Compendio Criterios Tecnicos 2020

COMISIÓN FEDERAL PARA LA
PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS

SANITARIOS
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y

AMPLIACIÓN DE COBERTURA
COMPENDIO DE CRITERIOS TÉCNICOS
Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Demarcación Territorial Tlalpan, Ciudad de México, C.P.14050 t: 55 50 80 52 00
DIRECTORIO
Dr. Jorge Alcocer Varela

Secretario de Salud
Dr. José Alonso Novelo Baeza

Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios
D. en C. Armida Zúñiga Estrada

Comisionada de Control Analítico y Ampliación de Cobertura
Q.F.B. Josefina Gutiérrez Ramírez

Directora Ejecutiva de Innovación
M. en I. Imelda Rocío Guzmán Cervantes

Directora Ejecutiva de Control Analítico
Primera revisión, Julio 2020.

Queda prohibida la reproducción total o parcial del presente documento.

Índice
A. Introducción ............................................................................................................................................................... 1
B. Objetivo ........................................................................................................................................................................ 2
C. Alcance ......................................................................................................................................................................... 2
D. Criterios......................................................................................................................................................................... 2
CCAYAC-CR-01/0 Criterios para la verificación de métodos de prueba
microbiológicos por la técnica del Número Más Probable. ................................................................ 3
CCAYAC-CR-03/0 Criterios para la verificación de métodos fisicoquímicos. ....................... 14
CCAYAC-CR-07/0. Criterios para la verificación, control de calidad interno y
expresión de resultados para la determinación de Clenbuterol por ensayo
inmunoenzimático........................................................................................................................................................ 33
CCAYAC-CR-08/1. Criterios para la verificación del método de prueba para la
detección de Brucella spp por PCR. ................................................................................................................. 45
CCAYAC-CR-12/1. Criterios de validez para el aislamiento e identificación de
amebas de vida libre en aguas de uso recreativo. .................................................................................. 61
CCAYAC-CR-13/1. Criterios para la verificación metrológica de balanzas. .............................. 65
CCAYAC-CR-14/0. Criterios para la verificación metrológica de material
volumétrico de vidrio................................................................................................................................................... 75
CCAYAC-CR-15/0. Criterios para la verificación metrológica de aparatos
volumétricos operados por pistón. .................................................................................................................... 87
CCAYAC-CR-18/0. Criterios para la verificación de métodos de prueba
microbiológicos para el análisis de alimentos. .......................................................................................100
CCAYAC-CR-19/0. Criterios para estimar la incertidumbre de la medición. .........................113
CCAYAC-CR-22/1. Criterios de validez para la determinación de Toxina
estafilocócica en alimentos por método inmunoenzimático con Kit Ridascreen
Set Total. ..............................................................................................................................................................................125
CCAYAC-CR-23/0. Criterios para la verificación metrológica de espectrómetros de
UV-Visible.............................................................................................................................................................................131
Agradecimientos............................................................................................................................................................ 143

A. Introducción
De conformidad con lo dispuesto en los artículos 3, fracción ,I, 4, fracción II, letra e y 16,
fracciones I, II, III y VIII, del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección Contra
Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura
(CCAYAC) es la responsable de realizar las pruebas analíticas de los productos sujetos a
control sanitario, específicamente en el artículo 16 del citado ordenamiento se establecen,
entre otras, las siguientes atribuciones:
“…
ARTÍCULO 16. Corresponde a la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura:
I. Establecer los lineamientos, criterios y procedimientos de operación aplicables al
control analítico de la condición sanitaria en las materias a que se refiere el artículo 3,
fracción I, del presente Reglamento;
II. Proponer las políticas, criterios, procedimientos y requisitos de operación para los
laboratorios de control fisicoquímico, microbiológico, biológico, farmacéutico o
toxicológico integrantes de la red nacional de laboratorios, del Sistema Federal Sanitario
(SFS) y, en general, para los Terceros Autorizados;
III. Definir y coordinar la aplicación de las políticas para la ampliación de cobertura a
través de laboratorios de prueba y unidades de verificación de Terceros Autorizados;
…
VIII. Coordinar las actividades de capacitación e investigación de laboratorios y unidades
de verificación a Terceros Autorizados y de la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública que constituyen la ampliación de cobertura;…” (Sic)
Por lo anterior la CCAYAC establece lineamientos, criterios y manuales de operación
aplicables al control analítico para coordinar, armonizar y fortalecer a la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública
El presente documento reúne los Criterios técnicos que sirven como base para la
elaboración de las verificaciones de métodos de prueba y verificaciones metrológicas de
instrumentos en cumplimiento con la normatividad vigente. La CCAYAC establece como
política que estos criterios deben ser establecidos en los laboratorios auxiliares de la
autoridad como los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) y Laboratorios Terceros
Autorizados.

Demarcación Territorial Tlalpan, Ciudad de México, C.P.14050
t: 55 50 80 52 00
1
Revisión 1
B. Objetivo
Establecer los criterios técnicos aplicables a métodos fisicoquímicos, microbiológicos e

inmunoquímicos para armonizar a la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública y
Laboratorios Terceros Autorizados, con la finalidad de asegurar la validez de los resultados
analíticos.
C. Alcance
Los criterios del presente documento deben ser aplicados por todos los laboratorios de
prueba integrantes de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública y Terceros
Autorizados que realizan determinaciones analíticas, establecidas en las normativas
vigentes, utilizando métodos fisicoquímicos, microbiológicos, inmunoquímicos y de
biología molecular
D. Criterios
A continuación se describen los criterios establecidos por la CCAYAC para ser aplicados a
los métodos fisicoquímicos, microbiológicos e inmunoquímicos.

t: 55 50 80 52 00
2
Revisión 1
CCAYAC-CR-01/0 Criterios para la verificación de métodos
de prueba microbiológicos por la técnica del Número Más
Probable (NMP).

t: 55 50 80 52 00
3
Revisión 1
CCAYAC-CR-01/0 Criterios para la verificación de métodos de prueba microbiológicos
por la técnica del Número Más Probable (NMP).
1. OBJETIVO.
1.1. Establecer los criterios para realizar la verificación de los métodos de prueba por
la técnica del Número Más Probable.
2. ALCANCE.
2.1. Estos criterios deberán ser utilizados en la evaluación de los métodos que tiene
como fundamento la técnica del Número Más Probable.
2.2. Este criterio presenta los requerimientos mínimos que deberán ser aplicados por
los Laboratorios Estatales de Salud Pública y a los laboratorios de ensayo Terceros
Autorizados, para la verificación de métodos microbiológicos basados en la
técnica del Número Más Probable.
3. DEFINICIONES.
3.1. Analito: para el caso de microbiología es el microorganismo de interés,
determinado por el método de análisis a utilizar.
3.2. Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que no está el analito de interés.
3.3. Coeficiente de Variación (CV): Es la relación entre la desviación estándar y la
media multiplicada por 100.
s
CV= ´100
x
3.4. Exactitud relativa o recuperación: Es la aproximación entre un resultado de la

prueba y el valor de referencia aceptado. Para el propósito de este compendio, es
la cantidad de microorganismos recuperado entre la cantidad de
microorganismo inoculado o nivel de fortificación.
3.5. Fortificación de la muestra: Inoculación de una cantidad conocida del o los
microorganismos de prueba.
3.6. Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición,
que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente
atribuidos al mesurando.
3.7. Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e
inferior, en el cual el microorganismo estudiado puede cuantificarse con un nivel
satisfactorio de repetibilidad y recuperación.
3.8. Límite de detección: Es el número más pequeño de microorganismos en una
muestra que puede ser detectado bajo las condiciones de análisis.
3.9. Matriz: Es la muestra en la que potencialmente se puede encontrar el analito.
3.10. Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de
microorganismos inoculados a una muestra.

t: 55 50 80 52 00
4
Revisión 1
3.11. Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos
individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a
diferentes porciones de la misma matriz, en las mismas condiciones de análisis
(analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo.
3.12. Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos
diferentes porciones de la misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de
medición (personal) y en diferentes tiempos (o a intervalos de tiempos más
largos).
4. RESPONSABILIDADES.
Los presentes criterios deben ser aplicados por los integrantes de la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública, los laboratorios Terceros Autorizados ante la
COFEPRIS y por los miembros del padrón de auditores y evaluadores.
5. CRITERIOS.
5.1. Criterios Generales

5.1.1. El presente documento comprende los criterios para la verificación de los
métodos de análisis basados en la técnica del Número Más Probable y
corresponde a los requerimientos mínimos que deben ser considerados en la
verificación.
5.1.2. Realizar un protocolo, el cual deberá ser emitido y aprobado antes de la
ejecución del mismo, siguiendo lo descrito en el Anexo 1.
5.1.3. Así mismo generar un informe de la evaluación en la cual se deberá incluir la
descripción de las actividades realizadas, enlistar medios, reactivos utilizados,
materiales y equipos calificados, calibrados y/o verificados utilizados,
rastreabilidad y los resultados obtenidos así como su aplicación de los criterios
de desempeño definidos y la conclusión de la misma, siguiendo lo descrito en
anexo 2.
5.1.4. La eficacia de la verificación de un método analítico, está de acuerdo a los
requerimientos definidos en el Sistema de Gestión de Calidad y conforme a la
NMX-EC-17025-IMNC-2018.
5.1.5. La aplicación de estos criterios es prospectiva. Se otorga un plazo de 180 días
contados a partir de la fecha de publicación para que los laboratorios que se
encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a ellos.
5.1.6. Para aquellos laboratorios que soliciten autorización posterior a la fecha de
publicación del presente, deberán cumplir con éstos desde el inicio.

t: 55 50 80 52 00
5
Revisión 1
5.2. Criterios para la verificación por cada lote de análisis
5.2.1. Preparar y analizar cultivos control para demostrar y asegurar el sistema de
trabajo.
5.3. Criterios para la verificación inicial del método.

5.3.1. Cada laboratorio debe contar con un programa de verificación, el cual debe
considerar los métodos, matrices y grupos de alimentos a evaluar.
5.3.2. Con fines de autorización se debe contar con la verificación en al menos una
matriz.
5.3.3. Para el alcance del presente documento se ha propuesto la siguiente
clasificación del producto de interés sanitario, basada en la experiencia
técnica y lo señalado en la ISO 16140.
Grupos de Productos Frutas y Productos

Cárnicos Aves
interés de la pesca Vegetales Lácteos
Crudos Crudos Crudos
Crudos Crudos
Procesados Procesados Procesados
Tipos de Procesados Procesados
Congelados Congelados Congelados
alimentos Congelados Congelados
Secos Secos Secos
Otros Otros
Otros Otros Otros
Pollo
Carne molida Nugets Moluscos Leche
Mango
Ejemplos de Guisados Milanesas Pescado Queso
Coctel
matriz Carne de Filete Leche en
congelada pollo Camarón polvo
congelado
5.3.4. Los criterios de selección de una matriz deben estar descritos y justificados en
cada protocolo, priorizando el tipo de producto y matriz representativa,
principalmente considerando de la mayor complejidad.
5.3.5. Las cepas empleadas deben ser las señaladas en la normatividad, también
pueden usarse cepas obtenidas de alimentos contaminados, las cuales deben
ser debidamente caracterizadas, para este propósito deben ser enviadas a
CCAYAC para su identificación, indicando en la solicitud el propósito de su
uso; adicionalmente el laboratorio, debe tener documentado las
características morfológicas macroscópicas de crecimiento en los diferentes
medios empleados.
5.4. Criterios específicos para la verificación del método de Número Más Probable.
5.4.1. La técnica del Número Más Probable se fundamenta en la observación de una
reacción positiva, tal como formación de gas, turbidez y fluorescencia cuando

t: 55 50 80 52 00
6
Revisión 1
aplique, la interpretación numérica en la técnica del Número Más Probable
corresponde a la probabilidad de detectar por lo menos una célula viable para
obtener resultados positivos en una dilución de la muestra, la combinación de
resultados positivos es interpretada como un número estadístico el cual se
emite con cierto grado de confianza, este grado de confianza usualmente es
reportado en las tablas de los métodos de referencia como el intervalo de
confianza, en otras palabras, el resultado obtenido como NMP, no
corresponde a un valor determinado, sino que este se encuentra distribuido
en el intervalo de confianza.
De lo anterior se concluye que la técnica del Número Más Probable, no se
considera como un método cuantitativo, sin embargo, si es conveniente
evaluar parámetros de precisión y exactitud que permitan demostrar la
veracidad de los resultados emitidos.
5.4.2. Se deben usar dos niveles de inóculo:
 Muestra sin inocular.
 Muestra inoculada con aproximadamente 1000 UFC/mL.
5.4.3. Para lo anterior, se describe el siguiente procedimiento, solo de carácter
informativo. A partir de tubos con agar sangre inclinado de la cepa de prueba
incubada a 35°C ± 2°C durante 24 h. Cosechar el crecimiento con 9 mL de
Solución salina 0.85%, teniendo cuidado de no llevar consigo el agar, regresar
esta suspensión a un tubo estéril a partir del cual se realizaran diluciones
seriadas hasta obtener la dilución 10-8. De las diluciones 10-6, 10-7, 10-8; inocular
por duplicado en cajas Petri un volumen de 1 mL.
Incubar las placas por 24h y seleccionar la dilución de trabajo la cual deberá
cumplir con las siguientes características:
 La dilución primaria 1:10 (25 g de muestra + 225 mL del diluyente) deberá
aproximarse a 1000 UFC / mL.
 La probabilidad de obtener resultados positivos:
 10-1 entre 10 y 100 UFC / mL (100% de positivos)
 10-2 entre 1 y 10 UFC / mL (10 % de positivos)
 10-3 entre 1 y 0 UFC / mL (1% de positivos)
5.4.4. Número de cepas
5.4.4.1. Deben usarse cepas control positivo las cuales son aquellas de propósito
de interés del método y controles negativos que serán aquellas indicadas
en el método de prueba o en su defecto las que se mencionen como biota
acompañante o que se puedan considerar como interferentes de
microorganismo control positivo.
5.4.5. Criterios de aceptación para muestras
5.4.5.1. Para determinar si el método cumple con la probabilidad de que el

95% de las muestras caen en el intervalo de confianza establecido en
la tabla de NMP; tomando como referencia, la inoculación de una

t: 55 50 80 52 00
7
Revisión 1
muestra, sin matriz del alimento con el microorganismo positivo
previamente estandarizado. Seguir como 5.4.6.
Descripción
Así mismo inocular en cajas Petri por duplicado cada una de
Verificación del tamaño
las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 de 6 muestras para asegurarse de
del inoculo
que la estandarización del inoculo fue correcta. Ver 6.4.2
Numero de repeticiones: 3
Verificación de la
Analistas: uno
muestra
Resultados positivos: 0%
Coeficiente de Variación No debe ser mayor a un 15%
Número de repeticiones: 10
Repetibilidad Número de analistas: uno
Resultado: r < 32%
Número de repeticiones: por lo menos 10 por analista
Reproducibilidad Número de analistas: dos
Resultado: R < 32%
a) Enlistar los factores de incertidumbre en el método.
Incertidumbre
b) Realizar cálculos para la incertidumbre combinada
5.4.6. Cálculos
5.4.6.1. Para determinar el intervalo de confianza que se tomará como referencia para
la verificación, es necesario considerar el análisis de una muestra sin matriz; es
decir sólo con el diluyente (Solución reguladora de fosfatos) y caldos (lactosado,
caldo lauril simple, etc,) inoculado con la cepa control positivo; manejándola en
las mismas condiciones que las muestras de ensayo.
5.4.6.2. Por ejemplo; al obtener el resultado de la lectura tenemos la combinación: 310,

obteniendo el siguiente resultado:
Tabla I.1. Número Más Probable por gramo de muestra e intervalo de confianza del
95%, utilizando 3 tubos con 0.1, 0.01 y 0.001 g de muestra
Tubos positivos NMP/g Límite de confianza
0.1 0.01 0.001 Inferior Superior
3 2 1 150 37 420
5.4.6.3. Por lo que el 95% de las muestras analizadas en el ensayo deberán estar dentro
del límite de confianza definido en la tabla, para este ejemplo, sería entre 37 y
420 NMP/g

t: 55 50 80 52 00
8
Revisión 1
5.4.7. Repetibilidad
5.4.7.1. Calcular el logaritmo del resultado obtenido en las tablas correspondientes

tomadas en el método de prueba a evaluar. Calcular en seguida el promedio
que se expresa como la suma de los logaritmos entre el número total de
muestras:
𝑙𝑜𝑔
𝑥=
𝑛
5.4.7.2. Calcular la Desviación Estándar (σ) para obtener el coeficiente de variación:
𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
𝐶. 𝑉. =
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
5.4.7.3. Utilizando los valores anteriores, considerar la aplicación de la siguiente

fórmula:
r = RSD * 2.8
Por ejemplo:
Calcular las UFC en cada repetición y calcular el logaritmo.
Coeficiente
Resultado Logaritmo Desviación
Repetición Promedio Varianza de
NMP del NMP estándar
Variación %
1 150 2.1760
2 93 1.9684
3 230 2.3617
4 230 2.3617
5 230 2.3617
2.1990 0.1592 0.0253 7.239
6 230 2.3617
7 150 2.1760
8 120 2.0791
9 93 1.9684
10 150 2.1760
5.4.8. Reproducibilidad
Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes
procederán como se describió anteriormente, considerando la aplicación de prueba de t
pareada y estimar que no existen diferencias estadísticamente significativas entre
analistas

t: 55 50 80 52 00
9
Revisión 1
Desviación Coeficiente de
Promedio de
Analista Promedio estándar de Varianza Variación de
Promedios
Promedios promedios %
A 7.655
B 7.921 0.1823 0.0332 7.86 2.31
C 8.004
5.4.9. Criterios específicos para el cálculo de la incertidumbre.

5.4.9.1. Mencionar las fuentes de incertidumbre:
 Distribución de los microorganismos en la muestra;
 Efecto de la matriz;
 Personal operativo;
 Mediciones (pesada o medición de la muestra);
 Diluciones y volúmenes;
 Homogeneización;
 Calidad de los medios;
 Tiempo hasta la inoculación;
 Temperatura de incubación;
5.4.10. Incertidumbre combinada
U¢ = √𝑆𝑅 2 + 𝑆𝑟 2
Dónde U¢: SR y Sr es la raíz de las varianzas totales de repetibilidad y reproducibilidad
6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA.
Documentos Clave
6.1 Catálogo Oficial de Medios de Cultivo CCAYAC-CT-07
Método General para la preparación y dilución de muestras de
6.2 CCAYAC-M-151
alimentos para análisis.
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Requisitos Generales para la Competencia de los laboratorios de ensayo y calibración
7.1
NMX-EC-17025-IMNC-2018
Guidelines for the validation of analytical methods for the detection of
7.2
microbiological pathogens in food and Feeds. 2da. Edition, FDA. April 2015

t: 55 50 80 52 00
10
Revisión 1
Documentos
Dulce Toccheto S. Curso-teórico-práctico Validación de Métodos Microbiológicos
7.3 bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia.
Proyecto TCC/ Bolivia-México. 2007.
European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological
7.4
laboratories. 2002.
Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos
7.5
Farmacéuticos Biólogos de México, A.C. Edición 2002.
ISO/TR 13843:2000 - Water Quality — Guidance on Validation of Microbiological
7.6
methods. First Edition.
ISO 17994:2004 Water Quality—Criteria for Establishing Equivalence between
7.7
Microbiological methods. First Edition.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
7.8 Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en
http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)
Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods
Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food
7.9 Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf
(febrero 2011)
8. ANEXOS.
Anexo 1.- Estructura del protocolo
Anexo 2.- Elaboración del informe

t: 55 50 80 52 00
11
Revisión 1
Anexo 1
Estructura del protocolo
La estructura para la elaboración del protocolo para la verificación de métodos de análisis

microbiológicos:
Contenido Descripción
Protocolo para la verificación del método: el nombre y clave del
Título
método que se pretende evaluar.
Considerar características de desempeño para la verificación a
1.Objetivo
evaluar y el microorganismo a determinar
2. Campo de
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la verificación.
aplicación
3. Método de
Citar el método de prueba interno, el método de referencia
ensayo
4. Equipos e
Nombre del equipo y/o instrumento a utilizar
Instrumentos
5. Materiales Indicar los materiales a utilizar
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
6. Reactivos y b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
Medios de Cultivo c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los
inóculos
Indicar las características, forma de almacenamiento y cantidades
de muestra estimadas para llevar a cabo la verificación del
7. Muestras método.
Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras
adicionadas.
8. Desarrollo Detallar las instrucciones para cada uno de los características de
experimental desempeño de verificación a ensayar.
9. Resultados Formato para el registro de resultados
10. Análisis Establecer para cada característica de desempeño la herramienta
estadístico estadística a utilizar para su evaluación.
11. Criterios de Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su
aceptación respectiva referencia bibliográfica.
Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.

t: 55 50 80 52 00
12
Revisión 1
Anexo 2
Elaboración del informe
Estructura del informe de verificación
Parámetro Descripción
Informe de resultados de la verificación del método: el nombre y
Título
clave del método que se evalúo.
Considerar los parámetros de verificación evaluados y el analito
1.Objetivo
determinado.
2. Campo de
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la validación
aplicación
Nombre del equipo y/o instrumento a utilizar; clave interna de
3. Equipos e
identificación, e indicar los servicios de calibración, verificación y/o
Instrumentos
calificación, mantenimiento preventivo según sea el caso.
4. Materiales Listado de los materiales utilizados.
5. Reactivos y Medios
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.
de cultivo
Listar las cepas utilizadas y en número de colección (ATCC) con su
6. Cepas
respectiva hoja de identidad y aseguramiento de calidad.
Indicar las características, forma de almacenamiento, marca,
presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para
7. Muestras llevar a cabo la verificación.
adicionadas utilizadas.
8. Desarrollo Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los
experimental parámetros de desempeño.
Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas de
9. Resultados inicio y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba,
matriz, unidades y clave de bitácora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados
10. Discusión de los
y los resultados obtenidos y hacer las observaciones
resultados
correspondientes.
Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método se
11. Conclusión
ajusta al uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
12. Bibliografía Referencias utilizadas.
 Los que aplique:  Medios de cultivo
 Registros primarios,  Cepas
13. Anexos
 Bases de datos utilizadas  Formatos de verificación,
 Certificados de equipos  Gráficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.

t: 55 50 80 52 00
13
Revisión 1
CCAYAC-CR-03/0 Criterios para la verificación de métodos
fisicoquímicos.

t: 55 50 80 52 00
14
Revisión 1
CCAYAC-CR-03/0 Criterios para la verificación de métodos fisicoquímicos.
1. OBJETIVO.
Establecer los criterios mínimos para llevar a cabo actividades de verificación de métodos
fisicoquímicos.
2. ALCANCE.
Aplica a las pruebas fisicoquímicas empleadas en el análisis de agua, alimentos, juguetes,

cerámicas, loza vidriada, bebidas alcohólicas, bebidas no alcohólicas y formulaciones de
fertilizantes y plaguicidas.
3. DEFINICIONES.
3.1 Analito: Componente específico de una muestra, a medir en un análisis.

3.2 Blanco de reactivos: Reactivos usados durante el proceso analítico (incluyendo los
solventes usados en la extracción o disolución) los cuales son analizados para
garantizar que la medición no es influenciada por los materiales utilizados durante
el análisis.
3.3 Blanco de muestra: Son matrices que no contienen el analito de interés. Son
difíciles de obtener pero son necesarios para estimar las interferencias que
pudieran encontrarse durante el análisis de las muestras de prueba.
3.4 Criterios de aceptación: Parámetros bajo los cuales el resultado de una prueba
será considerado aceptable.
3.5 Curva de calibración: Es la representación gráfica de la señal medida como una
función de cantidad del analito.
3.6 Incertidumbre: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores
atribuidos a un mensurando, a partir de la información que se utiliza.
3.7 Informe de verificación o validación: Es un documento en el que los registros, los
resultados y la evaluación completa del proceso de verificación o validación están
ensamblados y resumidos.
3.8 Intervalo de confianza: Intervalo en torno al valor estimado que contiene el valor
real con una probabilidad determinada.
3.9 Intervalo de trabajo: Intervalo en el cual el método proporciona resultados con
una incertidumbre aceptable.
3.10 Intervalo lineal: Es la capacidad de un método para dar una respuesta analítica
que es directamente proporcional a la concentración del analito en la muestra
dentro de un intervalo dado.
3.11 Límite de cuantificación: Es el nivel mínimo de analito que puede ser
determinado con precisión y veracidad o incertidumbre de medición aceptables.

t: 55 50 80 52 00
15
Revisión 1
3.12 Límite de detección: Es el nivel en el cual la detección del analito se vuelve
problemática.
3.13 Método normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones
en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones
en los resultados.
3.14 Método no normalizado: Método alternativo que demuestra o estima el mismo
analito tal cual se mide utilizando el método normalizado.
3.15 Protocolo de verificación o validación: Documento que describe las actividades
para llevar a cabo la verificación o validación, incluyendo los criterios de aceptación
para la aprobación del método de prueba.
3.16 Muestra adicionada: Porción representativa del material a evaluar, a la que se le
adicionan cantidades conocidas del analito de interés.
3.17 característica de desempeño: Parámetro específico a evaluar en una verificación
o validación interna del método.
3.18 Precisión intermedia: Variación en los resultados cuando las mediciones se
realizan en un solo laboratorio pero en condiciones que son más variables que las
condiciones de repetibilidad.
3.19 Recuperación: Cantidad del analito recuperada en la porción de muestra o
muestra adicionada cuando esta es conducida a través del método analítico
completo, y que permite evaluar la eficiencia de la extracción, proceso de
preparación e interferencias que puedan existir al aplicarlo. Se expresa en
términos de porcentaje.
3.20 Repetibilidad: Variabilidad en los resultados cuando una medición se lleva a cabo
por un solo analista utilizando el mismo equipo en un corto plazo de tiempo.
3.21 Respuesta analítica: Lectura obtenida al aplicar un método analítico, como
pueden ser el área o altura del pico en un cromatograma, lectura de absorbancia,
cuentas de iones en un espectro de masas, lectura en mV, mL gastados en
volumetría, diferencia de peso en un gravimétrico, entre otros.
3.22Resultado de ensayo: Valor de un mensurando obtenido tras la realización de un
método de ensayo específico.
3.23Robustez: Es la medida de la capacidad del método analítico de permanecer no
afectado por pequeñas variaciones premeditadas de los parámetros del método.
3.24 Selectividad: Grado en el que un método puede ser utilizado para determinar
analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencia de otros componentes
de comportamiento similar.
3.25Sensibilidad analítica: Es la variación de la respuesta del instrumento que
corresponde a una variación de la magnitud de medida (por ejemplo una
concentración del analito), es decir el gradiente de la curva de respuesta.
3.26 Sesgo: Es una expresión de la proximidad de la media de un número infinito de
resultados (producidos con el método) a un valor de referencia.
3.27 Verificación: Aportación de evidencia objetiva de que un ítem dado satisface los
requisitos especificados.

t: 55 50 80 52 00
16
Revisión 1
Laboratorios de Salud Pública, los laboratorios Terceros Autorizados ante la COFEPRIS y
por los miembros del padrón de auditores y evaluadores.
Estos criterios aplican para métodos que hayan sido verificados posteriores a la fecha de
publicación de este documento.
5. CRITERIOS.
5.1 Criterio No. 1.- Clasificación del método
5.1.1 Se consideran métodos normalizados a los publicados en:
 Normas Oficiales Mexicanas (NOM)
 Normas Mexicanas (NMX)
 Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (SMWW)
 Environmental Protection Agency (EPA)
 Pesticide Analytical Manual (PAM)
 Collaborative International Pesticides Analytical Council (CIPAC)
 American Society for Testing Materials (ASTM)
 International Organization for Standarization (ISO)
 European Standards (EN)
 British Standards (BS)
 Food and Drug Administration (FDA)
 Food and Agriculture Organization (FAO)
 European Commission (CE)
 United States Department of Agriculture (USDA)
 Nordic Committee on Food Analysis (NKML)
 American Oil Chemists Society (AOCS)
 International Association for Cereal Science and Technology (ICC)
 International Dairy Federation (IDF)
 Standard Methods for the Examination of Dairy Products
5.1.2 Se considera un método no normalizado al desarrollado por el laboratorio o un
método nuevo publicado en revistas científicas o notas técnicas.
5.1.3 Los métodos para propósitos de verificación se clasifican como:

t: 55 50 80 52 00
17
Revisión 1
Categoría Tipo de prueba Analito
Cuantificación del Aditivos
I
analito Nutrientes
Metales pesados
Residuos orgánicos
Cuantificación del Micotoxinas
II
analito a nivel trazas Biotoxinas
Residuos veterinarios contaminantes
Plaguicidas
Formaldehído
Presencia del analito a Sales cuaternarias
III
un límite (prueba límite) Oxidantes,
Derivados clorados
Grado alcohólico
Color
Turbiedad
IV Física cuantitativa
Conductividad
pH
Humedad, etc.
Nota: No se requiere la verificación ni la validación interna de métodos para materia
extraña.
5.2 Criterio No. 2.- Verificación del método
5.2.1 La verificación se lleva a cabo cuando:

 Se utilizan métodos normalizados.
 Se hacen modificaciones al método normalizado y se demuestra que no hay
diferencia significativa.
 Hay cambios importantes, como el uso de un equipo nuevo (pero similar),
traslado de equipos, etc.
5.2.2 Las características de desempeño (dependiendo del tipo de prueba) para llevar a
cabo la verificación del método son:

t: 55 50 80 52 00
18
Revisión 1
Categoría
I II III IV
Parámetro
Contenido Trazas Límite Física
Intervalo lineal SI SI NO NO
Intervalo de trabajo SI SI NO NO
Límite de detección NO NO SI NO
Límite de cuantificación NO SI NO NO
Recuperación SI SI NO NO
Sesgo SI SI NO NO
Repetibilidad SI SI NO SI
Precisión intermedia SI SI NO SI
Incertidumbre SI SI NO SI
Selectividad NO NO SI NO
5.2.3 Para las pruebas físicas cuantitativas y conforme a los requerimientos del método
se requiere además:
 Verificar el desempeño del equipo.
 El uso de materiales de referencia cuando aplique.
 Conformidad de las instalaciones y condiciones ambientales del laboratorio.
5.3 Criterio No. 3.- Selección de la matriz

5.3.1 Para métodos individuales usar la matriz más solicitada o la más compleja y
considerar todos los analitos señalados en el método.
5.3.2 Para métodos generales como por ejemplo residuos orgánicos, metales
contaminantes, plaguicidas, etc., y que apliquen a diferentes matrices, se debe
seleccionar una matriz representativa por grupo:
 Para alimentos de origen vegetal:
Grupo Categoría
Alto contenido de humedad Frutas y vegetales
Bajo contenido de humedad Granos de cereales
Alto contenido de grasa Semillas oleosas y nueces
Alto contenido ácido Frutas cítricas
Alto contenido de azúcar Frutas secas, miel
Difíciles Lúpulo, miel, café, cocoa y sus productos, té, especias

t: 55 50 80 52 00
19
Revisión 1
 Para alimentos de origen animal:
Grupo Categoría
Carne roja
Carne blanca
Carne Pescado
Menudencia
Grasa de carne
Leche
Queso
Leche y sus productos Yogurt
Crema
Mantequilla
Huevos Huevo
Miel Miel
5.3.3 Para métodos multiresiduos, si estos consideran más de 20 analitos, puede
elegirse un número de analitos representativos con base en la probabilidad de
encontrarlos como residuos en las muestras y a sus propiedades fisicoquímicas,
como por ejemplo los que den la respuesta más pobre o más variable.
5.4 Criterio No. 4.-Preparación de muestras
5.4.1 Preparar blancos de muestra o muestras en una cantidad equivalente a la

indicada por el método.
5.4.2 Cuando no se dispone de un blanco de muestra, determinar el contenido
promedio del analito en una muestra comercial analizada como mínimo 6 veces.
Preparar estas muestras utilizando una cantidad equivalente a la mitad de la
muestra original establecida por el método y adicionar diferentes niveles de
concentración de estándar hasta obtener la concentración deseada.
5.4.3 Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la
adición puede ser llevada a cabo en alguna etapa del método, de preferencia en
las primeras etapas.
5.4.4 Los blancos de muestras o muestras adicionadas deben ser preparados por un
mismo analista.
5.4.5 Para la evaluación de las pruebas físicas cuantitativas no se utilizan muestras
adicionadas, estas se utilizan con el contenido original de analito (muestras reales).
5.5 Criterio No. 5.-Evaluación de las características de desempeño

5.5.1 Intervalo lineal
a) Preparar por triplicado y de forma independiente, blancos de muestra o muestras
adicionadas con 5 niveles diferentes de concentración del analito de interés.

t: 55 50 80 52 00
20
Revisión 1
b) Para establecer el intervalo de concentraciones apropiado, considerar alguna de
las siguientes opciones dependiendo de la metodología:
 El valor de la especificación (en la medida de lo posible como nivel medio de
dicho intervalo)
 El intervalo de la curva de calibración, aun cuando los niveles de concentración
no coincidan con las concentraciones puntuales.
c) Analizar las muestras preparadas aplicando el método de ensayo específico bajo
las mismas condiciones y, determinar la respuesta analítica para cada nivel de
concentración añadido.
d) Graficar los valores de respuesta analítica obtenida (eje y) en función de cada uno
de los valores de concentración añadida (eje x). Verificar de manera visual la
existencia de linealidad de los datos.
e) Calcular la pendiente (m) y la ordenada al origen (b) y con estos datos determinar
el valor de la respuesta analítica ajustada (y´) para cada valor de concentración,
empleando la siguiente ecuación:
y´ = mx + b
f) Calcular para cada nivel de concentración, los valores residuales (diferencia entre el
valor de la respuesta analítica obtenida (y) y el valor calculado por medio de la
curva ajustada (y´).
g) Graficar el valor residual (eje y) en función de su concentración correspondiente
(eje x). Verificar la dispersión de los datos.
h) Reportar el intervalo lineal obtenido considerando las unidades de concentración
establecidas por el método.
Criterios de aceptación
Prueba Criterio de aceptación
Verificación visual de comportamiento
Gráfico de linealidad lineal en el gráfico de respuesta analítica vs
concentración
Distribución aleatoria de los puntos
Gráfico de residuales
alrededor de la recta
5.5.2 Intervalo de trabajo
a) Con los datos de respuesta analítica obtenidos en la prueba de linealidad, calcular

la cantidad del analito para cada uno de los niveles añadidos. Obtener el % de
recuperación aplicando la siguiente fórmula:
Cf
% Re cobro  *100
Dónde: Ca
Cf = Concentración recuperada en el blanco de muestra o muestra
adicionadas.

t: 55 50 80 52 00
21
Revisión 1
Ca = Concentración adicionada al blanco de muestra o muestra
b) Calcular para cada nivel de concentración, el promedio, la desviación estándar, la

desviación estándar relativa y el valor de HorRat de cada uno de los valores de
recuperación.
c) Verificar que todos los niveles de concentración cumplan con los criterios de
aceptación establecidos para recuperación y valor de HorRat ≤ 2.
d) Graficar los datos de concentración recuperada (eje y) en función de la
concentración adicionada (eje x). Calcular el coeficiente de correlación y el intervalo
de confianza de la pendiente.
e) Reportar el intervalo de trabajo obtenido conforme considerando las unidades de
concentración establecidas por el método.
*Coeficiente de correlación 0.98 a 1.00
*Intervalo de confianza de la pendiente Debe incluir el valor de la unidad
*Utilizar estos criterios como una guía y no de forma rígida. En algunos casos como en el
análisis de matrices complejas, analitos a nivel trazas y métodos multiresiduales pudieran
no ser cumplidos. Debe hacerse una discusión y documentarlo en el análisis de
resultados.
5.5.3 Límite de cuantificación

a) Considerar como límite de cuantificación práctico (LCP) el nivel inferior del
intervalo de trabajo calculado.
b) Reportar en las unidades de concentración establecidas por el método.
5.5.4 Límite de detección (aplica para categoría III)

a) Preparar 10 réplicas independientes de muestras adicionadas a 5 diferentes niveles
de concentración.
b) Analizar las muestras y establecer como límite de detección la concentración
mínima en la cual los 10 resultados son positivos.
5.5.5 Recuperación y sesgo

a) Con los datos de recuperación obtenidos en la determinación del intervalo de
trabajo, determinar el intervalo de confianza del % de recuperación.
b) Reportar el intervalo de % de recuperación obtenido.
a) Recuperación

t: 55 50 80 52 00
22
Revisión 1
b) El intervalo establecido en la referencia original del método o utilizar como guía la
siguiente tabla:
Concentración Unidades Recuperación (%)
100% 100 g/100 g o mL 98-102
10% 10 g /100 g o mL 95-102
1% 1 g /100 g o mL 92-105
0.10% 1 mg/g o mL 90-108
100 ppm 100 mg/kg o L 85-110
10 ppm 10 mg/kg o L 80-115
1 ppm 1 mg/g o L 75-120
100 ppb 100 µg/kg o L 75-120
10 ppb 10 µg/kg o L 60-120
1 ppb 1 µg/kg o L 40-120
c) Sesgo
El intervalo de confianza del % de recuperación debe incluir el valor de 100 % para

establecer que el método no presenta sesgo
5.5.6 Repetibilidad y precision intermedia

a) Preparar por triplicado muestras adicionadas a las concentraciones
equivalentes a los niveles inferior, medio y superior del intervalo de trabajo
obtenido.
b) Realizar el análisis con otro analista diferente o en un día diferente si solo se
dispone de un analista. Si más de dos analistas participan en el ensayo,
considerarlos en la evaluación de este parámetro. Obtener el % de recobro
de los resultados.
c) Utilizar los resultados de % de recuperación obtenidos en la prueba de
intervalo de trabajo para los niveles inferior, medio y superior, como los
datos para el analista 1 o día 1 según sea el caso.
d) Efectuar el análisis de ANOVA de un factor. Verificar la significancia
estadística.
e) Calcular la media de los todos los datos, las desviaciones estándar relativas
de la repetibilidad (RSDr) y precisión intermedia (RSDpi) para métodos físicos
y los valores de HorRat para métodos fisicoquímicos

t: 55 50 80 52 00
23
Revisión 1
Concentración Unidades Razón PRSDr
100% 100 g/100 g o mL 1 1
10% 10 g /100 g o mL 0.1 1
1% 1 g /100 g o mL 0.01 2
0.10% 1 mg/g o mL 0.001 3
100 ppm 100 mg/kg o L 0.0001 4
10 ppm 10 mg/kg o L 0.00001 6
1 ppm 1 mg/g o L 0.000001 8
100 ppb 100 µg/kg o L 0.0000001 11
10 ppb 10 µg/kg o L 0.00000001 15
1 ppb 1 µg/kg o L 0.000000001 15
PRSDr = Valor previsto para la desviación estándar relativa de la repetibilidad y precisión
intermedia.
Valor de HorRat ≤2
RSDr Conforme a lo establecido en la referencia
RSDpi del método
5.5.7 Incertidumbre
Estimar la incertidumbre del método conforme a lo señalado en el documento CCAYAC-

CR-19 “Criterios para estimar la incertidumbre de medición”
5.6 Criterio No. 6.- Protocolo de verificación

a) Elaborar un protocolo que incluya lo siguiente:
Protocolo de verificación (según aplique). Señalar asimismo el
Título
nombre y clave del método que se pretende verificar.
Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito
1. Objetivo
a determinar
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la
2. Campo de aplicación
verificación o validación
Elaborar un diagrama de flujo simplificado, que señale la
3. Método de ensayo
metodología empleada para cuantificar el analito (método

t: 55 50 80 52 00
24
Revisión 1
interno)
4. Equipo Nombre del equipo y/o instrumento a utilizar
Indicar los materiales a utilizar separando como material de
5. Materiales
uso general y material volumétrico
 Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
 Señalar los materiales de referencia a utilizar con su
grado de pureza o concentración.
 Detallar la preparación de las disoluciones de trabajo
6. Reactivos (disoluciones que no requieren de un valor de título
exacto).
 Detallar la preparación de las disoluciones de referencia
(disoluciones que requieren de un título exacto,
disoluciones stock, curva de calibración, etc.).
 Indicar las características, forma de almacenamiento y
cantidades de muestra estimadas para llevar a cabo la
7. Muestras validación.
 Detallar los cálculos para la preparación de los blancos
de muestra o muestras adicionadas.
8. Desarrollo Detallar las instrucciones para cada uno de los parámetros de
experimental desempeño a ensayar.
9. Resultados Propuesta de formato de registro
10. Criterios de Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con
aceptación su respectiva referencia bibliográfica
b) Debe incluir las características de desempeño de acuerdo al tipo de prueba para
los diferentes tipos de procedimientos analíticos y los criterios de aceptación
predeterminados.
c) Debe tener firmas de elaborado, revisado y aprobado previo a su uso y en su caso
los cambios efectuados antes de su implementación.
5.7 Criterio No. 7.- Informe de resultados

a) Elaborar un informe de resultados que incluya lo siguiente:
Informe de resultados de verificación. Señalar asimismo el
Título
nombre y clave del método que se verificó.
Considerar los parámetros de desempeño evaluados y el analito
1. Objetivo
determinado.
2. Campo de Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la
aplicación verificación
Descripción del nombre, marca, modelo, número de serie,
3. Equipo
número de identificación e intervalo de trabajo del equipo

t: 55 50 80 52 00
25
Revisión 1
utilizado en la verificación.
Descripción de:
 Nombre, marca y lote del material de uso general
4. Materiales utilizado.
 Nombre, marca, clave, volumen nominal y volumen real
del material volumétrico empleado
 Indicar el nombre, marca, grado, pureza, presentación y
lote de los reactivos utilizados
 Indicar el nombre, marca, pureza o concentración,
presentación y lote de los materiales de referencia
utilizados.
 Detallar la preparación de las disoluciones de trabajo
5. Reactivos
(disoluciones que no requieren de un valor de título
exacto) que se emplearon
 Detallar la preparación de la disoluciones de referencia
(disoluciones que requieren de un título exacto,
disoluciones stock, curva de calibración, etc.) que se
utilizaron.
 Indicar las características, forma de almacenamiento,
marca, presentación, caducidad y cantidades de muestra
6. Muestras utilizadas para llevar a cabo la verificación.
 Detallar la preparación de los blancos de muestra o
muestras adicionadas utilizados.
Elaborar un diagrama de flujo simplificado, que señale la
7. Método de ensayo metodología empleada para cuantificar el analito (método
interno)
8. Desarrollo Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de las
experimental características de desempeño.
Presentación de resultados en forma de tablas, señalando
9. Resultados fechas de inicio y término, analistas, laboratorio, analito, matriz,
unidades y clave de bitácora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación
10. Análisis de
considerados y los resultados obtenidos y hacer las
resultados
observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método
11. Conclusión
se ajusta al uso propuesto
12. Bibliografía Referencias utilizadas.
Los que aplique:
13. Anexos
 Bases de datos utilizadas
 Cromatogramas, espectros, resultados impresos, etc.

t: 55 50 80 52 00
26
Revisión 1
 Certificados de análisis o pureza.
 Certificados de trazabilidad
 Certificados de calibración de material.
 Formatos de verificación de material
 Gráficos de control, etc.
b) Los resultados deben ser evaluados, analizados y comparados contra los criterios
de aceptación establecidos en el protocolo. Los resultados deben ser acordes con
estos criterios establecidos.
c) La conclusión del informe debe indicar si los parámetros fueron acordes y por
tanto el método puede utilizarse. Si los resultados no cumple con los criterios de
aceptación, se debe realizar una investigación y estos pueden ser aceptados si son
justificados.
d) Debe tener firmas de elaborado, revisado y aprobado.
e) El informe debe actualizarse y complementarse cuando haya un cambio en la
normativa aplicable, y en el equipo o personal que efectuó originalmente la
verificación.
Documentos Clave
6.1 Criterios para estimar la incertidumbre de medición CCAYAC-CR-19

t: 55 50 80 52 00
27
Revisión 1
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
AOAC, 2013 Appendix K: Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals. Part I.
7.1 Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary
Supplements and Botanicals.http://www.eoma.aoac.org/app_k.pdf
Comisión del Codex Alimentarius, 2018. Manual de Procedimiento. Vigésima sexta
edición.http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/sh-
7.2
proxy/en/?lnk=1&url=https://workspace.fao.org/sites/codex/Shared%20Documents/P
ublications/Procedural%20Manual/Manual_26/PM262018s.pdf
Directiva 2002/657/CE. Funcionamiento de los Métodos Analíticos y la
Interpretación de los Resultados. Diario Oficial de las Comunidades Europeas
7.3
https://eur-lex.europa.eu/legal
content/ES/TXT/PDF/?uri=CELEX:32002D0657&from=ES
Entidad Mexicana de Acreditación, 2018. Manual de Procedimientos. Criterios de
Aplicación de la Norma ISO/IEC-17025 (vigente). MP-FE005-13.
7.4
http://consultaema.mx:75/pqtinformativo/GENERAL/PMR/11_MP-FE005_Criterios_EC-
17025.pdf
Eurachem, 2016. La Adecuación al Uso de los Métodos Analíticos. Una Guía de
Laboratorio para Validación de Métodos y Temas Relacionados. Primera Edición
7.5
Española.https://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/MV_guide_2nd_ed_
ES.pdf
European Commission. Guidance document on analytical quality control and
validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed.
7.6 SANTE/11813/2017.
https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/pesticides_mrl_guidelines_wrkd
oc_2017-11813.pdf
Food  Drug Administration, 2015. Guidelines for the Validation of Chemical
7.7 Methods for the FDA FVM Program. Second edition.
https://www.fda.gov/downloads/scienceresearch/fieldscience/ucm298730.pdf
Miller N. James and Miller C. Jane, 2010. Statistics and Chemometrics for Analytical
7.8
Chemistry. Sixth Edition.
7.9 NMKL, 2009. Validación de métodos de análisis químicos. Procedimiento No. 4
NMX-EC-17025-IMNC-2018. Requisitos generales para la competencia de los
7.10
laboratorios de ensayo y calibración
Thompson M., Ellison L.R. and Wood R, 2002. Harmonized Guidelines for Single
Laboratory Validation of Methods of Analysis (IUPAC Technical Report). Appl. Chem.,
7.11 Vol. 74, No.5, pp. 835-
855.http://www.nifdc.org.cn/directory/web/WS02/images/SVVQQUMgbWV0aG9kIHZ
hbGlkYXRpb24ucGRm.pdf

t: 55 50 80 52 00
28
Revisión 1
8. ANEXOS.
Anexo 1. Fórmulas estadísticas

Anexo 2. ANOVA

t: 55 50 80 52 00
29
Revisión 1
Anexo 1.
Fórmulas estadísticas
Media _
x
x
n
2
 

Desviación estándar (s)  x  x
s  
n  1
Desviación estándar relativa (% s
RSD) % RSD  
*100
x
Pendiente (m) n  xy   x  y
m
n  x 2   x 
2
Coeficiente de correlación (r) r

n xy    x  y
n x    x  n y    y 
2 2 2 2 1/ 2
Media general (x)


x1  x 2  x 3  x 4  .....  x n
x n
Desviación estándar de la
repetibilidad (sr) s r  MSd
Desviación estándar relativa de sr
la repetibilidad (RSDr) RSD r  _
*100
x
precisión intermedia (sPI) si 
MS  MS
e d s PI  s s
2
r
2
i
n
Desviación estándar relativa de s PI
la precisión intermedia (RSDPI) RSD PI  _
*100
x
Intervalo de confianza (IC) s
IC  promedio  t (0.025,n-1) *
n
Desviación estándar de la 1
pendiente (sb1) sb1  s y/x
( x) 2
x  n
2

t: 55 50 80 52 00
30
Revisión 1
regresión (sy/x) s y/x 
y 2
 b1  xy  b o  y
n2
Intervalo de confianza de la IC(b1 )  b1  t (0.025,n-2) * sb1

pendiente IC(b1)
_
valor sospechoso  x
Estadístico G
G
s
Valor de HorRat RSDr
HorRat=
PRSDr

t: 55 50 80 52 00
31
Revisión 1
Anexo 2.
ANOVA
ANOVA (repetibilidad y precisión intermedia)
Analista
Nivel
1 2
100.00 97.60
Inferior 100.00 96.60
100.00 102.80
102.67 100.50
Medio 100.67 96.00
101.67 98.70
98.28 99.50
Superior 98.57 98.00
98.00 97.40
Análisis de varianza de un factor

RESUMEN Cuenta Suma Promedio Varianza
Analista 1 9 899.86 99.98444444 2.420977778
Analista 2 9 887.1 98.56666667 4.4525
Análisis de varianza
Origen de Grados F
Suma de Promedio de F
las de Probabilidad tabla
cuadrados los cuadrados calculada
variaciones libertad s
Analistas 9.0454222 1 MSe= 9.04542222 2.63 0.12426741 4.49
2
Niveles 54.987822 16 MSd= 3.436738889
2
Total 64.033244 17

t: 55 50 80 52 00
32
Revisión 1
CCAYAC-CR-07/0. Criterios para la verificación, control de calidad
interno y expresión de resultados para la determinación de
Clenbuterol por ensayo inmunoenzimático.

t: 55 50 80 52 00
33
Revisión 1
CCAYAC-CR-07/0 Criterios para la verificación, control de calidad interno y expresión
de resultados para la determinación de Clenbuterol por ensayo inmunoenzimático.
1. OBJETIVO
Establecer los criterios de verificación, control de calidad interno y expresión de

resultados para el método de prueba de Clenbuterol.
2. ALCANCE
Los presentes criterios están dirigidos a los laboratorios de ensayo aspirantes a Terceros
Autorizados ante la COFEPRIS y la Red de laboratorios Estatales, que incorporen dentro
de su marco analítico autorizado la técnica de inmunoensayo enzimático con el Kit R1711
R-Biopharm (ELISA) para la determinación de Clenbuterol en productos crudos como:
carne, hígado, para el abasto y, orina y sangre (suero o plasma) de bovinos.
3. DEFINICIONES
3.1. Analito: Componente específico de una muestra, a medir en un análisis.

3.2. Blanco de Muestra: Son matrices que no contienen el analito de interés.
3.3. Blanco de Muestra Fortificada: Muestra blanco a la que se le adicionan cantidades
conocidas del analito de interés.
3.4. Blanco de Reactivos: Reactivos utilizados durante el proceso analítico (incluyendo
disolventes usados en la extracción o disolución) los cuales son analizados para
garantizar que la medición no es influenciada por los materiales utilizados durante
el análisis.
3.5. Criterios de Aceptación: Parámetros bajo los cuales el resultado de una prueba
será considerado aceptable.
3.6. Informe de Verificación: Es el documento en el que los registros, los resultados y la
evaluación completa del proceso de verificación están ensamblados y resumidos.
3.7. Característica de Desempeño: Parámetro específico a evaluar en una verificación
o validación interna del método.
3.8. Precisión Intermedia: Variación en los resultados cuando las mediciones se
realizan en un solo laboratorio pero en condiciones que son más variables que las
condiciones de repetibilidad.
3.9. Protocolo de Verificación: Documento que describe el objetivo, alcance y las
actividades que se planean llevar a cabo, incluyendo los criterios de aceptación
para la aprobación del método de prueba.
3.10. Recobro: Cantidad del analito recuperado en la porción de muestra o muestra
adicionada cuando esta es conducida a través del método analítico completo y que
permite evaluar la eficiencia de la extracción, proceso de preparación e
interferencias que puedan existir al aplicarlo. Se expresa en términos de porcentaje.

t: 55 50 80 52 00
34
Revisión 1
3.11. Repetibilidad: Es una característica cuantitativa que permite conocer la medida de
dispersión de los resultados. Es decir, es el grado de concordancia entre resultados
analíticos individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a
diferentes porciones de una muestra homogénea por un solo analista, usando los
mismos instrumentos y método. En intervalos cortos de tiempo.
3.12. Selectividad: Grado en el que un método puede ser utilizado para determinar
analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencia de otros componentes
de comportamiento similar.
3.13. Verificación del Método: Aportación de evidencias objetivas de que se cumplen
los requisitos especificados.
4. RESPONSABILIDADES
Laboratorios de Salud Pública, los laboratorios de ensayo Terceros Autorizados ante la
5. CRITERIOS
5.1. Criterio 1.- Disposiciones generales

El método debió ser implementado en apego a la aplicación al instructivo del fabricante
del método inmunoenzimático por Ridascreen Clenbuterol Art N° R1711 incluyendo la
etapa de extracción de la muestra y documentar con las evidencias generadas.
5.2. Criterio 2.- Características y criterios de validez, verificación y control de

calidad
5.2.1. Criterios de validez de la curva de calibración del sistema

En la tabla 1 se enumeran los criterios de validez de la curva de calibración de ELISA.
Se menciona el parámetro, especificación y medida de control que se lleva a cabo.
Tabla 1.-Criterios de validez de curva de calibración de ELISA

Criterio o característica Especificación Medida de Control
Absorbancia del estándar 1 Mayor que 0.8 UA
Registro en bitácora.
[Clenbuterol] = 0 ng/L
Repetibilidad de curva de %DSR ≤ 10
Registro en bitácora.
calibración

t: 55 50 80 52 00
35
Revisión 1
<5% para estándar 2
Porciento relativo de
<5% para estándar 4 Registro internos
desviación estándar
DSR= Desviación estándar relativa
Nota 1: Cuando la lectura en absorbancia del estándar 1 (sin Clenbuterol) sea menor de 0.8 UA, la
prueba no tendrá validez y se debe repetir el análisis completo. Si continúa el valor bajo, repetir a
prueba con un kit nuevo.
Si la DSR es mayor al 10% o no se cumple con el porcentaje de desviación de alguno de los
estándares, pero los demás criterios y controles cumplen, analizar el comportamiento de la curva
de calibración para decidir si el ensayo es susceptible de repetición.
5.2.2. Características de desempeño y criterios estadísticos de aceptación para pruebas de

ELISA
Tabla 2. Característica de desempeño) y criterios de aceptación

Características de
Criterio de aceptación Bibliografía
desempeño
Regulación N° 41-2007. Validación
Repetibilidad %DSR ≤ 20% de métodos analíticos. República
de Cuba. Ministerio de Salud
Pública. Centro para el Control
Estatal de la Calidad de los
Medicamentos establece dichos
Precisión intermedia % DSR ≤ 20% criterios para el coeficiente de
variación de la repetibilidad y
reproducibilidad para métodos
inmunoquímicos
Application note, compliance
criteria for manual testing of
Porciento de recobro 70 a 130% RIDASCREEN antibiotic/hormone
tests (competitive).
5.2.3. Controles de calidad en el proceso analítico

t: 55 50 80 52 00
36
Revisión 1
Tabla 3. Control de calidad
Control Criterio de aceptación Registro
Estándar 4 [Clenbuterol]= Dentro de la media ± dos Utilizar al menos dos veces

300 ng/L en la placa de ELISA desviaciones estándar de en cada corrida. Revisión
analizado como muestra. acuerdo al gráfico control. de supervisión
Gráfico de control.
Considerar un control
Control positivo de
positivo de preferencia con
proceso (matriz negativa
valores de 500 ppt a 1500
Control positivo del proceso fortificada y caracterizada)
ppt. (Matriz negativa
dentro de la media ± dos
fortificada o una matriz que
desviaciones estándar de
contenga Clenbuterol de
acuerdo al gráfico control
manera nativa en esas
concentraciones).
Control negativo de
proceso (matriz negativa
Control negativo del proceso
caracterizada) Menor o Registro de bitácora
(Blanco de muestra)
igual a 75 ppt en curva
estándar
Blanco de reactivos (placa de
Menor o igual a 75 ppt en
ELISA, generalmente es agua Registro de bitácora
curva estándar
o buffer)*
*= Esto es dependiendo de la matriz, si se trata de orina (matriz sin extracción, indicar su
preparación) o de carne o hígado que llevan extracción.
Nota 2: Considerar cada uno de los parámetros por corrida.
5.3. Criterio 3.-Proceso de verificación
5.3.1. Selección de matriz

Se debe validar cada matriz por separado orina, suero, hígado o carne (músculo) en
el orden de las necesidades de cada laboratorio. Tomando en cuenta lo siguiente:
 La de naturaleza más compleja.
 La que se analiza con más frecuencia en el laboratorio.
 Que sea de reciente adquisición (fresca).
 De preferencia que haya sido procesada con buenas prácticas pecuarias (por
ejemplo “TIF”, tipo inspección federal o equivalente).
 Considerar incluir por lo menos 10 réplicas independientes para la caracterización
de las muestras y utilizarla como blanco en la fortificación y/o como control
negativo.

t: 55 50 80 52 00
37
Revisión 1
 Indicar los niveles de fortificación de la muestra (por lo menos 3 niveles).
Tabla 4.- Condiciones por tipo de muestra para análisis de Clenbuterol por ELISA
Cantidad
Tipo de
necesaria para la Condiciones Específicas
Muestra
verificación
Hígado Empaque: Contenido en bolsa doble íntegra de plástico.
crudo de El cierre debe asegurar el contenido y la información
bovino documental.
La necesaria
según las
Etiqueta comercial y de muestreo: Que no se
características de
encuentre mojada, esté íntegra y en buenas
Carne desempeño y
condiciones. La etiqueta de muestreo debe contener
(músculo) replicas que se
todos los datos del muestreo correspondiente. En los
cruda de vayan a realizar
dos casos, sin tachaduras ni enmendaduras.
bovino
Condiciones de temperatura: Refrigerado (4°C a 8°C) o
congelado. No se acepta en estado de descomposición.
Empaque: Contenido un recipiente de cierre hermético
que no permita derrames, dentro de una bolsa de
La necesaria plástico. El cierre debe asegurar el contenido y la
según las información documental.
Orina de características de
bovino desempeño y Etiqueta: La muestra debe contener una etiqueta con
replicas que se todos los datos del muestreo correspondiente. En los
vayan a realizar dos casos, sin tachaduras ni enmendaduras.
Condiciones de temperatura: Refrigeración (4-8°C).
5.4. Criterio 4. Características de desempeño analítico
5.4.1. Verificación del método de prueba
Tabla 5.-Características de desempeño analítico para evaluar la verificación del

método
Réplicas
Característica Muestras independien- Calcular/determinar Observaciones
tes
Matriz libre a) Porciento de
Recobro de 6 recobro:  Disolución
Clenbuterol fortificante 100

t: 55 50 80 52 00
38
Revisión 1
y fortificada %𝑟𝑒𝑐𝑜𝑏𝑟𝑜 ng/mL.
[𝑐𝑙𝑒𝑛𝑏𝑢𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙]𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
por lo menos =
[𝑐𝑙𝑒𝑛𝑏𝑢𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙]𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜
𝑥 100 (comercial).
en tres  Sal de
niveles clorhidrato de
b) Promedio,
Clenbuterol de
desviación estándar y
alta pureza.
%DSR
 Los niveles
de fortificación
deben incluir la
concentración
del límite de
corte y de
preferencia
concentracione
s en la parte
lineal de la
curva.
 Determinacio
nes efectuadas
en las mismas
condiciones.
(muestra,
analista,
Matriz libre laboratorio,
a) Media
de equipos y
Repetibilidad 6 b) Desviación
Clenbuterol reactivos.
estándar.
y fortificada  Puede
c)%DSR.
elegirse uno
de los 3
niveles o
realizarse en
los 3.

t: 55 50 80 52 00
39
Revisión 1
 Medida de
precisión en un
laboratorio
cuando se
efectúa el
análisis con una
o varias
condiciones
a) Media diferentes.
b) Desviación (analista,
estándar. días,etc.)
c)%DSR.  Debe elegirse
Matriz libre
d)ANOVA o algún el mismo nivel
Precisión de
6 otro estadístico que o niveles de
intermedia Clenbuterol
demuestre si hay fortificación
y fortificada
que en
diferencia
repetibilidad.
significativa ante los  Generalment
cambios realizados. e se utiliza
ANOVA de una
vía para
demostrar que
no hay
diferencia
significativa por
el (los) cambio
(s) realizado (s).
Adecuabilidad Tres curvas estándar.  Repetible y
de curva Sin matriz 3 reproducible
%DSR
estándar
5.5. Criterio 5.- Expresión de resultados

5.5.1. Reportar el resultado como Clenbuterol en vez de clorhidrato de Clenbuterol, ya que
este último, corresponde al nombre del ingrediente en formulaciones.
5.5.2. Las muestras con un resultado mayor o igual al límite de corte de 2000 ppt se
reportan como DETECTADAS. Colocar el valor numérico en el informe de resultados.
5.5.3. Las muestras con un resultado menor al límite de corte de 2000 ppt se reportan
como NO DETECTADAS. Colocar el valor numérico en el informe de resultados.
5.5.4. En ambos casos reportar el límite de corte en (ng/Kg o ng/L) según la naturaleza
física de la muestra.

t: 55 50 80 52 00
40
Revisión 1
5.6. Criterio 6.- Protocolo de verificación
Elaborar un protocolo que incluya lo siguiente:
Índice Descripción
Protocolo de verificación de método (clave interna). Debe indicar
1. Título
el analito a detectar, el método de prueba y la matriz.
Considerar las características de desempeño a evaluar y el analito
2. Objetivo
a determinar.
Indicar el nombre de la metodología y la matriz o matrices en las
3. Alcance
que se aplicaran.
Elaborar un diagrama de flujo con la metodología empleada para
4.Método de cuantificar el analito indicando el punto o etapa en la que se
ensayo fortifica. Considerar la extracción a realizar en la matriz en
cuestión.
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; clave interna
5.Equipo e
de identificación, e indicar los servicios de calibración, verificación
Instrumentos
y/o calificación, mantenimiento preventivo según sea el caso.
Nombre del material crucial especificando características o fechas
6.Materiales
de caducidad cuando aplique.
Indicar: Nombre, pureza, lote, caducidad, características generales.
Incluir reactivos biológicos (kit), tipo de agua, sustancias de
7.Reactivos referencia y de control entre otros. Incluir la preparación detallada
de las disoluciones y estándares de referencia y preparación de
controles inclusive los cálculos.
Indicar la cantidad, lote o procedencia en su caso, forma de
almacenamiento.
8.Muestras Describir la fortificación de blanco de muestra y el paso analítico
en que se llevará a cabo. Incluyendo los cálculos detallados para la
fortificación.
Describir paso a paso las instrucciones para ejecutar los ensayos
de evaluación de las características de desempeño.
9.Desarrollo
Incluir como se va a realizar la caracterización de las muestras
experimental
control negativas y positivas, los niveles de fortificación, las réplicas
y controles en la prueba de ELISA
Propuesta de formato de registro para vaciado de resultados de
10.Resultados
cada parámetro de verificación a ensayar.
11.Análisis Establecer y describir para cada característica de desempeño la
estadístico herramienta estadística que se utilizará para su evaluación.
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación que se
12.Criterios de
busca satisfacer. Indicar la referencia bibliográfica utilizada cuando
aceptación
aplique.

t: 55 50 80 52 00
41
Revisión 1
Documentos en los que se basó para elaborar el protocolo de
verificación. Deberá anotar la referencia oficial nacional o
13.Bibliografía
internacional de donde proviene la información descrita en el
protocolo.
Otra información que se quiera incluir como por ejemplo, formatos
14.Anexos
o información adicional.
Nota 3: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó. Asimismo un
índice o contenido y paginación.
5.7. Criterio 7.- Informe de verificación
Elaborar un informe de resultados que incluya lo siguiente:
Informe de verificación de método (clave interna). Debe indicar
Título
el analito que se detectó, el método de prueba y la matriz.
Considerar las características de desempeño utilizadas en la
1. Objetivo
evaluación y el analito que se determinó.
Indicar el nombre de la metodología y la matriz o matrices en las
2.Alcance
que se aplicó.
Elaborar un diagrama de flujo con la metodología empleada
3.Método de ensayo para cuantificar el analito indicando el punto o etapa en la que se
fortificó.
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; Clave
4.Equipo e interna de identificación, fecha de calibración, verificación y/o
Instrumentos calificación según sea el caso, fecha de mantenimiento
preventivo.
Nombre del material crítico especificando características o
5.Materiales
fechas de caducidad cuando aplique.
Indicar: Nombre, pureza, lote, caducidad, características
generales de todos los reactivos que se utilizaron incluyendo
reactivos biológicos (kit), sustancias de referencia y de control.
6.Reactivos
Incluir la preparación detallada y cálculos de las soluciones,
diluciones y estándares de referencia. Incluir la fecha y al analista
que los preparó.
Indicar la cantidad, lote o procedencia en su caso, forma de
almacenamiento.
7.Muestras Describir como se realizó la fortificación de blanco de muestra,
fecha, analista y el paso analítico en que se llevó a cabo. Incluir
los cálculos detallados para la fortificación.

t: 55 50 80 52 00
42
Revisión 1
Describir paso a paso las instrucciones para ejecutar los ensayos
de evaluación de cada una de las características de desempeño.
Incluir las réplicas, analistas que intervinieron, fechas y controles
8.Desarrollo
en la extracción y en la placa de ELISA.
experimental
Describir como se realizó la caracterización de las muestras
control negativo y positivo, y cuando, como y quien efectuó la
fortificación de la muestra.
Presentar en forma de tabla los resultados obtenidos. Analizar los
datos con una prueba de tipificación como por ejemplo Grubbs.
9.Resultados Utilizar los formatos, tablas, gráficos u otra estrategia de
presentación de los resultados. Registrar los resultados de cada
característica de verificación a ensayar.
Establecer y describir para cada característica de desempeño la
herramienta estadística que se utilizó para su evaluación.
Generalmente es la media, la desviación estándar muestral y el
coeficiente de variación ó Desviación estándar relativa. Si es
necesario, utilizar los anexos para describir el desarrollo de la
prueba estadística empleada.
10.Análisis En caso de utilizar estadística inferencial para comparar cambios
estadístico o diferencias, considerar:
1) La transformación de los datos para considerarlos normales y
que para dos series se puede utilizar t de student, ANOVA u otro
estadístico.
2) Contar con el criterio de aceptación al estadístico empleado.
En todos los casos, justificar el uso y reportar la interpretación del
resultado.
Registrar en una tabla los resultados obtenidos y los criterios de
aceptación que se busca satisfacer. Comentar sobre el
11.Criterios de
comparativo entre los criterios de evaluación teóricos y los
aceptación
resultados estadísticos obtenidos de los ensayos resaltando las
observaciones críticas.
Revisar las actividades realizadas, la revisión bibliográfica en
relación al tema y los resultados obtenidos. Explicar valores
anómalos o de significancia estadística e incorporar
12.Discusión
observaciones relevantes que apoyen la autocrítica de los datos
obtenidos y la eficacia de las decisiones tomadas. Evidenciar las
acciones realizadas.
Enunciar si se alcanzaron los objetivos esperados y se acepta el
13.Conclusiones
uso previsto del método de prueba.
Registrar la referencia oficial nacional o internacional de donde
14.Bibliografía proviene la información descrita o alguna otra fuente de
información adicional.

t: 55 50 80 52 00
43
Revisión 1
Los que apliquen para dar evidencia en su ejecución: datos
crudos obtenidos, impresos de las corridas del lector de ELISA,
15.Anexos copias de certificados de análisis de reactivos, de servicio a
equipos, evidencias de acciones o de eficacia tomadas, anexos a
la validación, etc.
Nota 4: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.
Asimismo un índice o contenido con paginación.
6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Documentos Clave
6.1. Método de prueba para la determinación de Clenbuterol por
CCAYAC-M-265
ensayo inmunoenzimático
7. BIBLIOGRAFÍA
Documentos
NOM-194-SSA1-2004. Productos y servicios. Especificaciones sanitarias en los
7.1. establecimientos dedicados al sacrificio y faenado de animales para abasto,
almacenamiento, transporte y expendio. Especificaciones sanitarias de productos
7.2. NMX-EC-17025-IMNC-2018. Requisitos generales para la competencia de los
laboratorios de ensayo y calibración
7.3. Estadística y quimiometría para Química analítica, James N. Miller & Jane C. Miller,
Cuarta edición, Prentice Hall, 2002, Capítulo 3 p.p. 55 -58; Anexo 2 Tabla 6, p.p. 266.
7.4. Application note, Compliance criteria for manual testing of RIDASCREEN®
antibiotic/hormone tests (competitive). R-biopharm.
7.5. Declaration Product: Ridascreen Clenbuterol (Art. No R1711). Addendum:
Compliance Criteria. R-biopharm.
7.6. Inserto del kit RIDASCREEN® Clenbuterol (R1711). R-biopharm y sofware
Regulación N° 41-2007. Validación de métodos analíticos. República de Cuba.

Ministerio de Salud Pública. Centro para el Control Estatal de la Calidad de los
7.7. Medicamentos. Actualización 2012 en la publicación: “Técnicas
inmunoenzimáticas para ensayos de vacunas y estudios inmunoepidemiológicos”
La Habana,Cuba.
8. ANEXOS. No Aplica

t: 55 50 80 52 00
44
Revisión 1
CCAYAC-CR-08/1. Criterios para la verificación del método
de prueba para la detección de Brucella spp. por PCR.

t: 55 50 80 52 00
45
Revisión 1
CCAYAC-CR-08/1Criterios para la verificación del método de prueba para la detección
de Brucella spp. por PCR.
1. OBJETIVO.
Establecer los requisitos técnicos mínimos para la verificación de la metodología de

detección del género Brucella spp. por PCR.
2. ALCANCE.
Los presentes criterios están dirigidos a los laboratorios de ensayo aspirantes a Terceros
Autorizados ante la COFEPRIS que incorporen dentro de su marco analítico autorizado al
método PCR para la detección de Brucella spp en leche, sus productos y derivados.
3. DEFINICIONES.
3.1 Control Interno de Amplificación: Sistema de amplificación paralelo a la

amplificación del fragmento de interés y que siempre debe amplificar. Facilita la
detección de falsos negativos y elementos de inhibición de la PCR.
3.2 Ct (cycle Threshold o ciclo de corte): También conocido como Cq o Cp (del inglés
crossing point) es como se designa el número de ciclos conforme se va
desarrollando la PCR en tiempo real.
3.3 Exclusividad: Diferentes cepas no pertenecientes al género Brucella no deben ser
detectadas por el método.
3.4 Inclusividad: Diferentes cepas pertenecientes al género Brucella deben ser
detectadas por el método.
3.5 Límite de detección: Concentración en la que una muestra positiva arroja
resultados positivos en al menos un 95 % de las ocasiones. Por lo tanto, el porcentaje
de resultados falsos negativos debe ser del 5 % o menos.
3.6 Oligonucleótido: Secuencia corta de material genético, que se utiliza como cebador
o primer en las reacciones de amplificación.
3.7 PCR en tiempo real: También conocida como PCR cuantitativa o q-PCR por sus
siglas en inglés (quantitative polymerase chain reaction) es una variante de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y
simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de
ADN.
3.8 Reacción en cadena polimerasa (PCR): Técnica analítica que se basa en la
replicación de fragmentos de ADN por síntesis enzimática. A partir de pequeñas
cantidades de ADN, genera un gran número de copias de un segmento de ADN,

t: 55 50 80 52 00
46
Revisión 1
mediante una serie repetitiva de tres pasos: desnaturalización de ADN, alineación de
iniciadores o primers y extensión o replicación del material genético.
3.9 Rango dinámico: Es también el rango de aplicabilidad de la técnica. Se considera
que va desde la menor concentración detectable (el LOD) hasta la pérdida de
relación entre respuesta y concentración.
3.10 Sonda: Oligonucleótido que tiene unido covalentemente en el 5´un fluoróforo y un
apagador de la fluorescencia o Quencher en 3´. La escisión de la sonda permite la
emisión de fluorescencia.
3.11 Secuencia de inserción: Es un fragmento genómico móvil que no se expresa ni
tiene otra función que la de insertarse en múltiples sitios del genoma (trasposición.
Esta secuencia ha sido utilizada como un marcador genético para diferenciar entre
especies de Brucella, miembros de una misma especie y dentro de un mismo
biovar.
3.12 Verificación del método: Evidencia objetiva para demostrar que al aplicar un
método normalizado, se cumple con las especificaciones del mismo y se cuenta con
la competencia técnica para realizarlo adecuadamente tomando en consideración
sus propias instalaciones, equipo y personal.
Los presentes criterios deben ser aplicados por los integrantes de la Red Nacional
de Laboratorios Estatales de Salud Pública, los laboratorios de ensayo Terceros
Autorizados ante la COFEPRIS y por los miembros del padrón de auditores y
evaluadores.
5. CRITERIOS.
5.1 Criterio No. 1.- Disposiciones generales
a) Los laboratorios que implementen la metodología de PCR en punto final deben

seguir lo establecido en el documento CCAYAC-M-201 “Método de prueba para la
detección de Brucella spp. en leche y sus productos y derivados por PCR”.
b) Los laboratorios que implementen la metodología de PCR en tiempo real deben
seguir lo establecido en el documento CCAYAC-M-353 “Método de prueba para la
detección de Brucella spp. en leche y sus productos y derivados por PCR en
tiempo real”.
c) Para manipular las cepas del género Brucella, se deben adoptar las directrices en
materia de bioseguridad consideradas para un laboratorio de nivel 3, conforme a lo
establecido en el Manual de Bioseguridad en el Laboratorio publicado por la OMS

t: 55 50 80 52 00
47
Revisión 1
(7.5) o en su caso los implementos de bioseguridad e instalaciones nivel dos
complementado con los cuidados en el manejo del microorganismo.
d) Las áreas para extracción de ADN genómico, preparación de la mezcla maestra de
PCR y adición de templados deben ser independientes, para evitar la
contaminación cruzada de muestras con el material genético extraído o los
productos de amplificación de PCR obtenidos previamente.
5.2 Criterio No. 2.- Método analítico
5.2.1 Establecer y adaptar los métodos analíticos mencionados para punto final (PCR PF)
y/o tiempo real (PCR TR) según corresponda a la capacidad analítica con que se cuente,
en los cuales se detalle como mínimo cada uno de los siguientes rubros:
a) El alcance del método.

b) Proceso de homogeneización y/o pre-enriquecimiento de la porción analítica
para cada tipo de muestra.
c) Proceso de extracción de ADN genómico.
d) Composición de la mezcla maestra de amplificación. Indicar el blanco genético de
amplificación tal como la secuencia de inserción IS711 para PCR en tiempo real o
genes Omp-2 para punto final, secuencias de los iniciadores y sondas, tamaño del
fragmento obtenido.
e) Proceso de amplificación y plataforma analítica (equipo) utilizada.
Intercambiabilidad con otros equipos utilizados y los parámetros que se ajustan a
esos equipos.
f) Medidas de control de calidad implementadas.
g) Interpretación de resultados.
h) Medidas de bioseguridad.
5.2.2 La metodología de PCR en tiempo real debe ser capaz de detectar el género
Brucella, en un único evento de amplificación, mediante el uso de sondas específicas
para el género.
5.2.3 Los dos métodos de prueba de PCR que comprenden estos criterios son de
aplicación cualitativa.
5.2.4 Se recomienda un método de extracción, independiente de la matriz a la que vaya a

ser aplicado, que genere un ADN con integridad estructural y pureza en suficiente
cantidad para permitir que se realice una evaluación apropiada del rendimiento de las
fases posteriores del método que se vaya a realizar.

t: 55 50 80 52 00
48
Revisión 1
5.2.5 En el análisis en tiempo real de la PCR, los valores Ct se pueden usar para estimar la
eficiencia de la PCR la cual se puede comprobar estableciendo una serie de diluciones del
ADN molde y determinando el valor Ct (el umbral de número de ciclos en el que la señal
de fluorescencia que se mide cruza un valor de la curva y es establecido por el usuario).
Idealmente cuando la eficiencia y la amplificación es del 100%, una reducción doble en
cantidad del ADN molde agregado a la PCR dará como resultado un incremento del valor
Ct en uno. Por tanto, si el ADN se diluye 10X, la diferencia teórica en valores Ct entre ADN
diluido y sin diluir debe aproximarse a 3.32. Los datos teóricos no se alcanzan en
situaciones reales por lo que, cuando las desviaciones sean significativas con respecto a
esta relación, podrían indicar que el ADN extraído contiene inhibidores de la PCR, que la
solución de ADN no es homogénea o que la cantidad de ADN es tan baja que las
variaciones aleatorias de la cantidad de ADN en las reacciones, produce como resultado
estimaciones cuantitativas imprecisas.
5.2.6 En muestras complejas de alimentos ricas en inhibidores, se recomienda introducir

el CIA (IPC=Control interno positivo) el cual se puede agregar a las muestras para
distinguir los verdaderos negativos por causa ajena a la presencia de inhibidores de la
PCR y permite amplificar un ADN diana de baja copia en el mismo tubo con el CIA.
Aunque los ADN diana y CIA pueden diferir en el número de copias iniciales, la
concentración de los oligonucleótidos CIA en la reacción PCR es limitante, de modo que
la eficacia de amplificación de la PCR de la muestra no se ve comprometida. Un resultado
negativo para la secuencia diana y uno positivo para el CIA indican que no hay una
secuencia diana y por lo tanto la muestra es verdaderamente negativa y un resultado
negativo para la secuencia diana y uno negativo para el CIA sugieren inhibición por PCR o
sea, un posible resultado falso negativo de la muestra.
5.3 Criterio No.3.- Criterios de validez, verificación y control de calidad.
5.3.1 Criterios de validez. En la tabla 1 y 2 se enumeran los criterios de validez de la PCR.

Se menciona el control, especificación y medida de control que se lleva a cabo.
5.3.1.1 El análisis se considera inválido en caso de no obtener los resultados esperados en
cualquiera de los controles indicados en las tablas por lo que tendrá que repetirse el
análisis.
Tabla 1.-Criterios de validez de PCR punto final semianidada.

Controles (primera PCR) Especificación Medida de Control
Control negativo de reactivos de
Sin amplificación Registro en bitácora.
la PCR Bru1-4(NTC)
Control negativo de extracción
(CNE)

t: 55 50 80 52 00
49
Revisión 1
Con amplificación en
Control positivo Registro en bitácora.
800pb* o 680pb
Controles (segunda PCR) Especificación Medida de Control
Control negativo de reactivos de Registro en bitácora.
Sin amplificación
la PCR Bru1-4(NTC)
Control negativo de reactivos de Registro en bitácora.
Sin amplificación
la PCR Bru1-3(NTC)
Control negativo de Registro en bitácora.
Sin amplificación
extracción(CNE)
Con amplificación en Registro en bitácora.
Control positivo
190pb
*pb= pares de bases.
Tabla 2.-Criterios de validez de PCR en tiempo real.

Controles Especificación Medida de Control
Control negativo de reactivos
de la PCR(NTC)
Control negativo de extracción
(CNE)
Control positivo Con amplificación Registro en bitácora.
Control interno de amplificación Con amplificación Registro en bitácora.
5.3.2 Los resultados de los duplicado del análisis para cada muestra problema, a
partir de la extracción de ADN genómico, deberán ser iguales, es decir, positivos
o negativos en los casos según corresponda, sino es así, repetir desde la
extracción del ADN nuevamente por duplicado. La medida de control es el
registro en bitácora y la supervisión.
5.3.3 Características de desempeño y criterios de aceptación para pruebas de

PCR (cualitativo).
Tabla 3. Característica de desempeño y criterios para PCR punto final.

Parámetro Criterio de Aceptación Cita bibliográfica
El nivel menor donde se obtiene al
menos 95% de resultados detectados 7.3 y 7.4
Límite de detección
para el género Brucella. Concentración
más baja en la que se obtiene detección

t: 55 50 80 52 00
50
Revisión 1
reproducible.
Resultados positivos en al menos un 95%

de las ocasiones. La tolerancia de
Repetibilidad
resultados falsos negativos debe ser del
5% o menos.
Resultados positivos en al menos un 95%
de las ocasiones. La tolerancia de
Precisión intermedia
resultados falsos negativos debe ser del
5% o menos.
100% de ADN de cepas detectadas para
Inclusividad
el género Brucella
100% de ADN de cepas NO detectadas
Exclusividad
para el género Brucella
Tabla 4. Característica de desempeño y criterios para PCR en tiempo real.

Característica Criterio de Aceptación Cita bibliográfica
Adecuabilidad del Pendiente: ~ –3.3 a -2.9
sistema y rango R2 de>de0.98 (regresión logística) 7.1 y 7.2
dinámico. Eficiencia. Eficiencia= 80 a 120%
Concentración más baja en la que se
obtiene detección reproducible.
Límite de detección
Considerar el punto más bajo del
rango dinámico.
Repetibilidad ¨DSR <25% 7.3 y 7.4
Precisión intermedia DSR <35%
100% de ADN de cepas detectadas para
Inclusividad
el género Brucella
100% de ADN de cepas NO detectadas
Exclusividad
para el género Brucella
¨DSR= Desviación estándar relativa
5.3.3.1 Rango dinámico
Define el intervalo de concentración en el que se podrá determinar el analito con

fiabilidad. La cantidad relativa de ADN específico del taxón con respecto al total en el
extracto de ADN variará en función de si el ADN se extrajo de un solo ingrediente o de
una matriz compleja de alimentos. Si es posible, demostrar que la relación entre la
respuesta y la concentración es continua, reproducible y lineal, después de la

t: 55 50 80 52 00
51
Revisión 1
transformación apropiada de los datos. La determinación de este parámetro en la
verificación de PCR cualitativa es opcional.
5.3.4 Controles de calidad adicionales en el proceso analítico
5.3.4.1 Preparar la mezcla maestra de PCR en un gabinete de bioseguridad o

equivalente separada de las áreas destinadas a la extracción de ADN y
adición de templados y realizar el control ambiental.
Tabla 5. Control de calidad del ADN y ambiental para ambas PCR
Prueba Criterio de aceptación Medida de control
De 1.8-2.0 Registro en bitácora
Pureza ADN. Relación Un ADN de pureza Nota: Desviaciones de este valor

260/280 de absorbancia aceptable debe tener al hasta de un 30% no afecta a la
menos una relación PCR. En caso necesario purificar
A260/280 >1.6 el ADN.
En gel de agarosa al 1%
conocer el perfil de Documentar el gel
Integridad estructural del integridad del ADN Es
ADN recomendable que no Nota: Las bandas inespecíficas no
presente bandas afectan la especificidad de la PCR.
múltiples inespecíficas
Registro en bitácora
< 15UFC/15min de
exposición de las placas Nota: Se cuenta con acciones
Control ambiental (por
en áreas y <1UFC/15min documentadas en la sanitización.
sedimentación)
en gabinetes de El no cumplimiento no
bioseguridad compromete los resultados de la
PCR.
Control de calidad de PCR en tiempo real
Prueba Criterio de aceptación Medida de control
*DS <0.2 de repetibilidad Registro en bitácora y
Estandarización del Ct de y precisión intermedia desempeño en el montaje.
muestras, control positivo del valor Ct del
y CIA con diluciones triplicado de cada curva Se estandariza seleccionando la
decimales decimal. dilución en la que se obtengan
valores de Ct menores a 35 de

t: 55 50 80 52 00
52
Revisión 1
preferencia, confirmando con las
curvas de fusión.
CIA= Control interno de amplificación.
*DS= Desviación estándar, idealmente es <0.167 pero puede tolerarse hasta <0.2.
Nota 1: Considerar cada uno de los parámetros por corrida.
5.4 Criterio 4.-Proceso de verificación
5.4.1 Selección de matriz. Puede ser la más compleja o las más solicitada por los
usuarios del laboratorio.
Tabla 6.- Condiciones por tipo de muestra para análisis de Brucella spp.
Tipo de Cantidad necesaria para
Condiciones Específicas
Muestra la verificación
Leche natural La necesaria según los Empaque: Empaque original cerrado o
no parámetros de desempeño en bolsa estéril doble íntegra de plástico
pasteurizada y replicas que se vayan a o frasco estéril si se muestrea a granel.
realizar El cierre debe asegurar el contenido y la
información documental.
Etiqueta comercial y de muestreo:
Productos Que no se encuentre mojada y esté
lácteos y La necesaria según los íntegra y legible. Condiciones de
derivados parámetros de desempeño temperatura: Refrigerada (4 a 8°C) o
frescos no y replicas que se vayan a congelada. No se acepta en estado de
pasteurizados realizar descomposición y en caso de productos
y derivados no pasteurizados, no se
acepta que sean madurados o
fermentados.
5.4.2 La caracterización de la matriz como negativa se verifica realizando al menos

6 repeticiones independientes. Una vez evaluada se puede utilizar como control
negativo o como blanco para fortificar con UFC de Brucella atenuada. Si no se
cuenta con las medidas de bioseguridad o con la experiencia microbiológica en el
manejo de este tipo de microorganismo patógeno se recomienda fortificar el
extracto de ADN del alimento en estudio con una cantidad conocida de ADN de
una cepa patrón de Brucella.

t: 55 50 80 52 00
53
Revisión 1
5.5 Criterio 5.-Desarrollo experimental de las Características de desempeño analítico
5.5.1 Verificación del método de prueba.

Antes de iniciar con la verificación es recomendable estandarizar el Ct encontrando la
dilución de ADN que proporcione valores menores de 35 de preferencia. Hacerlo para el
ADN control positivo (utilizándolo como estándar, el ADN del alimento en estudio
caracterizado como negativo a la presencia de Brucella (control negativo) y para el CIA.
Confirmar la respuesta del analito con la curva de fusión. Al realizar estos ensayos se
obtiene la adecuabilidad del sistema junto con el rango dinámico de trabajo y la
eficiencia.
Tabla 7.-Características de desempeño para evaluar la verificación del método.

Réplicas
Característica Muestras Calcular/determinar Observaciones
independientes
Al menos 5 diluciones
decimales del estándar Un solo analista.
incluyendo el cero. La eficiencia se
Determinar la DS de determina con
Adecuabilidad repetibilidad del Ct y el ADN de la matriz.
del sistema. Sin triplicado de cada rango dinámico. Se puede calcular
Rango dinámico matriz dilución Calcular la eficiencia: regresión logística
y Eficiencia є = 100 x (10−1/𝑚 − 1) para el rango
Dónde: lineal. No aplica
є = eficiencia para PCR punto
m = la pendiente de final.
la curva
Cuando se conoce el Se parte de
LOD: concentraciones
Confirmarlo con al patrón conocidas
menos 6 réplicas antes del fortificante ya
y después del valor sea No. de
teórico. Detectarse al células/mL ó de
menos 95% de las su ADN. Partir de
Límite de Con
sextuplicado veces. concentración
detección matriz
Si no se conoce: Probar conocida de ADN
con diluciones patrón para
decimales altas por fortificar ADN
triplicado y correr la extraído del
prueba. El LOD estará alimento y realizar
entre la última dilución diluciones
que dé respuesta decimales. Se

t: 55 50 80 52 00
54
Revisión 1
positiva y la siguiente aplica para PCR
que no la presente. PF y PCR TR.
Determinar el Ct para
PCR TR y después
confirmarla.
Muestra fortificada en Utilizar la
un nivel. concentración de
Fortificar el ADN ADN
genómico de la matriz caracterizado
con el ADN de para que se
Con
Repetibilidad sextuplicado referencia y correr la obtenga un
matriz
PCR. Deberá resultado de Ct
detectarse el analito menor a 35 de
en al menos 95% de las preferencia u otro
veces determinando la confirmado con la
DSR de repetibilidad. curva de fusión.
Muestra fortificada en
el mismo nivel que
repetibilidad. Mismas
Fortificar el ADN indicaciones del
genómico de la matriz parámetro
con el ADN de anterior
Precisión Con únicamente se
sextuplicado referencia y correr la
intermedia matriz cambia un factor
PCR. Deberá
(diferente analista
detectarse el analito o diferente día o
en al menos 95% de las ambos u otro
veces determinando la cambio).
DSR de precisión
intermedia.
Por la dificultad
de adquirir las
ADN genómico de cepas se permite
Sin
Inclusividad Sin repetición mínimo 20 cepas de trabajar con al
matriz
Brucella. menos 13 ADN de
cepas patrón de
Brucella.
ADN genómico de Por lo menos 20
Sin cepas que no
Exclusividad Sin repetición cepas de lactobacilos,
matriz sean del género
enterobacterias u otros
Brucella

t: 55 50 80 52 00
55
Revisión 1
géneros relevantes de
la microbiota normal
del alimento.
PCR PF= Reacción de PCR punto final
PCR TR= Reacción de PCR en tiempo real
Nota 2: En la robustez se puede variar por ejemplo: la temperatura de alineación de los primers en
±5% o variar la cantidad de uno de los ingredientes de la mezcla maestra o variar un parámetro del
programa del termociclador u otro cambio menor.
5.6 Criterio 6.- Expresión e interpretación de resultados.

Reportar el resultado de detección de Brucella spp. en leche y sus productos y
derivados por PCR punto final o tiempo real como detectada o no detectado con
base al límite de detección determinado.
5.6.1 Para PCR PF

a) Apegarse al método de prueba CCAyAC-M-201 para la interpretación de
resultados.
b) La detección de otras bandas de diferente tamaño a las que se deben de
obtener (bandas predominantes de 800pb y 190pb)es factible por el arreglo doble
y contrapuesto del gen omp-2.
c) Si tras la repetición el resultado de detección sigue sin concordar puede deberse
a que el analito se encuentra en o por debajo del límite de detección del método.
d) Se considera una muestra POSITIVA para Brucella spp, si se obtiene una banda
en alguna o ambas de las dos reacciones de amplificación (Bru1,4 y/o Bru1,3)a
800pb y 190pb respectivamente.
e) Se considera una muestra NEGATIVA para Brucella spp, si en ninguna PCR se
obtienen los productos de amplificación mencionados, así como también para
aquellas muestras que se encuentren en o por debajo del límite de detección del
método.
5.6.2 Para PCR TR

a) Las curvas de fluorescencia primaria que cruzan el umbral, son registradas como
POSITIVAS y el No. de ciclos cuando cruzan el umbral debe ser registrado en la
bitácora correspondiente. Quiere decir que el gen 1S711 presentó amplificación la
cual se manifiesta a través de una cinética de reacción que rebasa el umbral.
b) Las reacciones del control positivo deben amplificar antes del ciclo 35 o mayor
verificado para las muestras, control positivo y control interno de amplificación y
sus curvas de fusión.

t: 55 50 80 52 00
56
Revisión 1
c) Las líneas que no llegan a cruzar el umbral se registran como resultados
NEGATIVOS.
d) Una muestra positiva puede salir negativa por: baja eficiencia en la extracción de
los ácidos nucleicos, por traspaso de inhibidores de PCR de las muestras, cantidad
de muestra insuficiente para permitir la detección por estar por debajo del Límite
de detección, si hay un exceso de carga de ADN molde en la reacción o por no
tener la opción de distinguirlo por no utilizar un CIA (IPC) en la reacción de PCR.
e) Las curvas de amplificación se analizan en escala logarítmica.
5.7 Criterio No.7.- Protocolo de verificación
Elaborar un protocolo que incluya lo siguiente:

Título Protocolo de verificación de método… (clave interna).
Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito a
1.Objetivo
determinar.
Indicar el nombre de la metodología, el tipo de PCR y la matriz o
2.Alcance
matrices en las que aplicará.
Elaborar un diagrama de flujo con la metodología empleada para
3.Método de ensayo cuantificar el analito. Debe indicar el paso analítico donde se
realice la fortificación y breve explicación de cómo se realiza.
Indicar la cantidad, lote o procedencia, forma de almacenamiento.
4.Muestras Describir a detalle la fortificación del blanco de la muestra y los
cálculos y concentraciones que aplicará.
Nombre del equipo y/o instrumento; clave interna de
5.Equipo identificación, e indicar los servicios de calibración, verificación y/o
Indicar nombre y características generales de todos los reactivos a
utilizar incluyendo sustancias de referencia y de control. Describir
6.Reactivos a detalle la preparación de controles, estándares, primer, sondas,
master mix principalmente si se va a modificar alguno de ellos
para determinar la robustez.
Describir paso a paso las instrucciones para ejecutar los
experimentos de evaluación de los parámetros de verificación. Se
7.Desarrollo
recomienda iniciar con adecuabilidad del sistema y
experimental
determinación de la eficiencia (no aplica para PCR PF) y continúe
con límite de detección para las dos PCR.
Propuesta de formato de registro para vaciado de resultados de
8.Resultados
cada parámetro de verificación a ensayar.

t: 55 50 80 52 00
57
Revisión 1
9.Criterios de Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación que se
aceptación busca satisfacer. Indicar la referencia bibliográfica utilizada.
Documentos en los que se basó para elaborar el protocolo de
10.Bibliografía verificación. Deberá anotar la referencia oficial nacional o
internacional de donde proviene la información descrita en el
protocolo.
Otros registros que se quiera incluir como por ejemplo, formatos o
11.Anexos
información adicional.
Nota 3: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.
5.8 Criterio No.8.- Informe de verificación
Elaborar un informe de resultados que incluya lo siguiente:

Informe de verificación de método (clave interna). Debe indicar el analito
Título
que se detectó, el método de prueba y la matriz.
Considerar las características de desempeño utilizadas en la evaluación y
1.Objetivo
el analito que se determinó.
Indicar el nombre de la metodología y la matriz o matrices en las que se
2.Alcance
aplicó.
3.Método de Elaborar un diagrama de flujo con la metodología empleada para
ensayo cuantificar el analito indicando el punto o etapa en la que se fortificó.
Indicar la cantidad, lote o procedencia, forma de almacenamiento.
4.Muestras Describir a detalle la fortificación del blanco de la muestra y los cálculos y
concentraciones que aplicó.
Nombre del equipo y/o instrumento a utilizar; clave interna de
5.Equipo
calificación, mantenimiento preventivo según sea el caso. Indicar el
software y la versión utilizada.
Nombre del material crítico especificando características o fechas de
6. Material
caducidad cuando aplique.
Indicar: Nombre, pureza, lote, caducidad, características generales de
todos los reactivos que se utilizaron incluyendo reactivos biológicos (kit),
7.Reactivos sustancias de referencia y de control. Incluir la preparación detallada y
cálculos de las soluciones, diluciones y estándares de referencia. Incluir la
fecha y al analista que los preparó.
Describir paso a paso las instrucciones para ejecutar los ensayos de
8.Desarrollo
evaluación de cada uno de las características de desempeño que se
experimental
aplicaron. Incluir las réplicas, analistas que intervinieron, fechas y

t: 55 50 80 52 00
58
Revisión 1
controles utilizados en la extracción y de la PCR. Así mismo, como se
realizó la caracterización de las muestras control negativas y positivas,
extracción a realizar en la matriz en cuestión; y cuando, como y quien
efectuó la fortificación de la muestra.
Ordenar datos y registrar los resultados de cada parámetro de
verificación a ensayar. Utilizar los formatos, tablas, gráficos u otra
estrategia de presentación de los resultados.
9.Resultados
Formato de registro con los resultados obtenidos incluyendo fechas de
análisis, analista (s), matriz, etc. Registrar los resultados de cada
característica de verificación a ensayar.
Establecer y describir para cada característica de desempeño la
herramienta estadística que se utilizó para su evaluación. Generalmente
es la media, la desviación estándar muestral y el coeficiente de variación
o Desviación estándar relativa. Si es necesario, utilizar los anexos para
describir el desarrollo de la prueba estadística empleada.
10.Análisis En caso de utilizar estadística inferencial para comparar cambios ó
estadístico diferencias, considerar:
1) La transformación de los datos para considerarlos normales y que para
dos series se puede utilizar t de student, ANOVA u otro estadístico.
2) Contar con el criterio de aceptación al estadístico empleado.
En todos los casos, justificar el uso y reportar la interpretación del
resultado.
11.Criterios de Registrar en una tabla los resultados obtenidos y los criterios de
aceptación aceptación que se busca satisfacer. Indicar su cumplimiento.
Revisar las actividades realizadas, la revisión bibliográfica en relación al
tema y los resultados obtenidos. Comentar sobre el comparativo entre
los criterios de evaluación teóricos y los resultados estadísticos obtenidos
12.Discusión experimentalmente resaltando las observaciones críticas. Explicar valores
anómalos o de significancia estadística e incorporar observaciones
relevantes que apoyen la autocrítica de los datos obtenidos y la eficacia
de las decisiones tomadas. Evidenciar las acciones realizadas.
Enunciar si se alcanzaron los objetivos esperados y se acepta el uso
13.Conclusiones
previsto del método de prueba.
Registrar la referencia oficial nacional o internacional de donde proviene
14.Bibliografía
la información descrita o alguna otra fuente de información adicional.
Los que apliquen para dar evidencia en su ejecución: datos crudos
obtenidos, impresos de las corridas, copias de certificados de análisis de
15.Anexos
reactivos, de servicio a equipos, evidencias de acciones o de eficacia
tomadas, anexos a la validación etc.
Nota 4: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó. Asimismo,
un índice o contenido con paginación.

t: 55 50 80 52 00
59
Revisión 1
Documentos Clave
Método de prueba para la detección de Brucella spp. en leche y sus
6.1 CCAYAC-M-201
productos y derivados por PCR
Método de prueba para la detección de Brucella spp. en leche y sus CCAYAC-M-
6.2
productos y derivados por PCR en tiempo real 353
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Association Francaise de Normalisation (AFNOR). (2008). Criteres de validation intra-
7.1 laboratoire pour les methodes de detection et quantification de sequences d’acides
nucleiques specifiques (Rep. No. XP V 03e044).
Applied Biosystems. Thermo Scientific. (2016). Application note. Real-time PCR:
7.2
understanding Ct
Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection,
7.3 identification and quantification of specific DNA sequences and specific proteins in
foods. Codex alimentarius. CAC/GL 74-2010.
2010Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Elsiever. Trends in
7.4
Food Science and technology.S. Broeders y col. 37 (2014)p.115-126.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. Tercera
7.5
edición. 2005.
8. ANEXOS.
No aplica.

t: 55 50 80 52 00
60
Revisión 1
CCAYAC-CR-12/1. Criterios de validez para el aislamiento e
identificación de amebas de vida libre en aguas de uso
recreativo.

t: 55 50 80 52 00
61
Revisión 1
CCAYAC-CR-12/1 Criterios de validez para el aislamiento e identificación de amebas de
vida libre en aguas de uso recreativo.
1. OBJETIVO
Establecer los requisitos técnicos mínimos para dar validez al aislamiento e

identificación de amebas del género Acanthamoeba spp y Naegleria spp en aguas
de uso recreativo.
2. ALCANCE
Este documento aplica para muestras de agua provenientes de albercas o

balnearios.
3. DEFINICIONES
3.1 Acanthamoeba spp, a uno de los protistas del género Amoebozoa, más comunes
del suelo y también frecuentes en agua dulce y otros hábitats. Las células son
pequeñas, usualmente de 15 a 35 μm de longitud y de forma oval o triangular
cuando se mueven. Presentan un trofozoíto con capacidad de alimentarse y
replicarse, que, en condiciones desfavorables, como en un medio anaerobio, se
transforma en un quiste latente que puede soportar temperaturas extremas (de -
20 a 56 °C), la desinfección y la desecación
3.2 Naegleria spp, al género formado por ameboflagelados de vida libre ampliamente
distribuidos en el medio ambiente. Tienen tres estadios: trofozoíto, flagelado y
quiste. El trofozoíto (de 10 a 20 μm) se desplaza gracias a la emisión explosiva de
seudópodos, se alimenta de bacterias y se reproduce mediante fisión binaria.
Puede transformarse en flagelado, un estadio que presenta dos flagelos anteriores.
El flagelado no se divide, sino que revierte al estado de trofozoíto. En condiciones
adversas, el trofozoíto se transforma en un quiste circular (de 7 a 15 μm de
diámetro) resistente a tales condiciones.
3.3 Verificación de la prueba, a la evidencia objetiva que demuestre que este método
ha sido realizado en condiciones óptimas y en concordancia con la normativa
vigente.

t: 55 50 80 52 00
62
Revisión 1
5. CRITERIOS
5.1 Criterio No. 1.- Disposiciones generales
Los laboratorios que implementen el método para el aislamiento e identificación de los

géneros Acanthamoeba spp y Naegleria spp en muestras de agua para uso recreativo,
deberán aplicar las siguientes consideraciones:
 Los equipos empleados para esta determinación deberán estar incluidos en el

programa de mantenimiento correctivo y preventivo del laboratorio.
 La campana de flujo laminar e incubadoras deben ser calificadas

operacionalmente.
 Los termómetros utilizados deben estar calibrados y verificados.
 Revisar la fecha de caducidad de los medios de cultivo utilizados. Evitar el uso de

medios de cultivo caducos.
 La cepa de E. coli deberá estar pura y fenotípicamente caracterizada.
 Mostrar evidencia objetiva de todos los puntos anteriores.
5.2 Criterio No. 2.- Método analítico
La prueba tendrá validez si y sólo si,
 Se cumple en su totalidad con el Criterio No.1

 El analista ha sido capacitado en el método y se muestran evidencias objetivas
de este entrenamiento.
 El analista posee dominio del método y habilidad para diferenciar entre los
trofozoitos de Acanthamoeba spp y Naegleria spp.
5.3 Criterio No. 3.- Expresión de resultados
Dependiendo de las características del trofozoito encontrado en las placas de agar

NN/E. coli reportar como:
 Positivas al género Acanthamoeba spp

 Positivas al género Naegleria spp
 Cuando no hubo desarrollo de trofozoitos informar como ausente


t: 55 50 80 52 00
63
Revisión 1
No aplica
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
7.1
NMX-EC-17025-IMNC-2018.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. Tercera
7.2
edición. 2005.
Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water. 9-168. 21st
7.3
Edition. 2005.
8. ANEXOS.
No aplica

t: 55 50 80 52 00
64
Revisión 1
CCAYAC-CR-13/1. Criterios para la verificación metrológica
de balanzas.

t: 55 50 80 52 00
65
Revisión 1
CCAYAC-CR-13/1 Criterios para la verificación metrológica de balanzas.
1. OBJETIVO
Establecer los criterios para llevar a cabo la verificación metrológica de balanzas a

través de la estimación del error de medición.
2. ALCANCE
Aplica a las siguientes balanzas:
Tipo de balanza Resolución

Microbalanza 0.000001 g
Semi-micro balanza 0.00001 g
Balanza analítica 0.0001 g
0.001 g
Balanza granataria 0.01 g
0.1 g
3. DEFINICIONES
3.1 Clase de exactitud, a la designación de clase de una pesa o serie de pesas las cuales
cumplen con ciertas características metrológicas tales como forma, dimensiones,
calidad de la superficie, valor nominal, propiedades magnéticas y error máximo
permisible.
3.2 Excentricidad, al error relacionado con las variaciones en la posición de las pesas en
el platillo de la balanza.
3.3 Linealidad, a la capacidad que tiene una balanza de seguir una relación lineal entre
la carga depositada y el valor de medida indicado.
3.4 Masa nominal, a la masa especificada por el fabricante y usada para la identificación
de la pesa.
3.5 Repetibilidad, a la propiedad que tiene una balanza de mostrar resultados de
medida coincidentes en caso de pesadas repetidas del mismo objeto, del mismo
modo, en condiciones idénticas.
3.6 Sesgo de medida, a la diferencia entre la masa registrada por la balanza y la masa
nominal de la pesa patrón.
3.7 Verificación metrológica, al procedimiento de prueba aplicado a un instrumento
de medición para demostrar consistencia en su respuesta.

t: 55 50 80 52 00
66
Revisión 1
Los presentes criterios deben ser aplicados por los integrantes de la Red Nacional
de Laboratorios Estatales de Salud Pública, los laboratorios de ensayo Terceros
Autorizados ante la COFEPRIS y por los miembros del padrón de auditores y
evaluadores.
5. CRITERIOS
5.1 Criterio No. 1.- Consideraciones generales
5.1.1 Para el uso de la balanza se deben seguir las instrucciones establecidas por el
fabricante en el manual de operación.
5.1.2 La verificación metrológica de la balanza debe ser llevada a cabo en el área donde
se encuentra instalado el instrumento para su uso.
5.1.3 La verificación metrológica se lleva a cabo conforme a lo siguiente:
Tipo de verificación Frecuencia Característica metrológica

Error de medición contra
En uso El día de uso de la balanza
una pesa patrón
Intermedia Semestral Excentricidad
Excentricidad, sesgo de
Completa Anual medida, repetibilidad y
linealidad.
5.1.4 En la verificación metrológica intermedia se lleva a cabo la prueba de excentricidad

efectuando 5 pesadas de una masa aproximada al 30 % de la capacidad máxima de
la balanza, empleando siempre la misma pesa y de preferencia el mismo analista.
5.1.5 La verificación metrológica intermedia se utiliza como un criterio para prolongar
los intervalos de calibración de la balanza a un máximo de 3 años. Para ello se lleva
a cabo una prueba de F, con el fin de contrastar diferencias significativas en los
datos obtenidos.
5.1.6 La comprobación de la prueba se establece para constatar la veracidad de las
hipótesis establecidas:
 Hipótesis nula, Ho= no existe diferencia significativa en la varianza del peso
obtenido en la balanza en la masa patrón seleccionada a través del tiempo.
 Hipótesis alterna, H1= Existe diferencia significativa en la varianza del peso
obtenido en la balanza en la masa patrón seleccionada a través del tiempo.
5.1.7 Si no se cumplen con los criterios de aceptación establecidos, proceder como
sigue:

t: 55 50 80 52 00
67
Revisión 1
Tipo de verificación Acción
Evaluar las causas y repetir la prueba. De prevalecer la
En uso
desviación realizar la verificación completa
Intermedia Efectuar la verificación completa
Considerar la calibración con un organismo externo
Completa
acreditado en la norma 17025.
5.2 Criterio No. 2.- Pesas patrón
Las pesas patrón utilizadas en la verificación deben:
5.2.1 Cumplir con las especificaciones establecidas en el anexo 8.1 Errores máximos
permisibles para pesas.
5.2.2 Ser calibradas anualmente y contar con informe de calibración vigente y trazable a
patrones nacionales o internacionales.
5.2.3 Ser claramente identificadas y almacenadas en un ambiente libre de polvo.
5.2.4 Ser manipuladas con cuidado y con el uso de guantes o pinzas.
5.3 Criterio No. 3.- Preparación de la balanza

5.3.1 Colocar las pesas patrón cerca de la balanza a verificar por un tiempo mínimo de
30 minutos, con el fin de exponerlas a las mismas condiciones ambientales y
alcanzar el equilibrio térmico
5.3.2 Encender la balanza y dejar estabilizar por un tiempo no menor de 30 minutos.
Ajustar a una lectura de cero.
5.3.3 Si la balanza dispone del modo de calibración interna, llevarla a cabo de forma
periódica conforme a lo establecido en las instrucciones del fabricante.
5.4 Criterio No. 4.- Verificación metrológica en uso

5.4.1 Realizar el día de uso de la balanza y antes de efectuar las pesadas de rutina (solo
aplica para balanzas que son empleadas durante el desarrollo del método
analítico).
5.4.2 Seleccionar una pesa patrón cuya masa este dentro del intervalo normal de uso de
la balanza.
5.4.3 Efectuar una sola pesada en el centro del plato de la balanza. Registrar las masas
en g.
5.5 Criterio No. 5.- Excentricidad

5.5.1 Seleccionar una pesa patrón cuya masa sea aproximadamente el 30 % del valor de
la capacidad máxima de la balanza.

t: 55 50 80 52 00
68
Revisión 1
5.5.2 Efectuar 5 pesadas en diferentes posiciones del plato de la balanza como se
muestra en la siguiente figura:
Figura 1. Distribución del sitio de pesada para la prueba de excentricidad
5.5.3 No se debe tarar la balanza antes o durante las pesadas. Registrar las masas
individuales en g
5.5.4 Obtener la masa promedio (𝑥̅ ) y la desviación estándar (𝑠𝑟 ) de las masas
registradas.
5.5.5 Calcular la de desviación estándar relativa (RSDr).
5.6 Criterio No. 6.- Sesgo de medida

5.6.1 Tarar la balanza.
5.6.2 Seleccionar 3 pesas patrón cuyas masas sean aproximadamente el 5%, 50% y 100 %
del valor de la capacidad máxima de la misma.
5.6.3 Efectuar 10 mediciones de cada pesa patrón en el centro de la balanza, sin tarar
entre cada pesada. Registrar las masas individuales en g.
5.6.4 Calcular la masa promedio de cada una de las pesas.
5.6.5 Comparar el valor obtenido contra el error máximo permisible.
5.7 Criterio No. 7.- Repetibilidad

5.7.1 Con los datos registrados en la prueba de sesgo de medida, obtener la desviación
estándar (𝑠𝑟 ).
5.7.2 Calcular el %RSDr de cada una de las series de 10 datos.
5.8 Criterio No. 8.- Linealidad

5.8.1 Tarar la balanza.

t: 55 50 80 52 00
69
Revisión 1
5.8.2 Seleccionar una serie de 5 pesas patrón cuyas masas cubran el intervalo de uso de
la balanza. Considerar como nivel inferior un valor cercano al peso mínimo y como
nivel superior un valor cercano a la capacidad máxima de la balanza
5.8.3 Efectuar una pesada de cada una de ellas en el centro de la balanza.
5.8.4 Con los datos obtenidos y mediante un análisis de mínimos cuadrados elaborar un
gráfico de linealidad utilizando cada una de las masas obtenidas en el eje de las Y
vs las masas nominales en el eje de las X.
5.8.5 Calcular el coeficiente de correlación (r).
Los resultados obtenidos en la verificación metrológica deben ser reportados en g

conforme a los siguientes formatos:
Tipo de verificación Formato

CCAYAC-F-381 “Verificación metrológica en uso de
En uso
balanzas”.
CCAYAC-F-753 “Verificación metrológica intermedia de
Intermedia
balanzas”.
CCAYAC-F-754 “Verificación metrológica completa de
Completa
balanzas”.
5.10 Criterio No. 10.- Requerimientos metrológicos
Característica metrológica Criterio de aceptación

a) Error de ± 0.10 % con respecto a la masa
nominal de la pesa patrón utilizada (para masas
mayores a 500 mg)
Verificación metrológica en uso
b) Error de ± 0.50 % con respecto a la masa
nominal de la pesa patrón utilizada (para masas
menores a 500 mg)
Excentricidad %RSDr ≤ 0.05%
Error de ± 0.10 % con respecto a la masa nominal
Sesgo de medida
de la pesa patrón utilizada
Repetibilidad %RSDr ≤ 0.10%
Linealidad r ≥ 0.99
5.10.1 La veracidad de la hipótesis nula (Ho) en la verificación metrológica intermedia se

demuestra si:
 El valor de Fcalculada ≤ Ftablas

t: 55 50 80 52 00
70
Revisión 1
 El valor de probabilidad (p)  0.05
Documentos Clave
6.1 Verificación metrológica en uso de balanzas CCAYAC-F-381
6.2 Verificación metrológica intermedia de balanzas CCAYAC-F-753
6.3 Verificación metrológica completa de balanzas CCAYAC-F-754
Instructivo de operación para manejo y uso de las balanzas
6.4 CCAYAC-I-004
analíticas
6.5 CCAYAC-I-026
granatarias
Instructivo de operación para manejo y uso de la microbalanza
6.6 CCAYAC-I-092
Mettler Toledo modelo UMX2
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Davidson S., Perkin M., Buckley M., 2004. The Measurement of Mass and Weight.
7.1 Measurement Good Practice Guide No. 71.
http://publications.npl.co.uk/npl_web/pdf/mgpg71.pdf
International Accreditation New Zealand, 2002. Laboratory Balances-Calibration
7.2 Requirements. Technical Guide. First edition
http://www.ianz.govt.nz/resources/documents-2/technical-guides/
International Laboratory Accreditation Cooperation, 2007. Guidelines for the
7.3 determination of calibration intervals of measuring instruments. Guidance ILAC-G24
http://www.iec-ilac-iaf.org/doc/1007a.pdf
Morris C.E. Fen M.K. 2010. Monograph 4: NMI The Calibration of Weights and
7.4
Balances. Third edition.
National Association of Testing Authorities. General Accreditation Guidance 2018.
User checks and maintenance of laboratory balances.
7.5
https://www.nata.com.au/phocadownload/gen-accreditation-guidance/User-
Checks-and-Maintenance-of-Laboratory-Balances.pdf
International Laboratory Accreditation Cooperation, 2007. Guidelines for the
7.6 determination of calibration intervals of measuring instruments. Guidance ILAC-G24
http://www.iec-ilac-iaf.org/doc/1007a.pdf
OMCL Network of the Council of Europe, 2013. Quality Management Document.
Qualification of equipment. Annex 8: Qualification of Balances. PA/PH/OMCL (12)
7.7
77 7R
https://www.edqm.eu/medias/fichiers/annex_8_qualification_of_balances.pdf
Scorer T., Perkin M. and Buckley M., 2004. Weighing in the Pharmaceutical
7.8
Industry. Measurement Good Practice Guide No. 70

t: 55 50 80 52 00
71
Revisión 1
http://resource.npl.co.uk/docs/science_technology/mass_force_pressure/clubs_group
s/instmc_weighing_panel/pharmaweigh.pdf
Sutton C.M., Robinson J.E. Reid G.F and Clarkson M.T., 2018. Assuring the Quality of
7.9
Weighing Results. MSL Technical Guide 12. Version 6
7.1 Sutton C.M., Robinson J.E. Reid G.F and Clarkson M.T., 2018. Calibrating Balances.
0 MSL Technical Guide 25. Version 6
The United States Pharmacopoeia, 2019. 41 Balances, 1251 Weighing on an
7.11
Analytical Balance. Ed. 42.
United Kingdom Accreditation Service (UKAS), 2015. In-house Calibration and Use
of Weighing Machines. LAB 14
7.12
https://www.ukas.com/download/publications/publications-relating-to-laboratory-
accreditation/LAB%2014%20-%20Edition%205%20-%20July%202015.pdf
8. ANEXOS.
Anexo 1. Error máximo permisible para pesas (± en mg).

Anexo 2. Fórmulas estadísticas

t: 55 50 80 52 00
72
Revisión 1
Anexo 1
Error máximo permisible para pesas (± en mg)
Masa nominal
Clase E2 Clase F1 Clase F2
5 kg 8.0 25 80
2 kg 3.0 10 30
1 kg 1.6 5.0 16
500 g 0.8 2.5 8.0
200 g 0.3 1.0 3.0
100 g 0.16 0.5 1.6
50 g 0.10 0.3 1.0
20 g 0.08 0.25 0.8
10 g 0.06 0.20 0.6
5g 0.05 0.16 0.5
2g 0.04 0.12 0.4
1g 0.03 0.10 0.3
500 mg 0.025 0.08 0.25
200 mg 0.020 0.06 0.20
100 mg 0.016 0.05 0.16
50 mg 0.012 0.04 0.12
20 mg 0.010 0.03 0.10
10 mg 0.008 0.025 0.08
5 mg 0.006 0.020 0.06
2 mg 0.006 0.020 0.06
1 mg 0.006 0.020 0.06
OIML-R-111-1, 2004 (E). Weight of clases E1, E2, F1, F2, M1, M1-2, M2, M2-3 and M3. Part 1:
Metrological and technical requirements

t: 55 50 80 52 00
73
Revisión 1
Anexo 2
𝒏
𝒊=𝟏 𝒙
Media m=
n
𝑛 2
Desviación estándar √ 𝑖=1(𝑚 ̅)
−𝑚
sr =
n-1
Varianza 𝑠 2 = 𝑠𝑟2
2𝑠𝑟
Desviación estándar relativa 𝑅𝑆𝐷𝑟 = ∗ 100
𝑚
̅
[n( 𝑛 𝑛 𝑛
𝑖=1 𝑥𝑦 )-( 𝑖=1 𝑥 )( 𝑖=1 𝑦)]
r=
2 2 1/2
Coeficiente de correlación 𝑛 2 𝑛 𝑛 2 𝑛
[n( 𝑖=1 𝑥 )-( 𝑖=1 𝑥 ) ] - [n( 𝑖=1 𝑦 ) − ( 𝑖=1 𝑦) ]
[( n
i=1 x1i )2 +( n
i=1 x2i )2 ] [( n
i=1 x1i +
n
i=1 x2i )2 ]
- /L
n nm
Fcalculada =
[( n
i=1
2
x1i +
5
i=1
2
x2i - ) [( n
i=1 x1i )2 +( n
i=1 x2i )2 ]/n]/J
Dónde:
Fcalculada X1= Semestre 1
X2= Semestre 2
n= número de mediciones= 5
m= número de grupos= 2
L= Grados de libertad del numerador
(semestre)=1
J= Grados de libertad del denominador
(repeticiones)= 8

t: 55 50 80 52 00
74
Revisión 1
de material volumétrico de vidrio.

t: 55 50 80 52 00
75
Revisión 1
CCAYAC-CR-14/0 Criterios para la verificación metrológica de material volumétrico de
vidrio.
1 OBJETIVO.
Establecer los criterios para llevar a cabo la verificación metrológica de material

volumétrico por método gravimétrico, a través de la estimación del error de medición del
volumen calculado en uno o más puntos.
2 ALCANCE.
Material Volumen
Matraz volumétrico 1 a 5000 mL
Probeta graduada 5 a 2000 mL
Pipeta volumétrica 0.5 a 100 mL
Bureta 1 a 100 mL
Cuyos volúmenes tengan un efecto significativo en la exactitud de la prueba.
3 DEFINICIONES
3.1 Error máximo permisible, al valor extremo superior o inferior permitido para la
desviación del volumen contenido o vaciado con respecto al volumen nominal del
instrumento volumétrico.
3.2 Verificación metrológica, a la aportación de evidencia objetiva de que un elemento
satisface los requisitos especificados.
3.3 Volumen nominal, al volumen máximo especificado por el fabricante y usado para
identificación del intervalo de medición.
3.4 Volumen vaciado, al volumen de líquido descargado por un instrumento
volumétrico.
4 RESPONSABILIDADES.
5 CRITERIOS
5.1 Criterio No. 1.- Clasificación del material volumétrico

t: 55 50 80 52 00
76
Revisión 1
Matraz volumétrico
Contenido (In)
Probeta graduada
Pipeta volumétrica
Vaciado (Ex)
Bureta
5.2 Criterio No. 2.- Características del material volumétrico
5.2.1 La superficie del vidrio debe estar limpia.

5.2.2 No debe presentar estrellamiento o roturas.
5.2.3 Las graduaciones e inscripciones deben ser legibles.
5.2.4 Las puntas de las pipetas y buretas no deben estar dañadas.
5.2.5 La llave de la bureta debe tener cierre hermético.
5.3 Criterio No. 3 Consideraciones generales
5.3.1 El instrumento volumétrico y el agua de prueba deben ser previamente

atemperados por un periodo mínimo de 1 h en el área donde se lleva a cabo la
verificación.
5.3.2 La temperatura del agua y presión del aire deben ser registradas.
5.3.3 Si no se dispone de un barómetro para la medición de la presión del aire local, el
valor puede obtenerse llamando al centro meteorológico de la región o por consulta
en su sitio web. Debe expresarse en hPa.
5.3.4 La verificación del material volumétrico se lleva a cabo por triplicado y con respecto
a su volumen nominal
5.3.5 El volumen del material volumétrico es expresado a 20 °C.
5.3.6 El error calculado en los volúmenes de contenido o vaciado según corresponda,
debe ser menor o igual al error máximo permisible establecido en el numeral 5.11.
5.3.7 Se recomienda que el material volumétrico no se someta a una temperatura por
encima de 180 ° C.
5.3.8 La verificación metrológica del material volumétrico de vidrio debe ser programada
utilizando el formato CCAYAC-F-484 vigente. Los intervalos iniciales de verificación
no deben exceder de un año.
5.3.9 La frecuencia de la verificación puede extenderse hasta por tres años, si en tres años
consecutivos se cumplen con los criterios de aceptación establecidos.
5.3.10 Si se cuenta con un certificado de calibración emitido por el fabricante, considerarlo
como la verificación inicial.
5.4 Criterio No. 4.- Equipo y materiales requeridos

t: 55 50 80 52 00
77
Revisión 1
Equipo Volumen de prueba Resolución
100 µL  V ≤ 10 mL 0.0001 g
10 mL  V  1000 mL 0.001
Balanza verificada y calibrada
1000 mL ≤ V ≤ 2000 mL 0.01
V  2000 mL 0.1
5.4.1 Termómetro verificado y calibrado que cumpla con un error máximo de 0.2 °C.
5.4.2 Matraz volumétrico de vidrio con tapón, utilizado como reservorio. El volumen
nominal depende del volumen de líquido a ser medido.
5.4.3 Agua mínimo grado 3.
5.5 Criterio No. 5.- Método gravimétrico
Para la verificación metrológica se deben seguir estos pasos generales:
5.5.1 Identificar el material.

5.5.2 Medir la temperatura inicial del agua (Ti).
5.5.3 Pesar el material volumétrico o el reservorio vacíos (P1) según corresponda y tarar la
balanza. Llenar el instrumento volumétrico o dispensar el líquido de prueba
lentamente hacia el reservorio, según corresponda. Registrar la masa (P2).
5.5.4 Alternativamente, se pueden efectuar dos pesadas, una referida al material
volumétrico o reservorio vacío (P1) y otra al material volumétrico o reservorio lleno
(P2).
5.5.5 Repetir el llenado o dispensado del líquido de prueba dos veces más para cada
volumen de prueba.
5.5.6 Medir la temperatura del agua nuevamente (Tf).
5.5.7 Calcular la temperatura promedio del agua y redondear a 1°C.
Ti  Tf
Tprom 
2
5.5.8 Registrar los tres pesos individuales.

5.5.9 Seleccionar el factor de Z correspondiente a la temperatura promedio calculada
utilizando la tabla del Anexo 8.1.
5.6 Criterio No. 6.-Cálculo del volumen a 20 °C
V20C  (P2 - P1 ) * Z

t: 55 50 80 52 00
78
Revisión 1
Dónde:
Z= Factor de Z (µL/mg) a la presión del aire registrada y a la temperatura promedio
del agua calculada.
P2= Peso del material o reservorio llenos
P1= Peso del material o reservorio vacío. Si se emplea la tara de la balanza, este valor
es igual a cero.
5.7 Criterio No. 7.- Cálculo del error

Error  V20C  Vn
Dónde:
V20°C= Volumen promedio a 20°C
Vn = Volumen verificado
Expresar el resultado conforme al número de decimales establecidos en las tablas

de errores máximos permisibles
5.8 Criterio No. 8.- Consideraciones para matraces volumétricos y probetas
5.8.1 Deben ser llenados a una distancia aproximada de 5 mm por encima de la marca
del volumen nominal.
5.8.2 Las paredes del material por arriba de la marca no deben estar humedecidas.
Secar de ser necesario.
5.8.3 El aforo final debe ser hecho con la ayuda de una pipeta Pasteur de preferencia de
plástico.
5.9 Criterio No. 9.- Consideraciones para pipetas volumétricas.
5.9.1 Deben ser sujetadas en posición vertical y llenada a una distancia aproximada de 5
mm por arriba de la marca del volumen nominal. El líquido remanente de las
paredes exteriores debe ser removido.
5.9.2 El ajuste final del menisco debe hacerse por liberación del líquido hasta la marca.
5.9.3 La liberación del volumen de prueba al reservorio debe hacerse con un flujo
continuo, con la punta de la pipeta en contacto con las paredes internas del
reservorio.
5.10 Criterio No. 10.- Consideraciones para buretas
5.10.1 Deben ser sujetadas en posición vertical y llenada a una distancia aproximada de 5
mm por encima de la marca del volumen nominal. El líquido remanente de las
paredes exteriores debe ser removido.
5.10.2 La llave de paso y el interior de la bureta debe estar libres de burbujas de aire.

t: 55 50 80 52 00
79
Revisión 1
5.10.3 El ajuste del menisco debe hacerse por liberación del líquido hasta la marca.
5.10.4 La liberación del volumen de prueba seleccionado, debe hacerse con un flujo
continuo sin tocar las paredes internas del reservorio, hasta que el menisco esté
aproximadamente 5 mm por arriba de la línea de graduación a ser verificada.
Finalmente, fijar el menisco a la línea que corresponde al volumen de prueba.
Eliminar cualquier gota adherida tocando la punta de la bureta con las paredes del
reservorio en un ángulo aproximado de 30 °.
5.10.5 La verificación debe llevarse a cabo a 20%, 40%, 60%, 80% y 100% de su volumen
nominal, cada nivel por triplicado. El error máximo permisible que aplica para
todos los niveles es el correspondiente al del volumen nominal (100%).
5.11 Criterio No. 11.- Evaluación de la conformidad
Los valores obtenidos en los cálculos del error de medición deben ser comparados, según
corresponda, contra los errores máximos permisibles establecidos en las siguientes tablas
y éstos, no deben exceder los valores especificados.
5.11.1 Matraces volumétricos

Error máximo permisible
Volumen nominal
(± mL)
mL
Vidrio Polipropileno
1 0.025 0.050
2 0.025 0.050
5 0.025 0.050
10 0.025 0.050
20 0.040 0.080
25 0.040 0.080
50 0.060 0.120
100 0.100 0.200
250 0.150 0.300
500 0.250 0.500
1000 0.400 0.800
2000 0.600 1.200
5000 1.200 2.400
ISO 1042:1998 Laboratory glassware-One Mark Volumetric flasks
5.11.2 Probetas graduadas

t: 55 50 80 52 00
80
Revisión 1
Volumen nominal Error máximo permisible
mL (± mL)
5 0.05
10 0.1
25 0.25
50 0.5
100 0.5
250 1
500 2.5
1000 5
2000 10
ISO 4788:2005 Laboratory glassware-Graduated measuring cylinders
5.11.3 Pipetas volumétricas

mL (± mL)
0.5 0.005
1 0.008
2 0.010
5 0.015
10 0.02
20 0.03
25 0.03
50 0.05
100 0.08
ISO 648-2008 Laboratory glassware-Single-volume pipettes
5.11.4 Buretas

mL (± mL)
1 0.006
2 0.01
5 0.01
10 0.02
25 0.03
50 0.05
100 0.10
ISO 385:2005 Laboratory glassware-Burettes

t: 55 50 80 52 00
81
Revisión 1
Los resultados obtenidos en la verificación deben ser reportados en el CCAYAC-F-146

“Verificación metrológica matraces, pipetas y probetas” o CCAYAC-F-147 “Verificación
metrológica de buretas” según corresponda.
6 DOCUMENTOS DE REFERENCIA.
Documentos Clave
6.1 CCAYAC-I-004
analíticas
6.2 Cronograma de verificación de material volumétrico CCAYAC-F-484
7 BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Blaubrand, 2015. Aparatos volumétricos y picnómetros. Instrucciones de
7.1 calibrado (SOP)
http://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/SOPs/SOP_BLAUBRAND_ES.pdf
ISO 1042: 1998. Laboratory glassware – One Mark volumetric flasks. Confirmed in
7.2
2017
7.3 ISO 385:2005. Laboratory glassware- Burettes. Confirmed in 2014
ISO 3696:1987. Water for analytical laboratory use-Specification and test
7.4
methods. Confirmed in 2018
ISO 4787:2010. Laboratory glassware- Volumetric instruments- Methods for
7.5
testing of capacity and for use. Confirmed in 2017
ISO 4788:2005 Laboratory glassware – Graduated measuring cylinders.
7.6
Confirmed in 2014
7.7 ISO 648: 2008. Laboratory glassware- Single – volume pipettes. Confirmed in 2017
OMCL Network of the Council of Europe, 2016. Quality Management Document.
Management of Volumetric Glassware. PA/PH/OMCL (15) 16 3R.
7.8
https://www.edqm.eu/sites/default/files/quality_management_guideline_on_man
agement_of_volumetric_glassware_2016.pdf
United Kingdom Accreditation (UKAS), 2019. Traceability: Volumetric Apparatus.
LAB 15. Edition 3.
7.9
https://www.ukas.com/download/publications/publications-relating-to-
laboratory-accreditation/LAB-15-Edition-3-April-2019.pdf
8 ANEXOS
Anexo 1: Factor de Z (µL/mg)

Anexo 2: Requisitos para el agua grado 3

t: 55 50 80 52 00
82
Revisión 1
Anexo 1
Factor de Z (µL/mg)
Presión del aire
Temperatura hPa
°C
850 880 910 940 970 1000 1030 1060
15.0 1.00185 1.00188 1.00191 1.00195 1.00198 1.00201 1.00204 1.00207
15.2 1.00188 1.00191 1.00194 1.00197 1.00201 1.00204 1.00207 1.00210
15.4 1.00191 1.00194 1.00197 1.00200 1.00203 1.00207 1.00210 1.00213
15.6 1.00194 1.00197 1.00200 1.00203 1.00206 1.00209 1.00213 1.00216
15.8 1.00196 1.00200 1.00203 1.00206 1.00209 1.00212 1.00216 1.00219
16.0 1.00199 1.00203 1.00206 1.00209 1.00212 1.00215 1.00218 1.00222
16.2 1.00202 1.00206 1.00209 1.00212 1.00215 1.00218 1.00221 1.00225
16.4 1.00205 1.00209 1.00212 1.00215 1.00218 1.00221 1.00225 1.00228
16.6 1.00209 1.00212 1.00215 1.00218 1.00221 1.00224 1.00228 1.00231
16.8 1.00212 1.00215 1.00218 1.00221 1.00224 1.00228 1.00231 1.00234
17.0 1.00215 1.00218 1.00221 1.00224 1.00228 1.00231 1.00234 1.00237
17.2 1.00218 1.00221 1.00225 1.00228 1.00231 1.00234 1.00237 1.00240
17.4 1.00222 1.00225 1.00228 1.00231 1.00234 1.00237 1.00241 1.00244
17.6 1.00225 1.00228 1.00231 1.00234 1.00238 1.00241 1.00244 1.00247
17.8 1.00228 1.00231 1.00235 1.00238 1.00241 1.00244 1.00247 1.00250
18.0 1.00232 1.00235 1.00238 1.00241 1.00244 1.00247 1.00251 1.00254
18.2 1.00235 1.00238 1.00241 1.00245 1.00248 1.00251 1.00254 1.00257
18.4 1.00239 1.00242 1.00245 1.00248 1.00251 1.00254 1.00258 1.00261
18.6 1.00242 1.00245 1.00249 1.00252 1.00255 1.00258 1.00261 1.00264
18.8 1.00246 1.00249 1.00252 1.00255 1.00258 1.00262 1.00265 1.00268
19.0 1.00249 1.00253 1.00256 1.00259 1.00262 1.00265 1.00268 1.00272
19.2 1.00253 1.00256 1.00259 1.00263 1.00266 1.00269 1.00272 1.00275
19.4 1.00257 1.00260 1.00263 1.00266 1.00270 1.00273 1.00276 1.00279

t: 55 50 80 52 00
83
Revisión 1
Presión del aire
Temperatura hPa
°C
850 880 910 940 970 1000 1030 1060
19.6 1.00261 1.00264 1.00267 1.00270 1.00273 1.00276 1.00280 1.00283
19.8 1.00265 1.00268 1.00271 1.00274 1.00277 1.00280 1.00283 1.00287
20.0 1.00268 1.00272 1.00275 1.00278 1.00281 1.00284 1.00287 1.00290
20.2 1.00272 1.00275 1.00279 1.00282 1.00285 1.00288 1.00291 1.00294
20.4 1.00276 1.00279 1.00283 1.00286 1.00289 1.00292 1.00295 1.00298
20.6 1.00280 1.00283 1.00287 1.00290 1.00293 1.00296 1.00299 1.00302
20.8 1.00284 1.00287 1.00291 1.00294 1.00297 1.00300 1.00303 1.00306
21.0 1.00288 1.00292 1.00295 1.00298 1.00301 1.00304 1.00307 1.00310
21.2 1.00292 1.00296 1.00299 1.00302 1.00305 1.00308 1.00311 1.00314
21.4 1.00297 1.00300 1.00303 1.00306 1.00309 1.00312 1.00315 1.00319
21.6 1.00301 1.00304 1.00307 1.00310 1.00313 1.00316 1.00320 1.00323
21.8 1.00305 1.00308 1.00311 1.00314 1.00318 1.00321 1.00324 1.00327
22.0 1.00309 1.00313 1.00316 1.00319 1.00322 1.00325 1.00328 1.00331
22.2 1.00314 1.00317 1.00320 1.00323 1.00326 1.00329 1.00332 1.00336
22.4 1.00318 1.00321 1.00324 1.00327 1.00331 1.00334 1.00337 1.00340
22.6 1.00322 1.00326 1.00329 1.00332 1.00335 1.00338 1.00341 1.00344
22.8 1.00327 1.00330 1.00333 1.00336 1.00339 1.00343 1.00346 1.00349
23.0 1.00331 1.00335 1.00338 1.00341 1.00344 1.00347 1.00350 1.00353
23.2 1.00336 1.00339 1.00342 1.00345 1.00348 1.00352 1.00355 1.00358
23.4 1.00341 1.00344 1.00347 1.00350 1.00353 1.00356 1.00359 1.00362
23.6 1.00345 1.00348 1.00351 1.00354 1.00358 1.00361 1.00364 1.00367
23.8 1.00350 1.00353 1.00356 1.00359 1.00362 1.00365 1.00368 1.00372
24.0 1.00354 1.00358 1.00361 1.00364 1.00367 1.00370 1.00373 1.00376
24.2 1.00359 1.00362 1.00365 1.00369 1.00372 1.00375 1.00378 1.00381
24.4 1.00364 1.00367 1.00370 1.00373 1.00376 1.00379 1.00383 1.00386
24.6 1.00369 1.00372 1.00375 1.00378 1.00381 1.00384 1.00387 1.00390
24.8 1.00374 1.00377 1.00380 1.00383 1.00386 1.00389 1.00392 1.00395

t: 55 50 80 52 00
84
Revisión 1
Presión del aire
Temperatura
°C
hPa
850 880 910 940 970 1000 1030 1060
25.0 1.00379 1.00382 1.00385 1.00388 1.00391 1.00394 1.00397 1.00400
25.2 1.00383 1.00387 1.00390 1.00393 1.00396 1.00399 1.00402 1.00405
25.4 1.00388 1.00392 1.00395 1.00398 1.00401 1.00404 1.00407 1.00410
25.6 1.00393 1.00397 1.0040 1.00403 1.00406 1.00409 1.00412 1.00415
0
25.8 1.00398 1.00402 1.00405 1.00408 1.00411 1.00414 1.00417 1.00420
26.0 1.00404 1.00407 1.00410 1.00413 1.00416 1.00419 1.00422 1.00425
26.2 1.00409 1.00412 1.00415 1.00418 1.00421 1.00424 1.00427 1.00430
26.4 1.00414 1.00417 1.00420 1.00423 1.00426 1.00429 1.00432 1.00435
26.6 1.00419 1.00422 1.00425 1.00428 1.00431 1.00434 1.00438 1.00441
26.8 1.00424 1.00427 1.00430 1.00433 1.00437 1.00440 1.00443 1.00446
27.0 1.00430 1.00433 1.00436 1.00439 1.00442 1.00445 1.00448 1.00451
27.2 1.00435 1.00438 1.00441 1.0044 1.00447 1.00450 1.00453 1.00456
4
27.4 1.00440 1.00443 1.00446 1.00449 1.00452 1.00456 1.00459 1.00462
27.6 1.00446 1.00449 1.00452 1.00455 1.00458 1.00461 1.00464 1.00467
27.8 1.00451 1.00454 1.00457 1.00460 1.00463 1.00466 1.00469 1.00472
28.0 1.00456 1.00460 1.00463 1.00466 1.00469 1.00472 1.00475 1.00478
28.2 1.00462 1.00465 1.00468 1.00471 1.00474 1.00477 1.00480 1.00483
28.4 1.00467 1.00471 1.00474 1.00477 1.00480 1.00483 1.00486 1.00489
28.6 1.00473 1.00476 1.00479 1.00482 1.00485 1.00488 1.00491 1.00494
28.8 1.00479 1.00482 1.00485 1.00488 1.00491 1.00494 1.00497 1.00500
29.0 1.00484 1.00487 1.00490 1.00493 1.00497 1.00500 1.00503 1.00506
29.2 1.00490 1.00493 1.00496 1.00499 1.00502 1.00505 1.00508 1.00511
29.4 1.00496 1.00499 1.00502 1.00505 1.00508 1.00511 1.00514 1.00517
29.6 1.00501 1.00504 1.00508 1.00511 1.00514 1.00517 1.00520 1.00523
29.8 1.00507 1.00510 1.00513 1.00516 1.00519 1.00522 1.00526 1.00529
30.0 1.00513 1.00516 1.00519 1.00522 1.00525 1.00528 1.00531 1.00534
ISO 4787:2010 Laboratory glassware-Volumetric instruments-Methods for testing of capacity
and for use

t: 55 50 80 52 00
85
Revisión 1
Anexo 2
Requisitos para el agua grado 3
Parámetro Grado 3
pH a 25°C 5 a 7.5
Conductividad eléctrica máxima ≤ 0.5 mS/m
ISO 3696:1987. Water for analytical laboratory use-Specification and test methods

t: 55 50 80 52 00
86
Revisión 1
de aparatos volumétricos operados por pistón.

t: 55 50 80 52 00
87
Revisión 1
CCAYAC-CR-15/0 Criterios para la verificación metrológica de aparatos volumétricos
operados por pistón.
1 OBJETIVO.
Establecer los criterios para llevar a cabo la verificación metrológica de aparatos

volumétricos operados por pistón, a través de la determinación de los errores aleatorio y
sistemático del volumen calculado por método gravimétrico en uno o más puntos.
2 ALCANCE.
Aplica a los siguientes aparatos operados por pistón en modo manual y electrónico:
Aparato Volumen
Pipetas de pistón unicanal y multicanal 1 µL a 10 mL
Bureta de pistón Hasta 100 mL
Dispensador simple 10 µL a 200 mL
Dispensador de liberación múltiple 1 µL a 200 mL
Cuyos volúmenes tengan un efecto significativo en la exactitud de la prueba
3 DEFINICIONES.
3.1 Aparatos volumétricos operados por pistón, a los dispositivos destinados para
aspirar o liberar volúmenes específicos de líquidos; pueden ser operados manual o
automáticamente y son controlados por medios mecánicos, electromecánicos o
electrónicos.
3.2 Bureta de pistón, al aparato diseñado para liberar líquido progresivamente hasta
que el volumen liberado es suficiente para satisfacer criterios analíticos tales cambio
de color, pH, conductividad o polarización.
3.3 Dispensador, al aparato usado para el suministro repetitivo (dispensación) de un
volumen medido del líquido.
3.4 Error aleatorio, a la dispersión de los volúmenes dispensados alrededor de la media
de estos volúmenes. Es expresado como el coeficiente de variación de diez
mediciones.
3.5 Error sistemático, a la diferencia entre el volumen dispensado y el volumen nominal
o volumen seleccionado del aparato volumétrico operado por pistón. Es expresado
como la desviación de la media de diez mediciones con respecto al volumen
nominal o volumen seleccionado.
3.6 Pipeta de pistón, al aparato utilizado para recolectar y liberar líquidos. Pueden ser
de un solo canal o canales múltiples.

t: 55 50 80 52 00
88
Revisión 1
satisface los requisitos especificados
3.8 Volumen fijo, al que es diseñado y suministrado por el fabricante, para dispensar un
volumen específico y fijo del líquido (definido como el volumen nominal).
3.9 Volumen nominal, al volumen especificado por el fabricante y usado para la
identificación del intervalo de medición. Corresponde al volumen máximo que
puede ser fijado por el usuario y que es especificado por el fabricante.
3.10 Volumen variable, al volumen del líquido que el usuario pueda ajustar para ser
dispensado sobre un intervalo especificado por el fabricante. Para este caso el
volumen nominal es definido como el límite superior del intervalo del volumen
designado por el fabricante.
4 RESPONSABILIDADES.
Laboratorios Estatales de Salud Pública, los laboratorios de ensayo Terceros Autorizados
ante la COFEPRIS y por los miembros del padrón de auditores y evaluadores.
5 CRITERIOS.
5.1 Criterio No. 1.- Clasificación de los aparatos volumétricos operados por pistón
 Pipetas de pistón unicanal de volumen fijo
 Pipetas de pistón unicanal de volumen variable
 Pipetas de pistón multicanal de volumen fijo
 Pipetas de pistón multicanal de volumen variable
 Buretas de pistón automáticas
 Buretas de pistón manuales
 Dispensadores simples
 Dispensadores de liberación múltiple

5.2.1 El personal que realice la actividad descrita en estos criterios debe tener la
competencia para realizarlo y aplicar las Buenas Prácticas de Laboratorio.
5.2.2 Verificar que el aparato operado por pistón se encuentre en condiciones óptimas
de operación (retenga el líquido o no gotee).
5.2.3 La conformidad de los errores máximos permisibles debe ser verificada cada 6
meses como parte de la rutina de Control de Calidad Analítico.
5.2.4 Todo el material que se utilice durante la verificación debe ser previamente
atemperado como mínimo durante 2 h en el área donde se realizará la verificación.
5.2.5 Los errores sistemáticos y aleatorios de los aparatos volumétricos de volumen fijo
deben ser verificados en su volumen nominal.

t: 55 50 80 52 00
89
Revisión 1
5.2.6 Los errores sistemáticos y aleatorios de los aparatos volumétricos de volumen
variable deben ser verificados a tres volúmenes diferentes:
a) Volumen nominal
b) Volumen mínimo (50% el valor del volumen nominal)
c) Volumen (10% del valor del volumen nominal)
5.2.7 Se deben efectuar 10 mediciones para cada volumen evaluado.
5.2.8 En las pipetas de pistón multicanal, se debe considerar cada canal de forma
independiente.
5.2.9 Las puntas usadas para la verificación de las pipetas de pistón, deben ser las
mismas que son utilizadas durante el trabajo de rutina del laboratorio.
5.2.10 Si no se dispone de una balanza analítica con una resolución ≤ 0.00001 g, y las
condiciones apropiadas para su uso, los aparatos de pistón de volúmenes
nominales menores a 100 µL no se verifican, éstos solo deben ser calificados por
una compañía externa acreditada en la norma NMX/EC/17025 vigente de
conformidad con las especificaciones establecidas en la norma ISO-8655 vigente.
5.2.11 Para la aplicación de estos criterios se deben tomar en cuenta las instrucciones y
las especificaciones técnicas del fabricante.
5.3 Criterio No. 3.- Equipo y material requerido

5.3.1 Balanza analítica calibrada y verificada de una resolución apropiada al volumen a
verificar:
Volumen de prueba Resolución

1 µL ≤ V 10 µL 0.000001 g
10 µL  V ≤ 100 µL 0.00001 g
100 µL  V ≤ 1000 µL 0.0001 g
1 mL  V ≤ 10 mL 0.0001 g
10 mL  V ≤ 200 mL 0.001 g
5.3.2 Termómetro calibrado y verificado con una incertidumbre máxima de 0.2 °C

5.3.3 Barómetro calibrado con una incertidumbre máxima de 0.5 kPa. Si no se dispone
de un barómetro para la medición de la presión del aire local, el valor puede
obtenerse llamando al centro meteorológico de la región o por consulta en su
sitio web. Debe expresarse en kPa.
5.3.4 Recipiente de vidrio con tapa (pesafiltro o matraz)
5.3.5 Agua destilada o desionizada (mínimo grado 3)
5.4 Criterio No. 4.- Método gravimétrico

5.4.1 Medir la temperatura inicial del agua (Ti).
5.4.2 Pesar el recipiente de vidrio y tarar la balanza.

t: 55 50 80 52 00
90
Revisión 1
5.4.3 Dispensar el líquido de prueba lentamente hacia el recipiente de vidrio. Registrar
la masa.
5.4.4 Repetir el dispensado del líquido de prueba 9 veces más para cada volumen de
prueba.
5.4.5 Medir la temperatura del agua nuevamente (Tf).
5.4.6 Calcular la temperatura promedio del agua y redondear a 0.5°C.
Ti  Tf
Tprom 
2
5.4.7 Registrar los diez pesos individuales y obtener el peso promedio (𝑚 ̅ ) y la
desviación estándar de los valores (sr).
5.4.8 Seleccionar el factor de Z correspondiente a la temperatura promedio calculada y
presión del aire registrada, utilizando las tablas del Anexo 8.1.
5.5 Criterio No. 5.-Cálculo del volumen a 20 °C
𝑉= 𝑚 ̅ ∗𝑍
Dónde:
𝑉 =Volumen promedio a 20 °C
̅ =Peso promedio
𝑚
Z=Factor de Z a la presión del aire registrada y a la temperatura promedio calculada.
Sólo para el caso de pipetas de pistón, multiplicar por un factor de 1000 para
expresar el volumen en µL.
5.6 Criterio No. 6.- Cálculo del error sistemático
𝑒𝑠 = 𝑉 − 𝑉𝑠
Dónde:
𝑒𝑠 = error sistemático
𝑉= Volumen promedio a 20°C
Vs = Volumen seleccionado
Expresar el resultado conforme a los decimales establecidos en las tablas de errores
máximos permisibles.
5.7 Criterio No. 7.- Cálculo del error aleatorio
sr *Z Vs
%RSDr =100* *
V̅ Vo
Dónde:
% RSDr= Porciento de desviación estándar relativa
sr = desviación estándar de los pesos individuales

t: 55 50 80 52 00
91
Revisión 1
Z= Factor de Z a la presión del aire registrada y a la temperatura promedio
calculada.
𝑉= Volumen promedio a 20°C
Vs = Volumen seleccionado
Vo = Volumen nominal
Expresar el resultado conforme a los decimales establecidos en las tablas de errores

máximos permisibles.
5.8 Criterio No. 8.- Consideraciones para pipetas de pistón unicanal

5.8.1 Seleccionar el volumen de prueba
5.8.2 Colocar la punta seleccionada en la pipeta.
5.8.3 Llenar la punta con el agua y expulsar el líquido a los desechos cinco veces para
alcanzar el equilibrio en la humedad.
5.8.4 Reemplazar la punta. Llenarla con agua soltando el pistón lentamente. Retirar la
pipeta del agua de forma vertical. Tocar la punta con las paredes del recipiente
de vidrio.
5.8.5 Expulsar el agua a los desechos para prehumedecer la punta y rellenar como se
explicó anteriormente.
5.8.6 Liberar el contenido de la pipeta hacia el recipiente de vidrio tarado, tocando la
punta con las paredes del recipiente por encima de la superficie del líquido, en
un ángulo aproximado de 30° a 45 ° para eliminar las gotas alrededor del orificio
de la punta.
5.9 Criterio No. 9.- Consideraciones para pipetas de pistón multicanal

5.9.1 Aplican los mismos que para las pipetas unicanal.
5.9.2 Cada canal debe ser considerado como un canal individual y debe ser evaluado y
reportado como tal.
5.10 Criterio No. 10.- Consideraciones para buretas de pistón

5.10.1 Se debe cargar la bureta con el agua conforme a las especificaciones del
fabricante. Esta debe estar libre de burbujas.
5.10.2 Liberar el agua hacia el reservorio tarado, hasta que el volumen seleccionado es
alcanzado.
5.10.3 Asegurar que el pesado se lleva a cabo hasta que la última gota ha sido liberada.
5.10.4 Cuando se evalúan los volúmenes medio e inferior, no es necesario reajustar a
cero previo a la siguiente medición.
5.11 Criterio No. 11.- Consideraciones para dispensadores

5.11.1 Efectuar una primera liberación del agua hacia los desechos y limpiar las gotas que
se hayan formado en la boquilla del dispensador. Rellenar el dispensador conforme
a las instrucciones del fabricante.

t: 55 50 80 52 00
92
Revisión 1
5.11.2 Para los dispensadores de liberación múltiple, no llevar el pistón a su posición
inicial entre cada uno de los 10 ciclos de prueba si queda suficiente líquido para
liberar la siguiente dosis.
5.11.3 Utilizar los 10 volúmenes liberados subsecuentemente dentro del recipiente de
vidrio con tapa para determinar los errores sistemáticos y aleatorios de la medición.
5.12 Criterio No. 12.- Evaluación de la conformidad

5.12.1 Los valores obtenidos en los cálculos de los errores sistemático (numeral 5.6) y
aleatorio (numeral 5.7) deben ser comparados, según corresponda, con los errores
máximos permisibles establecidos en las siguientes tablas y éstos no deben
exceder los valores especificados.
5.12.2 Para los aparatos cuyo valor de volumen no esté considerado en las tablas de los
límites máximos permisibles, se debe aplicar el criterio establecido para el volumen
inmediato superior.
5.12.3 Para los aparatos de volumen variable, los límites máximos permisibles del error
sistemático para el volumen nominal aplican al intervalo completo.
5.12.4 Para los aparatos de volumen variable, los límites máximos permisibles del error
aleatorio aplican de forma individual a cada volumen seleccionado.
5.12.5 Errores máximos permisibles para pipetas de pistón unicanal de volumen fijo y
variable
Error sistemático Error aleatorio máximo
Volumen nominal (µL)
máximo permisible ( ± µL) Permisible (± %)
1 0.05 5
2 0.08 2
5 0.125 1.5
10 0.12 0.8
20 0.2 0.5
50 0.5 0.4
100 0.8 0.3
200 1.6 0.3
500 4.0 0.3
1000 8.0 0.3
2000 16.0 0.3
5000 40.0 0.3
10000 60.0 0.3
ISO 8655-2:2002. Piston- Operated volumetric apparatus-Part 2: Piston pipettes.
5.12.6 Errores máximos permisibles para pipetas de pistón multicanal de volumen fijo y
variable

t: 55 50 80 52 00
93
Revisión 1
Volumen nominal
máximo permisible permisible
(µL)
(± µL) (± %)
1 0.10 10.0
2 0.16 4.0
5 0.25 3.0
10 0.24 1.6
20 0.40 1.0
50 1.0 0.8
100 1.6 0.6
200 3.2 0.6
500 8.0 0.6
1000 16.0 0.6
2000 32.0 0.6
5000 80.0 0.6
10000 120.0 0.6
ISO 8655-2:2002. Piston- Operated volumetric apparatus-Part 2: Piston pipettes.
5.12.7 Errores máximos permisibles para buretas de pistón automáticas

Volumen nominal
(mL)
(± mL) (± %)
≤1 0.006 0.1
2 0.010 0.1
5 0.015 0.1
10 0.020 0.07
20 0.040 0.07
25 0.050 0.07
50 0.1 0.05
100 0.2 0.03
ISO 8655-3:2002. Piston- Operated volumetric apparatus-Part 3: Piston burettes.

t: 55 50 80 52 00
94
Revisión 1
5.12.8 Errores máximos permisibles para buretas de pistón manuales

Volumen nominal
(mL)
(± mL) (± %)
≤1 0.006 0.1
2 0.010 0.1
5 0.015 0.1
10 0.030 0.1
20 0.040 0.1
25 0.050 0.1
50 0.1 0.1
100 0.2 0.1
ISO 8655-3:2002. Piston- Operated volumetric apparatus-Part 3: Piston burettes.
5.12.9 Errores máximos permisibles para dispensadores simples

Volumen nominal
(mL)
(± mL) (± %)
0.01 0.0002 1.0
0.02 0.0004 0.5
0.05 0.00075 0.4
0.1 0.0015 0.3
0.2 0.0020 0.3
0.5 0.0050 0.2
1 0.006 0.2
2 0.012 0.2
5 0.030 0.2
10 0.060 0.2
25 0.15 0.2
50 0.30 0.2
100 0.60 0.2
200 1.2 0.2
ISO 8655-5:2002. Piston- Operated volumetric apparatus- Part 5: Dispensers

t: 55 50 80 52 00
95
Revisión 1
5.12.10 Errores máximos permisibles para dispensadores de liberación múltiple

Volumen nominal
(mL)
(± mL) (± %)
0.001 0.00005 5.0
0.002 0.000075 5.0
0.003 0.0001 3.5
0.01 0.0002 2.5
0.02 0.0003 2.0
0.05 0.0005 1.5
0.1 0.001 1.0
0.2 0.002 1.0
0.5 0.005 0.6
1 0.01 0.4
2 0.016 0.4
5 0.030 0.3
10 0.050 0.3
25 0.125 0.3
50 0.250 0.25
100 0.500 0.25
200 1.000 0.25
ISO 8655-5:2002. Piston- Operated volumetric apparatus- Part 5: Dispensers

5.13.1 Los resultados obtenidos de la verificación deben ser reportados en el CCAYAC-F-
152 “Verificación metrológica de pipeta de pistón unicanal, dispensador y bureta
de pistón” o el CCAYAC-F-158 “Verificación metrológica de pipeta de pistón
multicanal” según sea el caso.
5.13.2 Si se obtienen resultados no aprobados en el ensayo de verificación, para los
errores sistemáticos o aleatorios, se debe proceder como sigue:
a) Cambiar la punta y verificar que se encuentre suficientemente ajustada.
b) Verificar que la rosca del soporte se encuentre ajustada.
c) Repetir el ensayo.
5.13.3 Si las correcciones anteriores no solucionan el problema, solicitar la reparación y
posterior recalibración del aparato.

t: 55 50 80 52 00
96
Revisión 1
6 DOCUMENTOS DE REFERENCIA.
Documentos Clave
Verificación metrológica de pipeta de pistón unicanal, dispensador
6.1 CCAYAC-F-152
y bureta de pistón
6.2 Verificación metrológica de pipeta de pistón multicanal CCAYAC-F-158
7 BIBLIOGRAFÍA
Documentos
General European OMCL Network (NEON) Quality Management Document.
PA/PH/OMCL(09) 64 R5. Qualification of Equipment. Annex 6. Qualification of piston
7.1 pipettes. September 2018
https://www.edqm.eu/sites/default/files/qualification_of_equipment_annex_6_-
_qualification_of_piston_pipette_paphomcl_09_64_r5.pdf
Blues J., Bayliss D.and BuckleyM. Measurement Good Practice Guide No. 69: The
Calibration and Use of Piston Pipettes. ISSN 1368-6550. National Physical Laboratory,
7.2
United Kingdom. July 2004
http://www.medlabstats.com/QualSysAssist/UKAS-MGP-Guide%2069.pdf
7.3 ISO 3696:1987. Water for analytical laboratory use-Specification and test methods.
ISO 8655-1:2002. Piston-operated volumetric apparatus-Part 1: Terminology, general
7.4
requirements and user recommendations
7.5 ISO 8655-2:2002. Piston- Operated volumetric apparatus- Part 2: Piston pipettes
7.6 ISO 8655-3:2002. Piston- Operated volumetric apparatus- Part 3: Piston burettes.
7.7 ISO 8655-5:2002. Piston- Operated volumetric apparatus- Part 5: Dispensers
ISO 8655-6:2002. Piston-operated volumetric apparatus- Part 6: Gravimetric
7.8
methods for the determination of measurement error
LAB 15. UKAS. Traceability: Volumetric Apparatus. Edition 2. June 2009
7.9 https://www.ukas.com/download/publications/publications-relating-to-laboratory-
accreditation/LAB15.pdf
8 ANEXOS.
Anexo 1- Factor de corrección de Z (µL/mg)
Anexo 2- Requisitos para el agua grado 3

t: 55 50 80 52 00
97
Revisión 1
Anexo 1
Factor de corrección de Z (µL/mg)
Temperatura Presión del aire (kPa)

(°C) 80 85 90 95 100 101.3 105
15 1.0017 1.0018 1.0019 1.0019 1.0020 1.0020 1.0020
15.5 1.0018 1.0019 1.0019 1.0020 1.0020 1.0020 1.0021
16 1.0019 1.0020 1.0020 1.0021 1.0021 1.0021 1.0022
16.5 1.0020 1.0020 1.0021 1.0021 1.0022 1.0022 1.0022
17 1.0021 1.0021 1.0022 1.0022 1.0023 1.0023 1.0023
17.5 1.0022 1.0022 1.0023 1.0023 1.0024 1.0024 1.0024
18 1.0022 1.0023 1.0023 1.0024 1.0025 1.0025 1.0025
18.5 1.0023 1.0024 1.0024 1.0025 1.0025 1.0026 1.0026
19 1.0024 1.0025 1.0025 1.0026 1.0026 1.0027 1.0027
19.5 1.0025 1.0026 1.0026 1.0027 1.0027 1.0028 1.0028
20 1.0026 1.0027 1.0027 1.0028 1.0028 1.0029 1.0029
20.5 1.0027 1.0028 1.0028 1.0029 1.0029 1.0030 1.0030
21 1.0028 1.0029 1.0029 1.0030 1.0031 1.0031 1.0031
21.5 1.0030 1.0030 1.0031 1.0031 1.0032 1.0032 1.0032
22 1.0031 1.0031 1.0032 1.0032 1.0033 1.0033 1.0033
22.5 1.0032 1.0032 1.0033 1.0033 1.0034 1.0034 1.0034
23 1.0033 1.0033 1.0034 1.0034 1.0035 1.0035 1.0036
23.5 1.0034 1.0035 1.0035 1.0036 1.0036 1.0036 1.0037
24 1.0035 1.0036 1.0036 1.0037 1.0037 1.0038 1.0038
24.5 1.0037 1.0037 1.0038 1.0038 1.0039 1.0039 1.0039
25 1.0038 1.0038 1.0039 1.0039 1.0040 1.0040 1.0040
25.5 1.0039 1.0040 1.0040 1.0041 1.0041 1.0041 1.0042
26 1.0040 1.0041 1.0041 1.0042 1.0042 1.0043 1.0043
26.5 1.0042 1.0042 1.0043 1.0043 1.0044 1.0044 1.0044
27 1.0043 1.0044 1.0044 1.0045 1.0045 1.0045 1.0046
27.5 1.0045 1.0045 1.0046 1.0046 1.0047 1.0047 1.0047
28 1.0046 1.0046 1.0047 1.0047 1.0048 1.0048 1.0048
28.5 1.0047 1.0048 1.0048 1.0049 1.0049 1.0050 1.0050
29 1.0049 1.0049 1.0050 1.0050 1.0051 1.0051 1.0051
29.5 1.0050 1.0051 1.0051 1.0052 1.0052 1.0052 1.0053
30 1.0052 1.0052 1.0053 1.0053 1.0054 1.0054 1.0054
ISO 8655-6:2002. Piston-operated volumetric apparatus
Part 6: Gravimetric methods for the determination of measurement error.

t: 55 50 80 52 00
98
Revisión 1
Anexo 2
Requisitos para el agua grado 3
Característica metrológica Grado 3

pH a 25°C 5 a 7.5
Conductividad eléctrica máxima ≤ 0.5 mS/m a 25°C
ISO 3696:1987. Water for analytical laboratory use-Specification and test methods

t: 55 50 80 52 00
99
Revisión 1
CCAYAC-CR-18/0. Criterios para la verificación de métodos
de prueba microbiológicos para el análisis de alimentos.

t: 55 50 80 52 00
100
Revisión 1
CCAYAC-CR-18/0 Criterios para la verificación de métodos de prueba microbiológicos
para el análisis de alimentos.
1. OBJETIVO
Establecer los criterios para la verificación de los métodos de prueba

microbiológicos normalizados.
2. ALCANCE
2.1. Estos criterios deberán ser utilizados durante la evaluación de los métodos
microbiológicos para el análisis de alimentos.
2.2. Este documento contiene los requerimientos mínimos que deberán ser aplicado por
los laboratorios de ensayo, aspirantes ante la COFEPRIS a ser Terceros Autorizados,
para la verificación de métodos microbiológicos para el análisis de alimentos.
3. DEFINICIONES
3.1. Cepas de referencia: Son las cepas obtenidas por distribuidores autorizados con
trazabilidad a una colección internacionalmente reconocida. Las cuales deben
contar con certificado de calidad.
3.2. Desviación Estándar Relativa (%RSD): Es la relación entre la desviación estándar y la
media multiplicada por 100.
𝜎
CV= × X100
3.3. Exactitud relativa o recuperación: Es la aproximación entre un resultado de la

prueba y el valor de referencia aceptado. Para el propósito de esta guía, es la
cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de microorganismo
inoculado o nivel de fortificación.
3.4. Fortificación de la muestra: Inoculación de una cantidad conocida del o los
microorganismos de prueba.
3.5. Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al
mesurando.
3.6. Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e
inferior, en el cual el microorganismo puede cuantificarse con un nivel satisfactorio
de repetibilidad y recuperación.
3.7 Límite de detección: Es el número más pequeño de microorganismos en una
muestra que puede ser detectado bajo las condiciones de análisis. El limite

t: 55 50 80 52 00
101
Revisión 1
microbiológico de una prueba determina la presencia o ausencia de
microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de muestra.
3.8 Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.
3.9 Método Normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones
en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en
los resultados. Métodos internacionalmente aceptados y validados.
3.10 Microrganismo interferente: es el microorganismo que puede presentar
caracterices fenotípicas similares a las del microrganismo de interés o competir en
los medios de cultivo y por lo tanto producir errores en la emisión de resultados.
3.11 Microorganismo de interés: es el anualito determinado por el método de análisis a
utilizar.
3.12 Muestra Blanco: Es la matriz en el que no está el microorganismo de interés.
3.13 Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de
microorganismos inoculados a una muestra.
3.14 Protocolo para la verificación: Documento que describe los pasos a seguir durante
la verificación de un método analítico microbiológico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.
3.15 Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la
ejecución de la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden
ocurrir aleatoriamente en situaciones normales.
3.16 Verificación: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
método normalizado produce consistentemente resultados confiables en las
condiciones particulares del laboratorio. Confirmación mediante la aportación de
evidencia objetiva de que un método analítico validado internacionalmente cumple
con su propósito en las condiciones particulares del laboratorio donde se realiza el
análisis.
3.17 Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos
diferentes porciones de la misma matriz, en las mismas condiciones de análisis
(químico analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo.
3.18 Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos
diferentes porciones de la misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de
medición (personal) y en diferentes tiempos (o a intervalos de tiempos más largos).
3.19 Selectividad: es la capacidad del método de análisis para determinar el
microrganismo de interés en presencia del interferente.

t: 55 50 80 52 00
102
Revisión 1
5. CRITERIOS
5.1. Criterios Generales

 La verificación del método se debe realizar considerando dos momentos:
La verificación por cada lote de análisis y cuando el laboratorio usa por primera
vez un método.
5.2. Criterios para la verificación por cada lote de análisis

 Preparar y analizar cultivos control para demostrar crecimiento o inhibición
esperada, para asegurar el sistema de trabajo.
5.3. Criterios para la verificación inicial del método.

 Cada laboratorio debe contar con un programa de verificación, el cual debe
considerar los métodos, matrices y grupos de alimentos a evaluar.
 Con fines de autorización se debe contar con la verificación en al menos una
matriz y la implementación de los “Criterios específicos para la ampliación del
estado verificado de los métodos cualitativos“.
 Para el alcance del presente documento se ha propuesto la siguiente clasificación
del producto de interés sanitario, basada en la experiencia y lo señalado en la ISO
16140.
Grupos de Productos Frutas y Productos
Cárnicos Aves
interés de la pesca Vegetales Lácteos
Crudos Crudos Crudos
Crudos Crudos
Procesados Procesados Procesados
Tipos de Procesados Procesados
Congelados Congelados Congelados
alimentos: Congelados Congelados
Secos Secos Secos
Otros Otros
Otros Otros Otros
Carne Pollo
Moluscos Leche
molida Nugets Mango
Ejemplos de Pescado Queso
Guisados Milanesas de Coctel
matriz: Filete Leche en
Carne pollo
Camarón polvo
congelada congelado
 Los criterios de selección de una matriz deben estar descritos y justificados en

cada protocolo. Priorizando el tipo de producto y matriz representativa,
mayormente recibida en el laboratorio.
 Las cepas empleadas deben ser las señaladas en la normatividad, también
pueden usarse cepas obtenidas de alimentos contaminados, las cuales deben ser
debidamente caracterizadas, para este propósito deben ser enviadas a CCAYAC,
para su identificación indicando en la solicitud el propósito de uso,
adicionalmente el laboratorio debe tener documentado las características de
crecimiento en los diferentes medios empleados.

t: 55 50 80 52 00
103
Revisión 1
5.4. Criterios específicos para la evaluación inicial de métodos cualitativos
5.4.1. Verificación del Inoculo: Para verificar el inóculo; se debe inocular una placa con el
mismo volumen de la suspensión utilizada para fortificar la muestra.
 El promedio de los inóculos para el microrganismo de interés debe ser menor de
10 UFC.
 El promedio de los inóculos para el microorganismo interferente debe ser mayor
de 100 UFC
5.4.2. Número de cepas

 Debe usarse por lo menos una cepa del microorganismo de interés la cual puede
ser una cepa de referencia o una cepa aislada por el un método de prueba
autorizado y caracterizada.
 Deben usarse por lo menos una cepa del microrganismo interferente la cual
puede ser una cepa de referencia o una cepa aislada por el un método de prueba
autorizado y caracterizada.
5.4.3. Criterios de cumplimiento para la verificación de métodos cualitativos
Al verificar el tamaño del inoculo por lo menos seis veces
en promedio se obtienen:
Verificación del tamaño del  El promedio de los inóculos para el microrganismo de
Inoculo interés debe ser menor de 10 UFC.
 El promedio de los inóculos para el microorganismo
interferente debe ser mayor de 100UFC
Numero de repeticiones: 3
Verificación de la muestra
Analistas: uno
Numero de repeticiones: al menos 10 por químico
Verificación del límite de analista
detección Resultados positivos: al menos el 80 %
de menos de 10 UFC Tamaño del inoculo: menos de 10 UFC Microorganismo
de interés
Numero de repeticiones: al menos 10 por químico
analista
Resultados positivos: 80 %
Selectividad
Tamaño del inoculo:
 más de 100 UFC Microorganismo Interferente
 menos de 10 UFC Microorganismo de Interés
5.5. Criterios específicos para la ampliación del estado verificado de los métodos
cualitativos

t: 55 50 80 52 00
104
Revisión 1
5.5.1. Con el propósito de demostrar que la matriz no interfiere con la capacidad de
recuperar un microorganismo los laboratorios Terceros Autorizados, deben verificar
cada matriz que se reciba, inoculando 25g o mL de muestra con menos de 30 UFC,
una vez que se alcancen 20 resultados con una confianza de 95% (19 resultados
positivos de 20 muestras inoculadas) puede considerarse que la matriz esta
validada.
5.5.2. Las muestras pueden proceder de fuentes diferentes.
5.6. Criterios específicos para la evaluación inicial de métodos cuantitativos
5.6.1. En el caso que sea necesario; se pueden utilizar mezclas de microorganismos:
Parámetro Criterio de aceptación

Muestras no contaminadas: Muestras naturalmente
Número de repeticiones: 10 contaminadas:
Número de analistas: uno Número de repeticiones: 10
Repetibilidad Nivel de fortificación: Valor Número de analistas: uno
medio del método. Nivel de fortificación: no aplica
Criterio de aceptación: r < 3 Resultado: r < 3

Muestras naturalmente
Muestras no contaminadas:
contaminadas:
Número de repeticiones: por lo
menos 10 por analista
Número de repeticiones: por lo
Nivel de fortificación: Valor
Reproducibilidad menos 10 por analista
medio del intervalo de lectura
Número de analistas: por lo menos 2
para el método.
Nivel de fortificación: no aplica
Criterio de aceptación. R < 3
Resultado: R < 3
Solo muestras no contaminadas:
Recuperación Numero de repeticiones: por lo menos 10
Resultado: Entre el 90% y el 110% log
Solo muestras no contaminadas:
Numero de repeticiones: por lo menos 10
Sesgo Número de analistas: uno
Criterio de aceptación:
La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
Incertidumbre Realizar cálculos para la incertidumbre expandida

t: 55 50 80 52 00
105
Revisión 1
5.7. Cálculos
5.7.1. El nivel de fortificación, es necesario considerar el valor medio del intervalo de

lectura del método. Cuando el método de prueba indica que se deben contar cajas
con cuentas entre 25 y 250 UFC, el valor medio (realizando la linealidad de la variable
mediante el uso de logaritmo) es de 80 UFC.
5.7.2. Por lo anterior, en las placas de lectura se deben encontrar aproximadamente 80
UFC, esto debe tomarse en cuenta para la dilución utilizada en la preparación de la
muestra.
5.7.3. Todos los inóculos deben ser verificados utilizando la técnica de vaciado en placa.
5.8. Repetibilidad
Calcular las UFC en cada repetición y calcular el logaritmo.

UFC =
Repetición Placa 1 Placa 2 Promedio promedio Logaritmo
(F.D)
1 70 90 80 800 2.903
2 71 91 81 810 2.908
3 80 80 80 800 2.903
4 76 82 79 790 2.897
5 78 82 80 800 2.903
6 77 88 83 830 2.919
7 56 80 68 680 2.832
8 87 80 84 840 2.924
9 77 86 82 820 2.913
10 79 83 81 810 2.908
5.8.1. Calcular la desviación estándar relativa, como el cociente de la desviación estándar

sobre la media.
s
RSD =
x
Calcular el valor de r.

t: 55 50 80 52 00
106
Revisión 1
Desviación
0.0255
estándar
Promedio 2.901
DSR 0.0088
n 10
r 0.00779
5.9. Reproducibilidad
Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes

deben proceder como se describió antes, considerando la aplicación de la siguiente
formula.
5.10. Sesgo
A partir de los cálculos de recuperación, calcular la diferencia de la media de los

logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inóculo utilizado.
Sesgo=|𝑉𝑒 − 𝑉𝑜|
Dónde:
Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido
5.11. Recuperación
5.11.1. Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la
cantidad de UFC, en cada repetición y calcular el logaritmo de cada cuenta,
promediar los logaritmos. Calcular el logaritmo del inóculo verificado.
Finalmente calcular el % de recuperación.
% Recuperación= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100
Logaritmo de las UFC inoculadas

t: 55 50 80 52 00
107
Revisión 1
5.12. Criterios específicos para el cálculo de la incertidumbre en los métodos
microbiológicos
5.12.1. Métodos Cualitativos
 Mencionar las fuentes de incertidumbre.

 Distribución de los microorganismos en la muestra;
 Efecto de la matriz;
 Personal operativo;
 Mediciones (pesada o medición de la muestra);
 Diluciones y volúmenes;
 Homogeneización;
 Calidad de los medios;
 Tiempo hasta la inoculación;
 Temperatura de incubación;
5.12.2. Métodos Cuantitativos

A partir de muestras naturalmente contaminadas o inoculadas. Dos químicos
analistas, analizan simultáneamente 10 muestras, y se realiza el siguiente cálculo.
(𝐲𝐢𝐀 − 𝐲𝐢𝐁)𝟐
Repetición Log A1 Log B1
𝟐
1 2.5051 2.5440 0.0007566
2 2.5797 2.4623 0.0068913
3 2.4771 2.5185 0.0008569
4 2.5440 2.5051 0.0007566
5 2.5314 2.5797 0.0011664
6 2.5185 2.5682 0.0012350
7 2.5682 2.5185 0.0012350
8 2.5051 2.4771 0.000392
9 2.5314 2.5051 0.0003458
10 2.5051 2.4771 0.000392
1 2
n (yiA−yiB) 0.01402795
SR = √n i=1 2
=√ 10
= 0.0374
Dónde: yiA y yiB son los datos transformados a log 10 (UFC/g o ml).

t: 55 50 80 52 00
108
Revisión 1
Incertidumbre expandida U = 2 SR
U = 2(0.0374)
U = 0.074
Documentos Clave
6.1 Catálogo Oficial de Medios de Cultivo CCAYAC-CT-07
Método General para la preparación y dilución de muestras de
6.2 CCAYAC-M-151
7. BIBLIOGRAFÍA
Documentos
Requisitos Generales para la Competencia de los laboratorios de ensayo y
7.1
calibración NMX-EC-17025-IMNC-2018
Guidelines for the validation of analytical methods for the detection of
7.2
microbiological pathogens in food and Feeds. 2da. Edition, FDA. April 2015
7.3 Methods Development, Validation, and Implementation Program.FDA-OFVM-3. 2014
7.4 USP 38, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.
7.5 USP 38, <1225> Validation of Compendial Procedures
7.6 USP 38, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles
Dulce Toccheto S. Curso-teórico-práctico Validación de Métodos Microbiológicos
7.7 bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia.
Proyecto TCC/ Bolivia-México. 2007.
7.8 Eurachem. Accreditation for Microbiological Laboratories. Second Edition 2013.
G.A. Leotta, I. Chinen. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección
7.9 de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiología.
Vol.37, No. 1 2005.
Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos
7.10
Farmacéuticos Biólogos de México, A.C. Edición 2002.
ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and
7.11 animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. First
Edition.
ISO/TR 13843:2000 - Water Quality — Guidance on Validation of Microbiological
7.12
methods. First Edition.
ISO 17994:2004 Water Quality—Criteria for Establishing Equivalence between
7.13
Microbiological methods. First Edition.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
7.14
Validation and Related Topics. Eurachem Guide. Second edition 2014. Disponible en

t: 55 50 80 52 00
109
Revisión 1
Documentos
https://www.eurachem.org/index.php/publications/guides/mv
Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods
Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food
7.15 Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf
(febrero 2011)
8. ANEXOS
Anexo 2.- Elaboración del informe

t: 55 50 80 52 00
110
Revisión 1
Anexo 1
La estructura para el protocolo para la verificación de métodos de análisis

microbiológicos:
Descripción
Título
Considerar los parámetros de verificación a evaluar y el analito a
1.Objetivo
determinar
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la
2.Campo de aplicación
verificación.
Citar el método de prueba interno, el método de referencia y
3.Método de ensayo cuando no esté disponible en otro documento el diagrama de
flujo.
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; clave
4.Equipos e interna de identificación, e indicar los servicios de calibración,
Instrumentos verificación y/o calificación, mantenimiento preventivo según
sea el caso.
5.Materiales Indicar los materiales a utilizar
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
6.Reactivos y Medios b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
de cultivo c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los
inóculos
Indicar las características, forma de almacenamiento y
cantidades de muestra estimadas para llevar a cabo la
7.Muestras verificación.
adicionadas.
8.Desarrollo Detallar las instrucciones para cada uno de los criterio de
experimental desempeño de verificación a ensayar.
9.Resultados Formato para el registro de resultados
Establecer para cada criterio de desempeño de verificación la
10.Análisis estadístico
herramienta estadística a utilizar para su evaluación.
11.Criterios de Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con
aceptación su respectiva referencia bibliográfica.

t: 55 50 80 52 00
111
Revisión 1
Anexo 2
Elaboración del informe
Descripción
Informe de resultados de la verificación del método: el nombre y clave del
Título
método que se evalúo.
Considerar los parámetros de verificación evaluados y el microorganismo
1.Objetivo
determinado.
2.Campo de aplicación Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la verificación
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; clave interna de
3.Equipos e
Instrumentos
4.Materiales Listado de los materiales utilizados.
5.Reactivos y Medios
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.
de cultivo
Listar las cepas utilizadas y en número de colección (ATCC) con su
6.Cepas
respectiva hoja de identidad y aseguramiento de calidad.
presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a
7.Muestras cabo la verificación.
8.Desarrollo Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los criterios
experimental de desempeño de verificación.
Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas de
9.Resultados inicio y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba,
matriz, unidades y clave de bitácora o registro primario
10.Discusión de los Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados y los
resultados resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método se ajusta
11.Conclusión
al uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
12.Bibliografía Referencias utilizadas.
Los que aplique:  Medios de cultivo
 Registros primarios,  Cepas
13.Anexos
 Bases de datos utilizadas  Formatos de verificación,
 Certificados de equipos Gráficos de control, etc.

t: 55 50 80 52 00
112
Revisión 1
CCAYAC-CR-19/0. Criterios para estimar la incertidumbre
de la medición.

t: 55 50 80 52 00
113
Revisión 1
CCAYAC-CR-19/0 Criterios para estimar la incertidumbre de la medición de métodos
fisicoquímicos.
1. OBJETIVO.
Establecer los criterios para llevar a cabo la estimación de la incertidumbre de métodos

fisicoquímicos, mediciones físicas en dispositivos médicos y físicos cuantitativos.
2. ALCANCE.
Aplica a las pruebas fisicoquímicas y físicas verificadas o validadas internamente

empleadas para el análisis de agua, alimentos, producto farmacéutico, ingrediente
farmacéutico activo, productos biológicos, juguetes, cerámicas, bebidas alcohólicas y no
alcohólicas, mediciones físicas en dispositivos médicos, entre otros.
3. DEFINICIONES.
3.1 Evaluación tipo A: Método de evaluación de una componente de la incertidumbre
medida mediante un análisis estadístico de los valores medidos en unas condiciones
definidas.
3.2 Evaluación tipo B: Método de evaluación de una componente de la incertidumbre
de medida por medios distintos al análisis estadístico de los valores medidos.
3.3 Factor de cobertura: Factor numérico empleado para multiplicar la incertidumbre
estándar combinada con el fin de obtener una incertidumbre expandida.
3.4 Incertidumbre: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores
atribuidos a un mensurando, a partir de la información que se utiliza.
3.5 Incertidumbre estándar: Incertidumbre del resultado de una medición expresada
como una desviación estándar.
3.6 Incertidumbre estándar combinada: Incertidumbre estándar del resultado de una
medición cuando este es obtenido a partir de los valores de un número de otras
magnitudes, igual a la raíz cuadrada positiva de una suma de términos, siendo estos
términos las varianzas o covarianzas de estas otras cantidades ponderadas de
acuerdo a como varían los resultados de la medición con estas cantidades.
3.7 Incertidumbre expandida: Cantidad que define un intervalo sobre el resultado de
una medición que se puede esperar incluya una gran fracción de la distribución de
valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando.
3.8 Mensurando: Magnitud que se desea medir.
3.9 Trazabilidad: Propiedad del resultado de una medida por la cual el resultado puede
relacionarse con una referencia mediante una cadena ininterrumpida y
documentada de calibraciones , cada una de las cuales contribuye a la
incertidumbre de medida.

t: 55 50 80 52 00
114
Revisión 1
Laboratorios de Salud Pública, los laboratorios Terceros Autorizados ante la
5. CRITERIOS.
La estimación de la incertidumbre aplica solo para métodos cuantitativos.

5.1.1 Para métodos fisicoquímicos cuantitativos verificados o validados internamente
se consideran según corresponda al método, tres fuentes generales de
incertidumbre:
 Solución de referencia (uref)
 Sesgo (urec)
 Variabilidad total del método (stot)
5.1.2 Para mediciones de pruebas físicas se consideran como fuentes de

incertidumbre:
 Instrumentos de medición y equipo (ueq)
 Variabilidad total del método (stot)
5.1.3 La incertidumbre de los químicos analistas y equipos analíticos (cromatógrafos,

espectrofotómetros, potenciómetros, etc) se consideran dentro de la estimación
de la incertidumbre del sesgo y de la variabilidad total del método.
5.1.4 Las incertidumbres estándar obtenidas deben transformarse a incertidumbres
relativas para la obtención de la incertidumbre combinada.
5.1.5 No es requerida la estimación de la incertidumbre de las mediciones cualitativas,
debido a que no pueden ser evaluadas a partir de una distribución estadística de
los resultados de una serie de mediciones. Por ello, solo se requiere mencionar las
posibles fuentes de incertidumbre.
5.2 Criterio No. 2.- Definición del mensurando
Definir el analito que se va a cuantificar y las unidades en las cuales se reporta conforme
al Sistema Internacional de Unidades. Ejemplo: µg ácido domoico/g
5.3 Criterio No. 3.- Fuentes de incertidumbre
5.3.1 Enlistar los pasos generales del método de medición conforme al procedimiento
de prueba

t: 55 50 80 52 00
115
Revisión 1
5.3.2 Mostrar la ecuación que se utiliza para el cálculo final de la concentración del
analito en la muestra de prueba (modelo matemático)
5.3.3 Definir las variables de influencia en el proceso de medición.
5.3.4 Establecer los componentes de incertidumbre (subvariables) de cada una de
éstas.
5.3.5 Elaborar un diagrama de pescado, colocando en la cabeza, el analito o parámetro
sujeto a medición y en las espinas las fuentes de incertidumbre identificadas. Las
subvariables de cada fuente de incertidumbre se colocan en las espinas
perpendiculares a la espina asignada a esa variable (anexo 8.1)
5.4 Criterio No. 4.- Estimación de las incertidumbres estándar

5.4.1 Evaluación tipo A
a) Incertidumbre del sesgo (urec)
 Utilizar el valor de la desviación estándar del % de recuperación (srec) obtenido

en la verificación o validación interna del método y sustituir en la siguiente
ecuación:
𝑠𝑟𝑒𝑐
𝑢𝑟𝑒𝑐 =
√𝑛
 Transformar esta incertidumbre a incertidumbre relativa dividiendo el valor de

Urec obtenido entre el valor de % de recuperación o concentración promedio.
b) Incertidumbre de la variabilidad total del método (ustot)
 Utilizar los valores de las desviaciones estándar de la repetibilidad (sr) y

precisión intermedia (spi) obtenidas en la verificación o validación interna del
método y sustituir en la siguiente ecuación:
𝑠2 2
 𝑠𝑡𝑜𝑡 = √ 𝑛𝑟 + 𝑠𝑝𝑖
Donde n= número de repeticiones
 Transformar esta incertidumbre a incertidumbre relativa dividiendo el valor de
stot obtenido entre el valor de % de recuperación o concentración promedio.
5.4.2 Evaluación tipo B
a) Incertidumbre de los instrumentos y equipos de medición (ueq)

t: 55 50 80 52 00
116
Revisión 1
 Utilizar el valor de incertidumbre expandida (Uexp) reportada en el informe o
certificado de calibración y dividir este valor entre el factor de cobertura (k)
empleado.
𝑈𝑒𝑥𝑝
𝑢=
𝑘
 Aplica para termómetros, balanzas y equipos de mediciones físicas (reglas,
micrómetros, etc.) que hayan sido calibrados por una empresa prestadora de
servicios y para disoluciones comerciales cuya incertidumbre este expresada
en un certificado de análisis.
b) Incertidumbre de la pureza (upur)
 Considerar el dato de pureza del reactivo reportado en el certificado de análisis

y estimar la incertidumbre aplicando la siguiente ecuación:
(100 − 𝑑𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎)

𝑢𝑝𝑢𝑟 =
√3
c) Incertidumbre del material y aparatos volumétricos (uv).
 Estimar la incertidumbre conforme al valor del error máximo permisible (uemp)

establecido en el CCAYAC-CR-14 “Criterios para la verificación metrológica de
material volumétrico de vidrio” y en el CCAYAC-CR-15 “Criterios para la
verificación metrológica de aparatos volumétricos operados por pistón”,
aplicando la siguiente ecuación:
𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑚𝑖𝑠𝑖𝑏𝑙𝑒

𝑢𝑒𝑚𝑝 =
√6
 Asimismo estimar la incertidumbre asociada a la temperatura de medición

(utemp) considerando las siguientes ecuaciones
Dónde:
= coeficiente de expansión de volumen para el agua = 0.00021 °C-1

t = Diferencia de temperatura (en °C) estimada en el laboratorio de prueba.
V= Volumen del material o aparato volumétrico.
𝛽 ∗ ∆𝑡 ∗ 𝑉
𝑢𝑡𝑒𝑚𝑝 =
√3

t: 55 50 80 52 00
117
Revisión 1
 Para estimar la incertidumbre del material volumétrico (uv) emplear la siguiente
ecuación:
2 2
𝑢𝑣 = √𝑢𝑒𝑚𝑝 + 𝑢𝑡𝑒𝑚𝑝
5.5 Criterio No. 5.-Incertidumbre estándar combinada (uc).
Combinar las incertidumbres obtenidas empleando la siguiente ecuación:
𝑢𝑐 2 2 + 𝑢2
= √𝑢𝑟𝑒𝑓 + 𝑢𝑟𝑒𝑐 𝑠𝑡𝑜𝑡
𝐶𝑜
Co= Concentración del analito en la muestra
5.6 Criterio No. 6.- Incertidumbre expandida (Uexp)

5.6.1 Multiplicar la incertidumbre combinada por el factor de cobertura (k) a un nivel de
confianza del 95 %.
5.6.2 Para la mayoría de los propósitos es recomendable un valor de k igual a 2
𝑈𝑒𝑥𝑝 = 𝑢𝑐 ∗ 𝑘 ∗ 𝐶𝑜
5.7 Criterio No. 7.- Informe de la incertidumbre
(Resultado): x  Uexp (unidades)
“La incertidumbre informada es una incertidumbre expandida calculada empleando un

factor de cobertura de 2, el cual proporciona un nivel de confianza del 95 %
aproximadamente”.
5.8 Criterio No. 8.- Contribución de las incertidumbres
5.8.1 Para mediciones fisicoquímicas
Incertidumbre estándar
Variable Descripción
relativa
ref Solución de referencia
rec Sesgo
Variabilidad total del
stot
método
Total

t: 55 50 80 52 00
118
Revisión 1
5.8.2 Para mediciones físicas
Incertidumbre estándar
Variable Descripción
relativa
eq Equipo
Variabilidad total del
stot
método
Total
5.9 Criterio No. 9.- Carta de trazabilidad
Considerar los siguientes elementos:
5.9.1 Referencia a los patrones
 Identificar el patrón, por ejemplo: Juego de pesas ICJE1 001.

 La magnitud a la que se refiere el patrón: ejemplo volumen, masa, temperatura,
etc.
 Las unidades en las que está expresada la magnitud: ejemplo mg, g, mL, mg/mL,
etc.
 El valor de incertidumbre relativa (urel) asignada a dicho patrón.
 La información anterior sobre cada patrón se encierra en un rectángulo. Anotar al
lado derecho del rectángulo la información sobre la clave y fecha del certificado o

t: 55 50 80 52 00
119
Revisión 1
informe de calibración que soporta la trazabilidad de dicho patrón y al lado
izquierdo la institución que llevó a cabo la calibración.
5.9.2 Referencia al instrumento de medición
 Señalar el nombre y número de identificación (ID) del instrumento de medición

calibrado, por ejemplo balanza analítica ID 1392
 La resolución del instrumento, por ejemplo 0.0001 g
 Las unidades en que mide el instrumento, por ejemplo: g, mg, °C, etc.
 El valor de incertidumbre relativa (urel) reportada en el informe de calibración.
 La información anterior sobre cada instrumento se encierra en un rectángulo.
Anotar al lado derecho del rectángulo la información sobre la clave y fecha del
informe o certificado de calibración que soporta la trazabilidad del instrumento y
al lado izquierdo la institución que llevó a cabo la calibración.
5.9.3 Material de referencia
 Anotar el nombre de la solución, por ejemplo ácido domoico en solución acuosa

de acetonitrilo al 5%, solución de alprazolam en acetonitrilo, etc.
 La magnitud a la que se refiere, por ejemplo concentración en masa, volumen.

 Las unidades en las que se presenta, por ejemplo µg/mL.
 El valor de incertidumbre relativa (urel) reportada en el informe de análisis si se
trata de una solución comercial o la calcula si esta se preparó en el laboratorio
 La información anterior se encierra en un rectángulo. Anotar al lado derecho del
rectángulo la información sobre la clave y fecha del informe o certificado de
análisis y al lado izquierdo la institución que emite dicho informe si se empleó una
solución comercial. Si la solución se preparó en el laboratorio solo anotar el
nombre de este al lado derecho del rectángulo.
5.9.4 Referencia al método
 Anotar el nombre y clave del método utilizado en la calibración de los patrones e

instrumentos de medición los cuales se reportan en el informe o certificado de
calibración.
 Anotar el nombre y clave de la referencia del método al que aplica la carta de
trazabilidad, por ejemplo Método General MGA 0241 FEUM, Método Oficial AOAC
2000.08, Standard Methods 4000 H, etc.
 El modelo matemático para el cálculo del analito en la muestra final.
 La información anterior se encierra en un óvalo. Anotar al lado derecho del óvalo
el nombre del laboratorio que lleva a cabo la determinación analítica.

t: 55 50 80 52 00
120
Revisión 1
5.9.5 Referencia al resultado final
 Anotar el mesurando cuyo valor se obtiene mediante la aplicación del método,

por ejemplo contenido de alprazolam, volumen, etc.
 La magnitud a la que se refiere, por ejemplo concentración en masa, masa,
volumen.
 Las unidades en las que se reporta el analito, por ejemplo, mg, mg/mL, %, etc.
 El valor de incertidumbre relativa (urel) calculada.
 La información anterior se encierra en un rectángulo. Anotar al lado derecho del
rectángulo el nombre del laboratorio que lleva a cabo la determinación analítica.
5.9.6 Diagrama de carta de trazabilidad
 Con la información anterior, presentar de forma esquemática todas las

calibraciones y mediciones necesarias para relacionar las referencias
determinadas con el resultado de la medición o el valor del patrón.
 Ordenar la sucesión de patrones alternados con los respectivos métodos o
procedimientos en forma vertical. En la parte superior situar el patrón del cual se
obtiene la trazabilidad indicado por un rectángulo en doble línea. Debajo
presentar el método o procedimiento de calibración o medición mediante el cual
se establece el valor del siguiente patrón, cuya información a su vez se sitúa
debajo y así sucesivamente hasta llegar al valor del mensurando de interés.
 Cada patrón y cada método (o procedimiento) se unen mediante una flecha en el
sentido del valor del patrón del cual se obtiene la trazabilidad, y se anotan los
datos del informe o certificado de calibración y el nombre de la entidad emisora
como se explicó anteriormente.
 Cuando se cuenta con información sobre la trazabilidad provista por un órgano
externo al laboratorio (trazabilidad externa), se traza una línea horizontal
punteada para separarlos de los elementos de la cadena de trazabilidad que son
responsabilidad de la CCAYAC (trazabilidad interna).
No aplica

t: 55 50 80 52 00
121
Revisión 1
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Entidad Mexicana de Acreditación. Manual de procedimientos. Incertidumbre de
mediciones. Política. MP-CA005-09. 2018
7.1
http://consultaema.mx:75/pqtinformativo/GENERAL/PEA/04_MP-
CA005_Pol_Incertidumbre.pdf
Eurachem/CITAC. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Third
7.2 Edition. QUAM:2012.P1.
https://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/QUAM2012_P1.pdf
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2018. Duodécima edición.
7.3
Apéndice IV. Estimación de la Incertidumbre de Métodos Analíticos Farmacopeicos
Food and Drug Administration. Estimation of Uncertainty of Measurement. ORA
LABORATORY PROCEDURE. Document No. ORA-LAB. 5.4.6
7.4
https://www.fda.gov/downloads/ScienceResearch/FieldScience/LaboratoryManual/
UCM092149.pdf
NMX-EC-17025-IMNC-2018. Requisitos generales para la competencia de los
7.5
laboratorios de ensayo y calibración.
8. ANEXOS.
Anexo 1.- Diagrama de pescado
Anexo 2.- Carta de trazabilidad

t: 55 50 80 52 00
122
Revisión 1
Anexo 1. Diagrama de pescado
Solución de referencia
(uref) m= 10 g
Pureza: 99.95 %
V1= 100 mL
V2= 1 mL
V3= 100 mL
mg furfural/100
mL ABA
Repetibilidad (sr)
Recuperación (srec) Precisión intermedia

(spi)
Sesgo
(urec) Variabilidad total del método
(stot)

t: 55 50 80 52 00
123
Revisión 1
Anexo 2. Carta de trazabilidad
Patrón de
transferencia
Magnitud: masa
Unidad: kg
Método de subdivisión
CENAM CNM-730-AC-P.149
Juego de pesas ICJE 1001 Certificado de calibración

Magnitud: masa CNM-CC-730-227/2012
Unidad: mg 2012-11-06
urel: 0.0033
Balanza analítica ID 249

Exelenza S.A. de Resolución: 0.0001 g Informe de calibración
C.V. Unidad: g LEXEM-120/12
urel: 0.000245 2012-11-10
MRC: Acido domoico

Institute for Marine Magnitud: masa Certified Calibration Solution
Biosciences Unidad: µg/mL for Domoic Acid
National Research urel: 0.0104 NRC CRM-DA-f
Council Canada
TRAZABILIDAD EXTERNA
TRAZABILIDAD INTERNA
Método interno CCAYAC-M-001
CNM-730-AC-P.149
Contenido de ácido domoico

Magnitud: masa
Unidad: µg/g
urel: 0.0327

t: 55 50 80 52 00
124
Revisión 1
CCAYAC-CR-22/1. Criterios de validez para la
determinación de Toxina estafilocócica en alimentos
por método inmunoenzimático con Kit Ridascreen Set
Total.

t: 55 50 80 52 00
125
Revisión 1
CCAYAC-CR-22/1 Criterios de validez para la determinación de Toxina estafilocócica
en alimentos por método inmunoenzimático con Kit Ridascreen Set Total.
1. OBJETIVO.
Establecer los criterios de validez para la detección de la toxina estafilocócica en

alimentos con el empleo del Kit RIDASCREEN SET TOTAL.
2. ALCANCE.
Aplica a alimentos que se consideren sospechosos de contaminación con toxina

estafilocócica.
3. DEFINICIONES.
3.1. Verificación: Proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un método
normalizado produce resultados confiables en las condiciones particulares de cada
laboratorio.
3.2. Validez de la Prueba: Evidencia objetiva que demuestra que el método es confiable
en condiciones adecuadas cuando se sigue a detalle lo indicado en la metodología
de ensayo.
3.3. Control Negativo: Es aquel que no desarrolla color alguno por interacción del
sustrato-cromógeno con el analito en estudio. Debe mostrar densidades ópticas
menores o igual a 0.2
3.4. Control Positivo: Es aquel que desarrolla color intenso por interacción del sustrato-
cromógeno con el analito en estudio. Debe mostrar densidades ópticas mayores a
1.0
3.5. Desviación Estándar Relativa: Relación entre la desviación estándar y la media,
multiplicado por cien.
3.6. Repetibilidad: Concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos
por la aplicación de un mismo procedimiento analítico bajo las mismas condiciones
de análisis (químico analista, equipos, ambiente) en intervalos cortos de tiempo.
3.7. Reproducibilidad: Concordancia entre los resultados analíticos individuales
obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico bajo distintas
condiciones de medición (químico analista) en intervalos más amplios de tiempo.
Laboratorios Estatales de Salud Pública, los laboratorios de ensayo Terceros Autorizados
ante la COFEPRIS y por los miembros del padrón de auditores y evaluadores.

t: 55 50 80 52 00
126
Revisión 1
5. CRITERIOS.
5.1. Disposiciones Generales
5.1.1. Los laboratorios que realicen la determinación de la Toxina Estafilocócica en
Alimentos con el Kit RIDASCREEN SET TOTAL deben considerar que
a) El kit en uso no se encuentre caduco
b) No mezclar reactivos de kits diferentes (aun siendo el mismo lote).
5.2. Desarrollo del Método Analítico

5.2.1. Para la extracción de la toxina, utilizar agua destilada o buffer de extracción.
5.2.2. La temperatura ambiente se entenderá como 20 a 25 °C.
5.2.3. En caso de ajustar el pH menor a 3 o mayor a 9, se deberá tomar una nueva porción
del alimento y proceder a realizar la extracción de nueva cuenta.
5.2.4. El extracto podrá ser utilizado si se resguarda en congelación (-15 a -20 °C) por una
semana y en refrigeración (2 a 8°C) por dos días.
5.2.5. Los reactivos del kit deben estar vigentes al momento de su uso.
5.2.6. Cuando no se encuentren en uso, los reactivos deben mantenerse en refrigeración
(2-8 °C). NO CONGELAR.
5.2.7. Los pocillos que no sean utilizados para el ensayo deben regresarse dentro del
paquete que contiene el kit.
5.2.8. Las muestras y controles deben colocarse por duplicado cada que se realice un
ensayo.
5.2.9. Las incubaciones deben realizarse a temperatura de 36 ± 1 °C, sin agitación.
5.2.10. La placa deberá ser cubierta con una tapa o plástico adherente durante las
incubaciones.
5.2.11. Los lavados de la placa deben realizarse con un volumen de entre 250 y 280 µL.
5.2.12. La incubación del sustrato debe realizarse en condiciones de oscuridad.
5.2.13. No tocar el fondo de los pocillos con las puntas de la micropipeta en ningún
momento del ensayo.
5.2.14. Leer la placa en lo posible inmediatamente sin sobrepasar los 30 minutos
después de agregar la solución de paro. Agitar antes de la lectura.
5.2.15. La lectura se debe realizar a 450 con filtro de referencia de 600-630 nm en un
lector de microplacas
5.2.16. Las densidades del control positivo deben ser mayor o igual a 1.0
5.2.17. Las densidades ópticas del control negativo debe ser menor o igual a 0.20
Documentos Clave
Método de prueba para la determinación de toxina estafilocócica
6.1 en alimentos por método inmunoenzimático con kit RIDASCREEN CCAYAC-M-363
SET TOTAL
6.2 Procedimiento para el manejo de los Residuos Peligrosos CCAYAC-P-017

t: 55 50 80 52 00
127
Revisión 1
Biológico-Infecciosos (RPBI)
Método general para la preparación y dilución de muestras de
6.3 CCAYAC-M-151
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
Official European Screening Method. Kit RIDASCREEN SET TOTAL Staphylococcal
7.1
Enterotoxins, R4105. r-biopharm.
NORMA ISO 19020. Microbiology of the food chain - Horizontal method for the
7.2
immunoenzymatic detection of Staphylococcal enterotoxins in foodstuffs. Año 2017
7.3
NMX-EC-17025-IMNC-2018
8. ANEXOS.
Anexo 2.- Estructura del informe

t: 55 50 80 52 00
128
Revisión 1
Anexo 1
La estructura para el protocolo para la verificación de métodos de análisis
microbiológicos:
Descripción
Título
Considerar los parámetros de verificación a evaluar y el analito a
1.Objetivo
determinar
2.Campo de
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la verificación.
aplicación
Citar el método de prueba interno, el método de referencia y
3. Método de
cuando no esté disponible en otro documento el diagrama de
ensayo
flujo.
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; clave interna
4.Equipos e
de identificación, e indicar los servicios de calibración, verificación
Instrumentos
y/o calificación, mantenimiento preventivo según sea el caso.
5.Materiales Indicar los materiales a utilizar
6.Reactivos a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
Indicar las características, forma de almacenamiento y cantidades
de muestra estimadas para llevar a cabo la verificación.
7.Muestras
adicionadas.
8.Desarrollo Detallar las instrucciones para cada uno de los parámetros de
experimental verificación a ensayar.
9.Resultados Formato para el registro de resultados
10.Análisis Establecer para cada parámetro de desempeño la herramienta
estadístico estadística a utilizar para su evaluación.
11.Criterios de Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su
aceptación respectiva referencia bibliográfica.

t: 55 50 80 52 00
129
Revisión 1
Anexo 2
Descripción
Informe de resultados de la verificación del método: el nombre y
Título
clave del método que se evalúo.
Considerar los parámetros de verificación evaluados y el analito
1.Objetivo
determinado.
2.Campo de
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la verificación
aplicación
Nombre del equipo crucial y/o instrumento a utilizar; clave
3.Equipos e interna de identificación, e indicar los servicios de calibración,
Instrumentos verificación y/o calificación, mantenimiento preventivo según sea
el caso.
4.Materiales Listado de los materiales utilizados.
5.Reactivos Listar los reactivos su estado de calidad.
presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para
6.Muestras llevar a cabo la verificación.
7.Desarrollo Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los
experimental parámetros de desempeño.
Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas
8.Resultados de inicio y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de
prueba, matriz, unidades y clave de bitácora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación
9.Discusión de los
considerados y los resultados obtenidos y hacer las
resultados
observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método
10.Conclusión
se ajusta al uso propuesto
11.Bibliografía Referencias utilizadas.
Los que aplique:
 Registros primarios  Formatos de
12.Anexos
 Bases de datos utilizadas verificación,
 Certificados de equipos  Gráficos de control, etc.

t: 55 50 80 52 00
130
Revisión 1
de espectrómetros de UV-Visible.

t: 55 50 80 52 00
131
Revisión 1
CCAYAC-CR-23/0 Criterios para la verificación metrológica de espectrómetros de UV-
Visible.
1. OBJETIVO.
Establecer los lineamientos para llevar a cabo actividades de verificación

metrológica de espectrómetros de UV-Visible.
2. ALCANCE.
Aplica a espectrómetros que funcionan en las regiones espectrales ultravioleta (UV)

y/o visible (VIS), manuales o automáticos, de haz simple o haz doble, con y sin
sistema de barrido espectral y con lectura digital.
3. DEFINICIONES.
3.1 Absorción de celda, a la comprobación de la limpieza y las diferencias de grosor o el

paralelismo de las ventanas de las celdas.
3.2 Absorbancia específica, a la absorbancia obtenida (A) de la disolución de dicromato
de potasio dividida entre el producto de la concentración de esta disolución en
mg/100 mL y la longitud de absorción para una celda de 1 cm, a una longitud de
onda específica.
3.3 Linealidad fotométrica, a la habilidad que tiene el espectrómetro de proporcionar
sensibilidad idéntica a través del intervalo de trabajo. Permite establecer el intervalo
de absorbancia en el que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios
de concentración.
3.4 Luz dispersa, a la cantidad de longitudes de onda no deseadas que están presentes
en el haz de la muestra. Es toda radiación electromagnética de longitud de onda
distinta a la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo
tanto queda registrada por el instrumento. El efecto es causado por la dispersión de
la luz, difracción o un mal funcionamiento del instrumento. Esto provoca una
disminución en el intervalo de absorbancia medible y reduce la relación lineal entre
la concentración y la absorbancia del instrumento.
3.5 Repetibilidad fotométrica, a la medida de la dispersión de una serie de mediciones
de absorbancia alrededor de la media expresada como desviación estándar relativa.
3.6 Resolución espectral, a la capacidad que tiene un espectrómetro para diferenciar
entre dos longitudes de onda adyacentes
3.7 Sesgo fotométrico, a la diferencia entre la absorbancia medida en el
espectrómetro y la absorbancia de referencia.
3.8 Sesgo de la longitud de onda, a la diferencia entre la longitud de onda
seleccionada para la absorbancia máxima y la longitud de onda de referencia.

t: 55 50 80 52 00
132
Revisión 1
satisface los requisitos especificados.
5. CRITERIOS.

5.1.1 Asegurar que el espectrómetro se ha estabilizado conforme a las especificaciones
del fabricante antes de comenzar la verificación.
5.1.2 Considerar como referencia el intervalo espectral en dos regiones, la UV de 200 a
400 nm y la VIS de 400 a 800 nm.
5.1.3 La verificación metrológica del instrumento se debe llevar a cabo:
a) En el área donde se encuentra instalado el instrumento para su uso.

b) En la región espectral de uso conforme a la longitud de onda establecida para el
analito en la metodología aplicada.
c) Con el uso de celdas rectangulares de 1 cm de paso óptico, de cuarzo para UV y de
vidrio o cuarzo para VIS.
d) Con el uso de cualquiera de los siguientes materiales de referencia:
Disoluciones preparadas en el laboratorio.

Disoluciones comerciales con certificado de análisis o calibración, trazables a
patrones nacionales o internacionales
 Filtros de líquidos o sólidos con certificado de análisis o calibración, trazables a
patrones nacionales o internacionales.
5.1.4 Conforme a la frecuencia establecida en la siguiente tabla:
Característica metrológica Día de uso Intermedia

Absorción de celda X
Sesgo de longitud de onda X
Sesgo y repetibilidad fotométrica X X
Linealidad fotométrica X
Luz dispersa X
Resolución espectral X X

t: 55 50 80 52 00
133
Revisión 1
5.1.5 La prueba de sesgo de longitud de onda solo aplica para instrumentos que
cuenten con sistema de barrido espectral.
5.1.6 La prueba de sesgo y repetibilidad fotométrica para el día de uso, sólo se efectúa a
la longitud de onda de 350 nm para UV y 650 nm para VIS según sea el caso.
5.1.7 La prueba de luz dispersa sólo aplica para UV
5.1.8 La prueba de resolución espectral sólo aplica para métodos cualitativos.
5.1.9 La verificación metrológica intermedia se lleva a cabo de manera semestral o 6

meses posteriores a la calibración o calificación del espectrómetro.
5.2 Criterio No. 2.- Materiales de referencia
Región
Material de referencia Característica metrológica
espectral
Disolución o filtro líquido de óxido
de holmio al 4 % en ácido perclórico
UV-VIS Sesgo de la longitud de onda
o
Filtro de vidrio de óxido de holmio
Disolución o filtro líquido de
Sesgo y repetibilidad
dicromato de potasio de 60 mg/L en UV
fotométrica
ácido sulfúrico o perclórico.
Disolución de sulfato de cobre de Sesgo y repetibilidad
VIS
20 mg/L en ácido sulfúrico 0.01 N fotométrica
Disoluciones o fi|ltros líquidos de
dicromato de potasio de 20, 40, 60,
UV
80 y 100 mg/L en ácido sulfúrico o
perclórico. Linealidad fotométrica
Disoluciones de sulfato de cobre de
20, 40, 60, 80 y 100 g/L en ácido VIS
sulfúrico 0.01N
Disolución o filtro líquido de cloruro
UV Luz dispersa
de potasio de 12 g/L.
Disolución o filtro líquido de
UV Resolución espectral
tolueno al 0.02 % en hexano.
5.3 Criterio No. 3.- Absorción de celda
5.3.1 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con aire.

t: 55 50 80 52 00
134
Revisión 1
5.3.2 Llenar la celda con agua destilada y medir la absorbancia a 240 nm para la región
ultravioleta y a 650 nm para la región visible. Registrar los valores.
5.3.3 Rotar la celda 180° y medir la absorbancia nuevamente. Calcular la diferencia de
absorbancias (considerar el valor absoluto).
5.3.4 Comparar contra los valores establecidos en el numeral 5.9.1.
5.4 Criterio No. 4.- Sesgo de longitud de onda

5.4.1 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con:
 La disolución de ácido perclórico al 10% si se utiliza la disolución preparada en el
laboratorio
 Aire para el caso de filtros de vidrio.
 Para disoluciones comerciales y filtros líquidos conforme a las especificaciones del
fabricante.
5.4.2 Realizar un barrido espectral por triplicado del material de referencia de óxido de
holmio seleccionado.
5.4.3 Obtener las longitudes de onda de máxima absorción y comparar los valores
promedio de longitud de onda obtenidos contra los establecidos en la siguiente
tabla:
Longitud de onda (nm)
Región espectral Disolución o filtro

Filtro sólido líquido
241.5 241.1
UV 287.5 287.2
360.9 361.3
536.5 536.6
VIS
637.7 640.5
5.4.4 Si se emplean filtros o disoluciones comerciales de óxido de holmio los valores

exactos de esta tabla pueden variar dependiendo del fabricante. Considerar los
valores certificados cercanos a estas longitudes de onda.
5.4.5 Calcular la diferencia aritmética del promedio de los valores de longitud de onda
obtenidos con respecto a los valores de longitud de onda seleccionados o
certificados.
5.4.6 Comparar esta diferencia contra los valores establecidos en el numeral 5.9.2.

t: 55 50 80 52 00
135
Revisión 1
5.5 Criterio No. 5.- Sesgo y repetibilidad fotométrica
5.5.1 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con la solución de ácido sulfúrico o
ácido perclórico, utilizadas en la preparación de las disoluciones o filtros líquidos
de referencia.
5.5.2 Leer por sextuplicado, la absorbancia de la disolución o filtro de líquido de
dicromato de potasio y de la disolución de sulfato de cobre en cada longitud de
onda, como se señala a continuación:
Región espectral Material de referencia Longitud de onda (nm)

235
Dicromato de potasio de 60 257
UV
mg/L 313
350
600
650
VIS Sulfato de cobre de 20 g/L
700
750
5.5.3 Calcular el valor promedio, la desviación estándar y la desviación estándar relativa

(%RSDr) de los 6 valores de absorbancia obtenidos para cada una de las
longitudes de onda.
5.5.4 Sólo para UV, calcular la absorbancia específica a partir del valor promedio de la
absorbancia obtenida para cada longitud de onda de acuerdo a la siguiente
formula:
𝐴 ∗ 1000
𝐴1%
1𝑐𝑚 =
𝑏∗𝑐
Dónde:
A= Absorbancia de la disolución de dicromato de potasio obtenida a la longitud
de onda específica
b= Longitud de paso de absorción (1 cm)
c = Concentración de la disolución de dicromato de potasio expresada en
mg/100 mL
5.5.5 Comparar contra los valores establecidos en el numeral 5.9.3.
5.6 Criterio No. 6.- Linealidad fotométrica

5.6.1 Espectro UV
 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con la disolución de ácido sulfúrico al
0.01 N o la disolución de ácido perclórico establecida por el fabricante.
 Leer la absorbancia de las disoluciones de dicromato de potasio de 20, 40, 60, 80 y
100 mg/L a las longitudes de onda 235, 257, 313 y 350 nm.
5.6.2 Espectro VIS

t: 55 50 80 52 00
136
Revisión 1
Ajustar a 0 de absorbancia del instrumento con la disolución de ácido sulfúrico al
0.01 N
 Leer la absorbancia de las disoluciones de sulfato de cobre de 20, 40, 60, 80 y 100
g/L a las longitudes de onda de 600 y 650nm.
5.6.3 Elaborar un gráfico de linealidad de la absorbancia promedio obtenida (eje y)
contra las concentraciones de dicromato de potasio o sulfato de cobre según
corresponda (eje x), para cada una de las longitudes de onda.
5.6.4 Calcular el coeficiente de determinación (r2) de cada serie y de cada longitud de
onda.
5.6.5 Comparar contra el valor establecido en el numeral 5.9.4.
5.7 Criterio No. 7.- Luz dispersa

5.7.1 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con:
a) Agua destilada si se utiliza la disolución preparada en el laboratorio

b) Para disoluciones comerciales y filtros líquidos conforme a las especificaciones del
fabricante.
5.7.2 Leer la absorbancia por triplicado de la disolución de cloruro de potasio a una
longitud de onda de 198 nm y obtener el valor promedio.
5.7.3 Comparar contra el valor establecido en el numeral 5.9.5.
5.8 Criterio No. 8.- Resolución espectral

5.8.1 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con hexano
5.8.2 Leer la absorbancia por triplicado de la disolución de tolueno a las longitudes de
onda de 269 nm y 266 nm.
5.8.3 Obtener los valores promedio y calcular la relación de la absorbancia máxima
contra la absorbancia mínima.
5.8.4 Comparar contra el valor establecido en el numeral 5.9.6
5.9 Criterio No. 9.- Requerimientos metrológicos
5.9.1 Absorción de celda
Región espectral Longitud de onda Requerimiento metrológico

UV 240 nm ≤ 0.093 uA
VIS 650 nm ≤ 0.035 uA
Rotación de celda Diferencia ≤ 0.005 uA
5.9.2 Sesgo de longitud de onda

t: 55 50 80 52 00
137
Revisión 1
Región espectral Requerimiento metrológico
UV ± 1 nm
± 2 nm (sólo para arreglo de diodos)

VIS
± 3 nm
5.9.3 Sesgo y repetibilidad fotométrica

Requerimiento metrológico
Longitud de onda
Región espectral (𝑨𝟏%
𝟏𝒄𝒎 )
(nm)
235 122.9 a 126.2
257 142.8 a 146.2
UV
313 47.0 a 50.3
350 105.6 a 109.0
Longitud de onda Requerimiento metrológico

Región espectral
(nm) (uA)
600 0.048 a 0.088
650 0.204 a 0.244
VIS
700 0.507 a 0.547
750 0.797 a 0.837
La desviación estándar relativa (%RSDr) de las 6 lecturas de absorbancia para cada
longitud de onda debe ser ≤ 1%.
5.9.4 Linealidad fotométrica

Longitud de onda
Región espectral Requerimiento metrológico
(nm)
235
257
UV
313
r2 ≥ 0.999
350
600
VIS
650
5.9.5 Luz dispersa

198 nm Absorbancia ≥ 2.0 uA
5.9.6 Resolución espectral

t: 55 50 80 52 00
138
Revisión 1
𝐴269
269 nm y 266 nm ≥ 1.3
𝐴266
Los resultados obtenidos de la verificación deben ser reportados en el CCAYAC-F-622

“Verificación metrológica de espectrómetros de UV-Visible”
Documentos Clave
6.1 Verificación metrológica de espectrómetros de UV-Visible CCAYAC-F-622
7. BIBLIOGRAFÍA.
Documentos
ASTM E275-08. Standard Practice for Describing and Measuring Peformance of
7.1
Ultraviolet and Visible Spectrophotometers. Reapproved 2013
European Pharmacopoeia, 9.0. 2.2.25 Absorption spectrophotometry, ultraviolet and
7.2
visible.
IANZ. Technical Guide AS TG4. 2005. UV/Vis Spectrophotometer Calibration
Procedures. Second edition
7.3
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CalibracionEspectrofotometro_24858.p
df
ISO 10012:2003. Measurement management systems-Requirements for
7.4
measurement processes and measuring equipment
MSL Technical Guide 38. 2017 Reference materials for the calibration of UV/visible
7.5 light spectrophotometers. Versión 4.
https://measurement.govt.nz/download/10
OMCL Network of the Council of Europe, 2007. Quality Assurance Document.
Qualification of Equipment. Annex 3. Qualification of UV-Visible
7.6 Spectrophotometers. PA/PH/OMCL (07) 11 DEF CORR
https://www.edqm.eu/medias/fichiers/Annex_3_Qualification_of_UV_Visible_spectro
photometers.pdf
Starna, 2017 Certified Reference Materials for UV and Visible Spectroscopy.
7.7
https://www.anadis.nl/source/Starna/Anadis_reference_material_catalogue2017.pdf
The International Pharmacopoeia, 2018. 1.6 Spectrophotometry in the visible and
7.8
ultraviolet regions. Seventh Edition
7.9 The United States Pharmacopoeia, 2018. 857 Ultraviolet-Visible Spectroscopy.

t: 55 50 80 52 00
139
Revisión 1
1857 Ultraviolet-Visible Spectroscopy- Theory and Practice. Ed. 41
Valid Analytical Measurement (VAM) Programme, 2000. Guidance on Equipment
Qualification of Analytical Instruments: UV-Visible Spectro (photo) meters (UV-Vis).
Version 1.0http://blpd.dss.go.th/training/dwdocuments/enews/vam_uvvis.pdf
8. ANEXOS.
Anexo 1.- Preparación de disoluciones

t: 55 50 80 52 00
140
Revisión 1
Anexo 1
Preparación de disoluciones
8.1 Disolución de óxido de holmio al 4 % (m/v)
Disolver en un vaso de precipitados 4.0 g de óxido de holmio (III) con una pureza ≥ 99.5%
y llevar a un volumen de 100 mL con ácido perclórico al 10% (v/v). Calentar y agitar para
facilitar su disolución. Dejar en reposo por 24 h a temperatura ambiente.
8.2 Disolución de dicromato de potasio de 60 mg/L
Disolver de 57.0 a 63.0 mg de dicromato de potasio con una pureza ≥ 99.9 % y

previamente secado en estufa a 130°C por dos horas, con disolución de ácido sulfúrico
0.01 N y llevar a un volumen de 1 L con la misma disolución ácida.
8.3 Disolución de ácido sulfúrico 0.01 N.
Medir 280 µL de ácido al 95-97%, diluir con agua destilada y llevar a un volumen de 1 L.
Homogeneizar
8.4 Disolución de dicromato de potasio de 100 mg/L en ácido sulfúrico.
Disolver 100 mg de dicromato de potasio con una pureza ≥ 99.9 % y previamente secado
en estufa a 130°C por dos horas, con disolución de ácido sulfúrico 0.01 N y llevar a un
volumen de 1 L con la misma disolución ácida.
8.5 Disoluciones de dicromato de potasio.

A partir de la disolución de 100 mg/L preparar, las disoluciones como se indica en la
siguiente tabla:
Volumen de disolución de 100

Concentración Volumen de aforo
mg/L
(mg/L) (mL)
(mL)
20 10 50
40 20 50
60 30 50
80 40 50
100 0 50
Llevar al volumen de aforo con disolución de ácido sulfúrico 0.01 N.
8.6 Disolución de cloruro de potasio de 12 g/L

t: 55 50 80 52 00
141
Revisión 1
Pesar 1.2 g de cloruro de potasio con una pureza ≥ 99.5 %, disolver en vaso de precipitados
con agua destilada y llevar a un volumen de 100 mL.
8.7 Disolución de tolueno al 0.02 % (v/v)
Medir 20 µL de tolueno grado espectrofotométrico y llevar a un volumen de 100 mL con

hexano grado espectrofotométrico.
8.8 Disolución de sulfato de cobre de 100 g/L
Disolver en un vaso de precipitados 10.0 g de sulfato de cobre pentahidratado, de una

pureza ≥ 99,9%, en suficiente agua destilada. Adicionar con cuidado, 1 mL de ácido
sulfúrico, y trasvasar cuantitativamente la solución a un matraz volumétrico de 100 mL.
Llevar al volumen con agua.
8.9 Disoluciones de sulfato de cobre
A partir de la disolución de 100 g/L preparar, las disoluciones como se indica en la

siguiente tabla:
Volumen de disolución de 100 g/L

Concentración Volumen de aforo
(mL)
(g/L) (mL)
20 5 25
40 10 25
60 15 25
80 20 25
100 0 25

t: 55 50 80 52 00
142
Revisión 1
Agradecimientos
La Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC) reconoce y

agradece al personal de las Gerencias de Análisis y Desarrollo de Pruebas Fisicoquímicas
y Toxicológicas, Microbiológicas, e Inmunológicas y Bioquímicas; y a la Coordinación de
Aseguramiento de Calidad.
Este trabajo no hubiese sido posible sin sus invaluables aportaciones basadas en sus
conocimientos y amplia experiencia.

t: 55 50 80 52 00
143
Revisión 1

Compendio Criterios Tecnicos 2020

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Compendio Criterios Tecnicos 2020

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

COMISIÓN FEDERAL PARA LA

PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y

COMPENDIO DE CRITERIOS TÉCNICOS

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Dr. Jorge Alcocer Varela

Dr. José Alonso Novelo Baeza

D. en C. Armida Zúñiga Estrada

Q.F.B. Josefina Gutiérrez Ramírez

M. en I. Imelda Rocío Guzmán Cervantes

Primera revisión, Julio 2020.

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Establecer los criterios técnicos aplicables a métodos fisicoquímicos, microbiológicos e

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

3.4. Exactitud relativa o recuperación: Es la aproximación entre un resultado de la

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.1. Criterios Generales

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.3. Criterios para la verificación inicial del método.

Grupos de Productos Frutas y Productos

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.4.5.1. Para determinar si el método cumple con la probabilidad de que el

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.4.6.2. Por ejemplo; al obtener el resultado de la lectura tenemos la combinación: 310,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.4.7.1. Calcular el logaritmo del resultado obtenido en las tablas correspondientes

5.4.7.2. Calcular la Desviación Estándar (σ) para obtener el coeficiente de variación:

5.4.7.3. Utilizando los valores anteriores, considerar la aplicación de la siguiente

Calcular las UFC en cada repetición y calcular el logaritmo.

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.4.9. Criterios específicos para el cálculo de la incertidumbre.

5.4.10. Incertidumbre combinada

Dónde U¢: SR y Sr es la raíz de las varianzas totales de repetibilidad y reproducibilidad

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Anexo 1.- Estructura del protocolo

Anexo 2.- Elaboración del informe

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

La estructura para la elaboración del protocolo para la verificación de métodos de análisis

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Estructura del informe de verificación

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Aplica a las pruebas fisicoquímicas empleadas en el análisis de agua, alimentos, juguetes,

3.1 Analito: Componente específico de una muestra, a medir en un análisis.

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.2 Criterio No. 2.- Verificación del método

5.2.1 La verificación se lleva a cabo cuando:

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.3 Criterio No. 3.- Selección de la matriz

 Para alimentos de origen vegetal:

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.4 Criterio No. 4.-Preparación de muestras

5.4.1 Preparar blancos de muestra o muestras en una cantidad equivalente a la

5.5 Criterio No. 5.-Evaluación de las características de desempeño

Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, www.gob.mx/cofepris,

5.5.2 Intervalo de trabajo

a) Con los datos de respuesta analítica obtenidos en la prueba de linealidad, calcular