Taller de Laboratorio I - Primer Cuatrimestre 2021

EQUIPO DOCENTE:

➔ Dra. Natalia Calienni (Comisión I)

➔ Dra. Erica A. Antón (Comisión II)

➔ Asepsia y esterilización

➔ La esterilización es el proceso que se utiliza para eliminar todo tipo de

microorganismos (hongos, bacterias, virus, esporas)

➔ Asepsia define al conjunto de métodos aplicados para la conservación de la

esterilidad
➔ Asepsia y esterilización

➔ Sanitación o higienización:
➔ Objetivo: reducir el número de microorganismos, entre los cuales no se prevé la presencia de
ningún agente patógeno específico. Se logra un nivel de seguridad necesario para la higiene de
hoteles, comedores, etc
Descripción: se logra mediante el lavado con agua y jabón o detergentes. Es un paso obligado
previo a realizar otros procesos

➔ Desinfección:
➔ Objetivo: disminuir el número de microorganismos presentes en los materiales a un nivel seguro
para el operario. También se aplica a los materiales que entrarán en contacto con piel sana
únicamente.
Descripción: se logra a través de la aplicación de desinfectantes químicos o por la aplicación de
agua o vapor entre 70 y 75ºC

➔ Esterilización:
➔ Objetivo: eliminar o destruir todo microorganismo en forma viva o latente
➔ Asepsia y esterilización

➔ En la esterilización existe siempre una posibilidad que algunos contaminantes puedan sobrevivir
y que una porción de artículos permanezca sin esterilizar

➔ Eficiencia del proceso de esterilización: Un proceso eficiente es aquel que ha sido diseñado para
lograr una proporción aceptablemente baja (por ej. una en un millón) de microorganismos
sobrevivientes y artículos no estériles

➔ La eficiencia se introduce en el diseño del proceso determinando la severidad del tratamiento

(por ej. tiempo a una T determinada) que se requiere para matar todos los tipos y cantidades
de contaminantes microbianos de los objetos a ser tratados
➔ El proceso debe ser validado por tests químicos, físicos y biológicos apropiados y ser
monitoreado regularmente durante la operación
➔ Para garantizar la eficiencia del proceso hay que tener en cuenta tres factores:
* Diseño del proceso
* Test del proceso
* Test del producto
➔ Asepsia y esterilización

➔ Existe numerosa legislación y disposiciones tendientes a garantizar el adecuado tratamiento de

los productos al ser esterilizados tanto en firmas comerciales como en establecimientos de salud
públicos y privados

➔ MINISTERIO DE SALUD Y DESARROLLO SOCIAL

SECRETARÍA DE GOBIERNO DE SALUD
Resolución 1067/2019
RESOL-2019-1067-APN-SGS#MSYDS

➔ DIRECTRICES DE ORGANIZACIÓN Y FUNCIONAMIENTO DE CENTRALES DE

ESTERILIZACIÓN (Anexo I)
➔ GRILLA DE HABILITACIÓN CATEGORIZANTE PARA CENTRALES DE ESTERILIZACIÓN
(Anexo II)

https://www.boletinoficial.gob.ar/detalleAviso/primera/211150/20190711
➔ Asepsia y esterilización
➔ GRILLA DE HABILITACIÓN CATEGORIZANTE PARA CENTRALES DE ESTERILIZACIÓN
(Anexo II)

https://www.boletinoficial.gob.ar/detalleAviso/primera/211150/20190711
➔ Asepsia y esterilización
➔ Esterilización: métodos, medios y procedimientos
➔ Métodos de esterilización se eligen de acuerdo a:
* Naturaleza del objeto a esterilizar
* Sensibilidad del material al agente esterilizante
* Penetrabilidad del agente en el material
* Presentación del material (volumen, fraccionamiento)
* Uso posterior del material

➔ Métodos físicos
➔ Los métodos físicos se basan en la utilización de calor húmedo, seco o radiación, destruyen
todas las formas de vida microbiana, incluyendo las esporas, el método más utilizado es el de
vapor a presión

➔ Calor directo: incineración

➔ Calor seco: aire caliente
➔ Calor húmedo: vapor a presión
➔ Radiación ionizante
➔ Asepsia y esterilización
➔ Esterilización: métodos, medios y procedimientos
➔ Métodos de esterilización se eligen de acuerdo a:
* Naturaleza del objeto a esterilizar
* Sensibilidad del material al agente esterilizante
* Penetrabilidad del agente en el material

El calor desnaturaliza estructuras y macromoléculas: membranas, proteínas, etc.

Todos los microorganismos son susceptibles a la acción del calor
Su sensibilidad varía con la especie y con el estado en que se encuentren
En general las formas vegetativas bacterianas mueren por calentamiento a 50-70ºC
Las endosporas que son las formas de vida más termoresistentes, requieren mayores temperaturas y
tiempo de exposición (ciclos)

endosporas
bacterianas esporas
fúngicas
➔ Asepsia y esterilización
➔ Esterilización: métodos, medios y procedimientos
Endosporas y resistencia

Controles
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos químicos

➔ Gas óxido de etileno

➔ Gas y solución de formaldehído
➔ Plasma/vapor peróxido de hidrógeno
➔ Ozono
➔ Soluciones: ácido acético, ácido peracético, glutaraldehído y cloroxidante
electrolítico
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos físicos
➔ Calor directo: flameado e incineración
➔ Se aplica directamente la llama de un mechero. Se utiliza para la esterilización
de asas e hilos de siembra, pinzas así como las bocas de tubos y matraces
antes y después de utilizarlos
➔ NOTA: Uso correcto de mecheros (de gas y alcohol)
➔ Cuidados requeridos al operar con alcohol

➔ La incineración también se emplea para destruir materiales de desecho

contaminados

➔ Calor seco: establecimiento de un área esteril mediante el uso de mecheros

➔ Asepsia y esterilización

➔ Calor directo: flameado e incineración

➔ Calor seco: establecimiento de un área esteril mediante el uso de mecheros

(8.15) https://www.youtube.com/watch?v=4S6MxkiNtUM
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos físicos
➔ Calor seco
➔ El mecanismo de acción microbicida se basa en la acción oxidante del aire seco
caliente que circula por convección forzada a través de los productos
➔ La muerte microbiana se produce como consecuencia de mecanismos de
transferencia de energía y oxidación
➔ Agente esterilizante: aire caliente
➔ Se usa para materiales que no soportan la esterilización en vapor o que el óxido
de etileno no puede penetrar en ellos (vaselina, aceites, polvo de talco, ceras)
➔ Se utiliza un ciclo de una hora a temperatura de 171ºC
➔ Dos horas a 160ºC
➔ Tres horas a 140ºC
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos físicos
➔ Calor seco: esterilización en estufas de todo
tipo de dimensiones
➔ Condiciones:
* La cámara se debe encontrar en perfecto
estado de limpieza
* La distribución de la carga debe permitir
la libre circulación del agente esterilizante
en la cámara
* Cada paquete debe quedar separado de
los vecinos y no debe estar en contacto con
las paredes, piso y techo del esterilizador
* La carga del esterilizador no
debe superar el 80% de la capacidad
total de la cámara
➔ Asepsia y esterilización
➔ Métodos físicos
➔ Calor húmedo
➔ Es el método de elección siempre que sea aplicable. Su efecto esterilizante se
fundamenta en la acción del calor transmitido por el vapor saturado a presión
superior a la normal sobre los componentes celulares, produciendo coagulación
proteica, ruptura de ADN y ARN y pérdida de material de bajo peso molecular,
logrando así inactivación de los microorganismos
➔ Agente esterilizante: vapor de agua saturado a presión superior a la normal
➔ La esterilización por calor húmedo se basa en el uso de vapor por encima de los 100ºC,
generalmente en un rango de temperatura de 121 a 134ºC. Tiempo mínimo de exposición para la
esterilización (USP, Farmacopea Americana) es de 15 minutos a 121ºC, 10 minutos a 126ºC y 3 minutos
a 134ºC. El vapor puede ser calentado a temperaturas superiores a los 100ºC sólo mediante el
incremento de la presión por encima de la presión atmosférica normal a nivel del mar
(recordar P vapor y diagrama de fases!)
Diagrama de fases del agua

Fluido
supercrítico
Líquido
Punto crítico
(374,4ºC ; 217,7 atm)
Presión (atm)

Sólido

Gas

Punto triple
(0,0098ºC ; 0,00603 atm)

Temperatura (ºC)
➔ Asepsia y esterilización
➔ Métodos físicos
➔ Calor húmedo
➔ Parámetros de referencia:
Temperatura 121ºC durante un tiempo de ≥15 minutos (USP)
➔ Se realizan manualmente o se programan ciclos de esterilización
➔ La selección del tipo de ciclo de esterilización a emplear depende de la
configuración del material a esterilizar (naturaleza, tamaño, empaque,
capacidad para soportar las temperaturas, la presión y el calor transferido)
➔ Los factores que pueden influenciar la esterilización de los productos son: tipo
de empaque según su densidad y porosidad, composición y complejidad del
dispositivo en cuanto a diseño y resistencia térmica, tipo de carga en el
esterilizador (homogénea o heterogénea), volumen de la cámara ocupado, etc.
➔ Asepsia y esterilización
➔ Métodos físicos
➔ Calor húmedo
➔ Ciclos de esterilización

➔ Un ciclo típico de esterilización por vapor consta de una etapa inicial de

eliminación previa del aire de la cámara y de los productos
➔ Seguido de la etapa de esterilizado o tiempo de contacto con el vapor saturado
a la temperatura preestablecida
➔ Finalmente se procede al secado del material, etapa fundamental para
mantener las propiedades barrera del envase
➔ Controles: temperatura en la cámara y en la carga, presión en cámara, indicador
químico de proceso, indicador biológico
➔ Asepsia y esterilización

➔ Tipos de esterilizadores
➔ Conocido comúnmente como autoclave, consiste en un aparato que se cierra
herméticamente y que en su interior desarrolla vapor bajo presión, permitiendo
que el calor húmedo elimine a los microorganismos
➔ Según el sistema de operación pueden clasificarse en:
• Manuales
• Automáticos
• Semiautomáticos
Por la producción de vapor pueden ser:
• Autoclaves que funcionan a vapor proveniente de la central de vapor
• Autoclaves con generador eléctrico de vapor
• Autoclaves con generador de vapor a gas
➔ Asepsia y esterilización
➔ Autoclaves, diferentes tamaños
y aplicaciones
➔ Asepsia y esterilización

➔ Autoclaves
➔ Como se preparan las muestras para ser esterilizadas
➔ Medios líquidos de cultivo y soluciones de trabajo
Tubos, botellas y demás recipientes de plástico y vidrio
Pipetas de vidrio
Material de cirugía de metal
Descartables
Ropa de trabajo en el laboratorio

➔ Ejemplos:
https://www.youtube.com/watch?v=Nw5DkCnVEWw
➔ Asepsia y esterilización
➔ Otros métodos de aplicación de calor húmedo
➔ Tindalización o esterilización fraccionada a vapor fluente
➔ El material se calienta a 80-100º durante 30 minutos, en días sucesivos, con periodos de incubación
entre ellos. De esta manera se destruyen las células vegetativas pero no las endosporas
termorresistentes.
Las endosporas que sobrevivieron pueden germinar en el periodo de incubación, son destruidas en el
calentamiento posterior.
➔ Esta técnica se puede emplear para esterilizar medios de cultivo que no se pueden calentar a
temperaturas superiores a 100º sin alterar sus propiedades. El principal inconveniente de esta técnica es
el consumo de tiempo. Actualmente tiene muy poco uso

➔ Pasteurización
➔ Es un método que reduce la cantidad de microorganismos viables. No es un método de esterilización
propiamente dicho pues no destruye esporas bacterianas. Es utilizada en la industria alimentaria. Hay
dos tipos de tratamiento: la pasteurización a baja temperatura y mayor tiempo (63ºC/30 minutos) y la
pasteurización a alta temperatura y corto tiempo, flash (72ºC/15 segundos).

➔ Uperización
➔ Variante de la pasteurización (ultrarrápida) en la que la temperatura se eleva por encima de 150ºC
durante unos segundos
➔ Asepsia y esterilización
➔ Esterilización mediante radiación ionizante gamma

➔ Centro Atómico Ezeiza de la Comisión Nacional de Energía Atómica

CNEA estudia los efectos de las radiaciones ionizantes tantos en alimentos como en una
gran variedad de productos, entre ellos dispositivos de uso médico, fármacos, tejidos para
implantes, etc. Según la dosis aplicada, puede lograrse una eliminación parcial de
microorganismos (descontaminación) o total (esterilización)

➔ Ejemplo: bolsas para órganos de trasplante

https://www.youtube.com/watch?v=nVEZi34nl8k
➔ Asepsia y esterilización
➔ Esterilización mediante radiación ultravioleta
Las de mayor actividad microbicida son las comprendidas entre 260-270 nm Son absorbidas por
lo ácidos nucleicos y aminoácidos aromáticos
Afectan a los ácidos nucleicos provocando pérdida de viabilidad
Tienen bajo poder de penetración: solo se utilizan para la esterilización de superficies (quirófanos,
salas de envasado de medicamentos)
Producen daños en ojos y piel

➔ Ejemplos: cabinas de flujo laminar y bioseguridad,

gabinetes para instrumental odontológico
➔ Asepsia y esterilización
➔ Método físico (sin calor ni radiación): Filtrado
➔ Para muestras termosensibles: filtros adecuados para grandes y pequeño volúmenes
➔ Diferentes tamaños de poro y materiales de membrana
➔ Partículas 0,45 µm
➔ Bacterias 0,22 µm
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos químicos

➔ Gas óxido de etileno

➔ Gas y solución de formaldehído
➔ Plasma/vapor peróxido de hidrógeno
➔ Ozono
➔ Soluciones: ácido acético, ácido peracético, glutaraldehído y cloroxidante
electrolítico
➔ Agentes oxidantes
➔ Asepsia y esterilización
➔ Métodos químicos: Esterilizadores de gas de óxido de etileno
➔ Diferente tamaño:
walk-in-room, de laboratorio, de mesada
➔ Asepsia y esterilización

➔ Métodos químicos: soluciones de limpieza

➔ Detergente no iónico para cabinas de bioseguridad y de flujo laminar

Material de acero inoxidable se debe tener cuidado con los oxidantes como
hipoclorito de Na (lavandina)

➔ Biocidas: soluciones de alcohol al 70%, lavandina, soluciones de amonio

cuaternario a diferentes porcentaje
➔ Asepsia y esterilización
➔ Métodos químicos: soluciones de limpieza
BIOX Cada 100 g contiene (p/p): Potasio peroximonosulfato, 54,45%; Sodio hexametafosfato, 21,05%;
Potasio persulfato, 1,36%; excipientes, c.s.p 100 g.
Virkon: Bis (peroximonosulfato) bis (sulfato) de Pentapotasio 497 gr/kg. Compuestos peroxidados,
tensioactivos y ácidos orgánicos.
➔ Asepsia y esterilización
➔ Eficiencia
El proceso debe ser validado por tests químicos, físicos y biológicos apropiados y ser
monitoreado regularmente durante la operación
Existen ampolletas que en su interior contienen caldo
de cultivo y un disco inoculado con esporas (bacilus
stearothermophilus) para proceso a vapor y (esporas
b. subtilis) para procesos en gas.

Una vez terminado el proceso de esterilización, se

someten las ampolletas a un proceso de incubación

Terminado en periodo de incubación si el color del

caldo de cultivo cambió a color amarillo, la
esterilización no fue efectiva. Esto se origina porque
no se logra aniquilar las esporas, éstas se alimentan
con el caldo de cultivo durante el tiempo de
incubación y se agrega una sustancia ácida que
cambia el pH del caldo de cultivo y con ello la
coloración.

Controles
➔ Asepsia y esterilización
➔ Eficiencia
El proceso debe ser validado por tests químicos, físicos y biológicos apropiados y ser
monitoreado regularmente durante la operación

Cintas testigo:
Indican si el proceso de esterilización funciona
correctamente.
Son cintas que viran de color cuando alcanzan
determinada temperatura dentro de los aparatos
esterilizados.
No son indicadores de que los procesos de
esterilización, con todos sus ciclos, se hayan
cumplido correctamente.
El uso de las mismas en forma rutinaria en todos
los materiales que se esterilicen, no debe
reemplazar los monitoreos biológicas periódicos.
➔ Asepsia y esterilización

➔ Eficiencia
El proceso debe ser validado por tests químicos, físicos y biológicos apropiados y ser
monitoreado regularmente durante la operación
Validación de los procesos de esterilización
Para la validación de los procesos de esterilización pueden interpretarse de la
siguiente manera:

Método Físico:
La prueba de la eficacia diaria del esterilizador de vapor se lleva a efecto antes de
realizar la primera carga, por medio de hojas impresas con tinta especial en forma
gráfica en espiral, llamada BOWIE & DICK, que es un método recomendado para
prueba de funcionamiento diario en la primer carga del día y en cada uno de los
esterilizadores de vapor. Las gráficas están diseñadas en color AZUL, las cuales al
funcionamiento del esterilizador (operación) la gráfica va cambiando en forma
uniforme a color NEGRO, si no registra el cambio en forma uniforme indicará mal
funcionamiento del esterilizador como sería, temperatura incorrecta o presencia de
burbujas de aire, entre otros.
➔ Asepsia y esterilización

➔ Eficiencia
El proceso debe ser validado por tests químicos, físicos y biológicos apropiados y ser
monitoreado regularmente durante la operación

Método Químico:
Verifica el exacto cumplimiento de los parámetros de esterilización; están
debidamente calibrados para penetrar el vapor dentro de los paquetes hasta alcanzar
las condiciones de esterilización. Las etiquetas indicadoras de validación se
introducen dentro del paquete en la parte central durante un ciclo de esterilización;
las etiquetas para esterilización por vapor están diseñadas con flechas de color
VERDE que al concluir el ciclo de esterilización cambian a color NEGRO, lo cual indica
que se dio la esterilización completa cubriendo los parámetros de temperatura,
tiempo y humedad. En el caso de esterilización con gas óxido de etileno las etiquetas
indicadoras están diseñadas por bandas de color ROJO que al concluir el ciclo de
esterilización cambian a color VERDE, cubriendo los parámetros: temperatura,
tiempo, humedad y concentración de óxido de etileno.