juntas, las pastas de carbón se prepararon mediante diferentes
métodos.

Las membranas bioactivas de los biosensores de ATP se han convertido en sustratos de

soporte inmovilizando glucosa oxidasa y en el polifenol por electropolimerización.

La enzima GOx mostró una sensibilidad de 40,81 a pA mM-1 que permaneció estable
durante 7 días con una variación significativa y tenía un amplio rango de linealidad de
glucosa de 0,55 a 49,63 mM.

La pareja enzimática GOx / HEX se evaluó durante 5 seguimientos ATP mostrando una
sensibilidad de 12,45 a pA µM-1 en el primer día y consecuentemente perdió 65% hasta
el quinto día de almacenamiento de biosensor de tampón PBS pH 7,1 a 4ºC, el intervalo
de respuesta fue de 0,17 a 1,99 µM.

Abstract

Enzyme biosensor amperometric microelectrodes are currently attractive in monitoring

adenosine triphosphate as a low-cost, short-time analytical instrument with the potential
to be miniaturized.
To determine which material provides the analytical responses the best characteristics in
the detection of ATP in microelectrodes have been elaborated with three materials of
different amperometry: platinized graphite paste, vitreous platinum paste and platinum
discs; Together, the charcoal pastes were prepared by different methods.
The bioactive membranes of the ATP biosensors have been converted into support
substrates by immobilizing glucose oxidase and in the polyphenol by
electropolymerization.
The GOx enzyme showed a sensitivity of 40.81 to pA mM-1 that remained stable for 7
days with significant variation and had a wide range of glucose linearity from 0.55 to
49.63 mM.

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The GOx / HEX enzyme pair was evaluated during 5 ATP follow-ups showing a
sensitivity of 12.45 to pA µM-1 on the first day and consequently lost 65% until the
fifth day of storage of PBS buffer pH 7.1 biosensor at 4ºC, the response range was 0.17
to 1.99 µM.
1. Introducción
En el momento actual, existen varias técnicas que nos permiten medir directamente
ATP en concentraciones fisiológicas, estas son cromatografía líquida, fluorescencia,
quimioluminiscencia, técnicas de bioluminiscencia amperométricas.

Sin embargo, de todas estas técnicas, solo biosensores amperométricos de tiempos

de respuesta cortos, alta especificidad y estabilidad a largo plazo para mediciones in
vitro e in vivo; y estas también son alternativas económicas para productos
químicos, en comparación con las técnicas antes mencionadas, que además de más
caras, también pueden requerir muchos pasos para realizar la detección de analitos,
lo que requiere más tiempo para obtener una respuesta.

Además de todas las ventajas antes mencionadas, son fáciles de maniobrar y se

pueden miniaturizar. Los componentes que influyen en el diseño de un biosensor
ayudan a comprender qué parámetros cambian durante un evento de reconocimiento
en un biosensor. Este conocimiento es esencial para el desarrollo y la optimización
de biosensores. La elección del elemento de reconocimiento biológico es la crucial,
que se toma durante el desarrollo de un nuevo diseño de biosensor, porque la enzima
que se eligió reacciona selectivamente con el analito de interés. Dicha enzima debe
ser estable bajo las condiciones y almacenamiento del biosensor y debe
proporcionar un plazo razonable a largo plazo. Además, un factor importante, en
particularmente con respecto a la comercialización potencial, es que la enzima redox
tiene un costo razonable.

Dicha enzima debe ser estable en las condiciones y almacenamiento del biosensor y
debe proporcionar un plazo razonable a largo plazo. Además, un factor importante,
en particular con respecto a la comercialización potencial, es que la enzima redox
tiene un costo razonable.

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2. Antecedentes

Se han desarrollado muchos sensores ATP amperométricos, pero se conoce

información sobre cómo estos electrodos están bajo la influencia de diferentes
materiales transductores.

Se ha demostrado que estos biosensores son selectivos para adenosina, selectivos

para guanosina trifosfato, citidina, uridina trifosfato, timidina trifosfato.

También se encontró un biosensor comercial protegido contra interferencias como

serotonina, ascorbato, urato, dopamina, UTP, ADP y adenosina.[ CITATION Sar05 \l
2058 ]

En algunos casos superaron este problema usando un electrodo "nulo" para eliminar
la interferencia [CITATION Lla \l 2058 ], aunque es una buena estrategia que el tamaño
de la señal de interferencia sea pequeño a la señal medida para el analito y la
estabilidad tanto del sensor como del electrodo "cero" debería ser bueno en
mediciones biológicas. [ CITATION Mas08 \l 2058 ]

También varía la estabilidad de los electrodos amperométricos que tienen

componentes inmovilizados en membranas bioactivas.

Los biosensores de ATP varían de biosensores que muestran una respuesta del 70%
después de 1 semana, que pierden entre un 35% y un 60% después de 2-3 semanas
[ CITATION Kue \l 2058 ] ; [ CITATION Liu07 \l 2058 ], y biosensores que pierden un 10%
después de 18 días.[ CITATION Got87 \l 2058 ]

3. Fundamento teórico
3.1. Biosensor
Un biosensor es un dispositivo capaz de proporcionar una información analítica
específica cuantitativa o semicuantitativa, utilizando un elemento de
reconocimiento biológico que está en contacto directo con un elemento
transductor. Es un instrumento para la medición de parámetros biológicos o
químicos. Suele combinar un componente de naturaleza biológica y otro
fisicoquímico.[ CITATION Băn12 \l 2058 ]

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Se compone de tres partes:

 El sensor biológico: puede ser un tejido, un cultivo de microorganismos,
enzimas, anticuerpos, cadenas de ácidos nucleicos, etc. El sensor puede
ser tomado de la naturaleza o ser un producto de la biología sintética.
 El transductor: acopla los otros dos elementos y traduce la señal emitida
por el sensor.
 El detector: puede ser óptico, piezoeléctrico, térmico, magnético, etc.

Figura . Estructura de un biosensor.

La naturaleza ha desarrollado un amplio conjunto de biomoléculas o estructuras
biomoleculares que muestran una gran selectividad en el reconocimiento de
alguna propiedad particular de una determinada molécula de entre un conjunto
o una mezcla de ellas. Este fenómeno de reconocimiento selectivo de especies
obviamente puede ser aprovechado con fines analíticos para el diseño y
preparación de sensores de dichas especies.[ CITATION Pin99 \l 2058 ]
3.1.1. Aplicación de biosensores
Los biosensores deben ser de preferencia para una determinada aplicación;
en el caso de que se trate de un diseño basado en un principio general, se
adaptan las condiciones a las necesidades de una tarea analítica específica.
Son usados con frecuencia en atención médica, siendo la identificación de
glucosa una de las más importantes aplicaciones por la dependencia de los
pacientes diabéticos y su continuo monitoreo en tiempo real; también se
usa en el campo dentro de procesos industriales, como el análisis de entes
patógenos en la industria alimentaria y monitoreo ambientan relacionado al
control ecológico. [ CITATION Bor11 \l 2058 ]
El diseño y principio de funcionamiento del biosensor dependen de la
muestra que el diseño dicte; por ejemplo, si se tiene una muestra como

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sangre u orina (potencial peligro) es preferible que el biosensor sea

desechable.
3.2. Biosensores enzimáticos amperométricos
3.2.1. Materiales Transductores
Electrodos de trabajo empleados en biosensores amperométricos son de
naturaleza sólida, donde el electrodo de mercurio es el único electrodo a
temperatura ambiente y su aplicación en biosensores no es común.
Los metales como platino, oro, plata y acero inoxidable han sido
empleados para fabricar electrodos electroquímicos, por presentar a
excelentes propiedades eléctricas y mecánicas.
Tienen una alta inercia química y proporcionan un amplio rango de
potencial de trabajo anódico con baja resistividad eléctrica, además poseen
una estructura cristalina muy pura que proporciona corrientes residuales
bajas y una alta relación señal-ruido
De forma particular, el platino y el oro son utilizados como electrodos de
trabajo para reacciones electroquímicas con potenciales estándar positivos;
mientras que el mercurio es útil para las reacciones con potenciales
estándar negativos.
Al emplear disolventes orgánicos, el platino cuidadosamente pulido hasta
obtener un acabado de espejo, es un electrodo químicamente inerte, a
menudo con muy favorables cinéticas de transferencia electrónica. En estos
medios la adsorción de compuestos orgánicos de los reactivos y los
productos de las reacciones en los electrodos es generalmente
insignificante. Posterior al pulido debe realizarse también una limpieza
electroquímica de la superficie de platino inmediatamente antes de la
medición, puede ser realizada por la polarización del electrodo con una
serie de pulsos voltamétricos cíclicos
Con el desarrollo de la nanociencia y la nanotecnología, las nanopartículas
de metales han atraído cierto sustancial interés, llegando a emplearse
electrodos basados en nanopartículas de plomo en la detección de H 2O2 sin
la necesidad de emplear enzimas, principalmente por su alta eficiencia
electrolítica y selectividad de H2O2.[ CITATION Xia09 \l 2058 ]
3.2.2. Transducción electroquímica

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Los biosensores amperométricos son sensores electroquímicos cuya

transducción se basa en la imposición de un potencial como medio de
perturbación para generar una repuesta que en este caso es que la reacción
electroquímica sea consumada.
La amperometría es la medición de la corriente de celda cuando la
diferencia de potencial entre electrodo de trabajo y electrodo de referencia
es controlada, en una solución con agitación o movimiento. Algunas
técnicas relacionadas a la amperometría son: cronoamperometría,
cronocolumbimetría, electrogravimetría, electrografía, etc.
Específicamente para el trabajo de investigación en cuestión, se desarrolla
el biosensor para la determinación de ATP con la técnica de
cronoamperometría; esta es una técnica potenciostática que mide el
potencial de una corriente que resulta de la oxidación o reducción
electroquímica de una especie electroactiva específica seleccionada
mediante control del potencial constante del electrodo de trabajo
(generalmente Pt, Au o C) con respecto a un electrodo de referencia. La
ecuación que relaciona la corriente resultante con la concentración de las
especies electroactivas es la ecuación de Corttrell (comportamiento lineal
cuando el proceso se da en condiciones de estado estacionario)
i=K C 0¿
Donde:
i: Corriente
C 0¿: Concentración de analito en solución
K: Constante de proporcionalidad
3.2.3. Sistema de reconocimiento moleculares (membrana bioactiva)
Para el reconocimiento de la biomolécula macromolecular (enzimas,
coenzimas, coenzimas, anticuerpos, células, etc) en cuestión, esta se
inmoviliza sobre superficies conductoras con retención completa de sus
propiedades; dichas superficies pueden ser películas de polímeros
orgánicos electropolimerizadas, se trata de la formación electroquímica de
capas de polímero de espesor controlado. El método electroquímico
implica atrapar las biomoléculas en la superficie mientras ocurre la
electrogeneración sobre la superficie de un electrodo.

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Otra aplicación indica que se debe dar la adsorción previa de monómeros

anfifílicos y biomoléculas antes de que la etapa de electropolimerización
sea realizada. Una de las ventajas que conlleva la polimerización
electroquímica es que las películas de polímero pueden ser preparadas
fácilmente.
4. Metodología
4.1. Diseño de la investigación
Este trabajo está basado en un diseño de exploración para la búsqueda de
mejoras en las condiciones para la construcción de transductores en biosensores
de ATP in vitro, en las cuales se tuvo en cuenta diferentes alternativas del
material de los transductores tales como pastas de carbón vitreo platinizadas,
pastas de grafito platinizadas y platino. También busca especificar las
propiedades, características y rasgos importantes en las señales analíticas de los
diferentes diseños de biosensores de ATP propuestos y la influencia de los
materiales transductores en estos, basándose en los datos obtenidos
experimentalmente.
4.2. Variables de investigación

Tabla . Variables de investigación.

Variables Independientes Dependientes

Preparación de - Tipo de material transductor: - Corriente de fondo
las pastas de microelectrodo de pasta de y ruido.
carbono grafito y microelectrodo de pasta
de carbón vítreo platinizado.
- Método de preparación de las
pastas de carbono.
Estimación de - Tipo de material transductor: - Área electroactiva
áreas microelectrodo de pasta de de los electrodos
electroactivas grafito platinizado, con platino en su
microelectrodo de pasta de superficie.
carbón vítreo platinizado y
microelectrodo de disco de
platino.
Determinación - Tipo de material transductor: - Potencial de
del potencial de microelectrodo de pasta de detección de H2O2.

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detección de grafito platinizado,

H2O2 microelectrodo de pasta de
carbón vítreo platinizado y
microelectrodo de disco de
platino.
Estudio de las - Tipo de material transductor: - Sensibilidades de
características microelectrodo de pasta de las curvas de
de detección de grafito platinizado, calibración.
H2O2 microelectrodo de pasta de
carbón vítreo platinizado y
microelectrodo de disco de
platino.
Estabilidad a - Tiempo de funcionamiento: 1, 2, - Sensibilidad de
largo plazo de 3, 4, 5, 6 y 7 días. curvas de
GOx calibración con
glucosa.
Estabilidad a - Tiempo de funcionamiento del - Sensibilidad de
largo plazo de biosensor de ATP: 1, 2, 3, 4 y 5 curvas de
GOx/HEX días. calibración con
ATP.

4.3. Población y muestras de en estudio.

4.3.1. Población.
Se construyeron 12 microelectrodos con cada material transductor:
ultramicrodiscos de platino, pasta de grafito platinizadas y pasta de carbón
vítreo platinizadas.
4.3.2. Muestra.
Se utilizaron 4 microelectrodos de cada tipo. Por otro lado, el tamaño
muestral en el estudio de preparación de las pastas fue de 3 electrodos por
cada pasta.
4.4. Procedimiento
4.4.1. Fabricación de los electrodos.
4.4.1.1. Microelectrodos de disco de platino.
Para la elaboración de este tipo de microelectrodos se usó pequeño
alambre de platino de 50 micrones de diámetro cubierto con
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teflón (1cm de largo aprox.), el cual es unido a un alambre de

cobre (4 cm de largo aprox.) con adhesivo conductivo epoxico de
plata el cual es secado por una noche recomendablemente. Luego
este alambre resultante es pasado a una micropipeta llena con
resina epoxica no conductiva, después se corta la punta de la
pipeta para así obtener el microelectrodo de disco. Finalmente es
pasado por un proceso de pulido en alúmina y una limpieza
electroquímica de la superficie del electrodo.

Figura . Microelectrodo de disco de platino.

4.4.1.2. Microelectrodos de pasta de carbono.
La obtención de las mezclas de pastas de carbono se dio por dos
métodos, uno mezclando polvo y aglutinante en una caja Petri con una
vara agitadora y el otro método mediante mezclas de materiales en
mortero y pistilo. La pasta obtenida se llena en una micropipeta hasta
no dejar espacios entre la pasta y la micropipeta, luego se inserta un
alambre de cobre hasta la mitad de volumen finalmente se fija el
alambre con una gota de resina epoxica no conductiva (dejar secar
una noche).
El paso final para la obtención de los electrodos es hacer la
platinización mediante electrodeposición de nanopartículas de platino,
finalmente así haciendo si respectiva limpieza electroquímica para
tener la seguridad de que estas estén purificadas.

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Figura . Microelectrodo de pasta de carbono.

4.4.2. Estudios de estimación de áreas electronegativas y determinación del
potencial de oxidación de H2O2.
La estimación de las áreas electronegativas de los electrodos fabricados se
determinó mediante la medición de áreas bajos los picos de
adsorción/desorción del hidrogeno en los ciclovoltamperogramas. Y para la
determinación del potencial de oxidación del peróxido de hidrogeno se
llevó a cabo voltamperometrías cíclicas en tres soluciones de H2O2 (1.96,
3.85 y 5.66 mM) disueltas en n 0.5 M H2SO4 a una velocidad 0.05 V/s de
barrido de potencial.
4.4.3. Inmovilización de enzimas.
Una etapa previa a la inmovilización es la determinación del potencial de
oxidación, el cual según los resultados obtenidos fue 0.8V. Para la
inmovilización de enzimas, los electrodos fueron introducidos en una
solución 0.1 M PBS buffer pH 7.1 que contiene 50 mM fenol, 36.19
mg/mL HEX y 23.81 mg/mL GOx (glucosa oxidasa), las cuales sirven para
la construcción de la membrana bioactiva del sensor mediante
electropolimerización oxidativa de fenol con las enzimas atrapadas en el
polifenol. Para finalmente ser lavados con agua destilada y almacenados a
4°C en una solución PBS Buffer.
Lo esencial de este paso es la preparación de la solución con las enzimas,
las cuales son una solución compuesta de fenol disuelto en PBS y la
solución contiene las enzimas disueltas en PBS las cuales se dejarán que se
homogenicen las dos soluciones por difusión molecular.
4.4.4. Estudio del desempeño del componente GOx del biosensor.
Antes de empezar los experimentos, las soluciones a ser utilizadas fueron
burbujeadas con una mezcla 95% O2 / 5% CO2 durante 15 minutos. Las

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calibraciones fueron realizadas añadiendo varias alícuotas sucesivas de 0.5

M glucosa. Luego los experimentos fueron hechos durante 7 días para
estudiar la estabilidad a largo plazo de la glucosa oxidasa (GOx) en
respuesta a varias concentraciones de glucosa.
4.4.5. Caracterización del biosensor de ATP.
Antes de empezar los experimentos también se burbujeo a las soluciones
utilizadas con una mezcla de 95% O2 / 5% CO2 durante 15 minutos. Las
calibraciones del biosensor se dieron con una solución buffer de Krebs para
conservar la concentración de la glucosa esto debido a que la detección de
ATP está basada en una reacción competitiva entre la glucosa oxidasa
(GOx) y la hexoquinasa (HEX). Toda la calibración fue hecha en 5 días
para así tener un estudio a largo plazo del biosensor de ATP.
4.4.6. Análisis de datos.
En la investigación de la influencia del material transductor del
microelectrodo de un biosensor enzimático, los datos experimentales son
analizados de diferentes formas según la etapa o proceso que este. Como en
el análisis de la influencia del método de preparación de los
microelectrodos de los diferentes materiales propuestos, para su posterior
análisis de las áreas electroactivas, la determinación de del potencial de
detección del peróxido de hidrogeno y también estandarización de cada uno
de los biosensores, Todo esto se comparó con diseños al azar (ANOVA y
ANCOVA) con los cuales en comparación dio resultados de confianza muy
buenos para así determinar una mejor alternativa en el material transductor
para la construcción de biosensores enzimáticos de ATP.
5. Resultados y Análisis de Resultados.
5.1. Método de preparación de las pastas de carbono
Se estudia la influencia del método con el que se prepara las pastas de carbono,
utilizando como parámetros a la corriente de fondo (background) y ruido.

Tabla . Corrientes background y ruido para varios metales preparados para los
dos métodos.
Método Petri Mortero
Material
Grafito 32.58 ± 0.84 8.16 ± 0.04

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Carbón vítreo 37.14 ± 0.05 9.75 ± 0.19

Con los datos de la Tabla 2, se analiza en un diseño de varianza para un diseño

factorial AxB, donde A es el material transductor y factor B es el método
utilizado para preparar dicho material.

Según el análisis de varianza, no hay diferencias significativas al 95% en alguna

de las interacciones, se comprueba con la prueba de Fisher (LSD) por la amplia
sensibilidad del método.

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