Trabajo 2-Grupo10-Bioingeniría

Universidad Nacional de Ingeniería
Facultad de Ingeniería Química y Textil
Introducción a la bioingeniería
PI-521 A
Trabajo N°2
“INFLUENCIA DEL MATERIAL TRANSDUCTOR DE UN
MICROELECTRODO BIOSENSOR ENZIMÁTICO
AMPEROMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN IN VITRO DE
TRIFOSFATO DE ADENOSINA”
Integrantes – Grupo 10
- Aparicio Huablocho Jordan Alexis 20171295J
- Castillo Barzola Angie Lucerito 20172214C
- Terrones Fernandez Ersim Antony 20172648C
Profesor responsable: Ing. Neira Montoya Enrique
Fecha de entrega de la práctica: 25 / 06 / 2021
Periodo Académico 2021-I
Lima-Perú
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA – FIQT PI521A
Índice
Resumen 3
Abstract 3
1. Introducción 4
2. Antecedentes 5
3. Fundamento teórico 5
3.1. Biosensor 5
3.1.1. Aplicación de biosensores 6
3.2. Biosensores enzimáticos amperométricos 7
3.2.1. Materiales Transductores 7
3.2.2. Transducción electroquímica 8
4. Metodología 9
4.1. Diseño de la investigación 9
4.2. Variables de investigación 9
4.3. Población y muestras de en estudio. 10
4.3.1. Población. 10
4.3.2. Muestra. 10
4.4. Procedimiento 10
4.4.1. Fabricación de los electrodos. 10
4.4.1.1. Microelectrodos de disco de platino. 10
4.4.1.2. Microelectrodos de pasta de carbono. 11
4.4.2. Estudios de estimación de áreas electronegativas y determinación del
potencial de oxidación de H2O2. 12
4.4.3. Inmovilización de enzimas. 12
4.4.4. Estudio del desempeño del componente GOx del biosensor. 12
4.4.5. Caracterización del biosensor de ATP. 12
4.4.6. Análisis de datos. 13
5. Resultados y Análisis de Resultados. 13
5.1. Método de preparación de las pastas de carbono 13
5.2. Áreas electroactivas 14
5.3. Demostración del potencial de detección de H2O2: 15
5.4. Estudio de sensibilidades y límites de detección para H2O2: 16
Bibliografía 21
1
Índice de figuras
Figura 1. Estructura de un biosensor. 6

Figura 2. Microelectrodo de disco de platino. 11
Figura 3. Microelectrodo de pasta de carbono. 11
Figura 4. Resultado de comparaciones de corrientes de background entre los métodos de
mezcado en la obtención de pastas de carbono 14
Figura 5. Resultados de sensibilidades de los electrodos en la detención de H2O2 16
Figura 6. Respuestas electroquímicas a H2O2 16
Figura 7. Respuesta electroquímica a glucosa. 18
Figura 8. Respuesta electroquímica a ATP 19
Índice de tablas
Tabla 1. Variables de investigación. 9

Tabla 2. Corrientes background y ruido para varios metales preparados para los dos
métodos. 13
Tabla 3. Cargas eléctricas y áreas electroactivas para varios materiales de electrodos. 14
Tabla 4. Potenciales de oxidación de H2O2 para varios metales transductores. 15
Tabla 5. Sensibilidades y límites de biosensor de ATP durante varios días de
funcionamiento 20
2
Resumen
Los microelectrodos amperométricos biosensores enzimáticos son actualmente atractivos
en la monitorización del trifosfato de adenosina como un instrumento analítico de bajo
costo y corto tiempo con el potencial de ser miniaturizado
Para determinar qué material proporciona las respuestas analíticas las mejores
características en la detección de ATP en microelectrodos se han elaborado con tres
materiales de diferente amperometría: pasta de grafito platinizado, pasta platino vítrea y
discos de platino; juntas, las pastas de carbón se prepararon mediante diferentes métodos.
Las membranas bioactivas de los biosensores de ATP se han convertido en sustratos de

soporte inmovilizando glucosa oxidasa y en el polifenol por electropolimerización.
La enzima GOx mostró una sensibilidad de 40,81 a pA mM-1 que permaneció estable
durante 7 días con una variación significativa y tenía un amplio rango de linealidad de
glucosa de 0,55 a 49,63 mM.
La pareja enzimática GOx / HEX se evaluó durante 5 seguimientos ATP mostrando una
sensibilidad de 12,45 a pA µM-1 en el primer día y consecuentemente perdió 65% hasta
el quinto día de almacenamiento de biosensor de tampón PBS pH 7,1 a 4ºC, el intervalo
de respuesta fue de 0,17 a 1,99 µM.
Abstract
Enzyme biosensor amperometric microelectrodes are currently attractive in monitoring

adenosine triphosphate as a low-cost, short-time analytical instrument with the potential
to be miniaturized.
To determine which material provides the analytical responses the best characteristics in
the detection of ATP in microelectrodes have been elaborated with three materials of
different amperometry: platinized graphite paste, vitreous platinum paste and platinum
discs; Together, the charcoal pastes were prepared by different methods.
The bioactive membranes of the ATP biosensors have been converted into support
substrates by immobilizing glucose oxidase and in the polyphenol by
electropolymerization.
The GOx enzyme showed a sensitivity of 40.81 to pA mM-1 that remained stable for 7
days with significant variation and had a wide range of glucose linearity from 0.55 to
49.63 mM.
3
The GOx / HEX enzyme pair was evaluated during 5 ATP follow-ups showing a
sensitivity of 12.45 to pA µM-1 on the first day and consequently lost 65% until the fifth
day of storage of PBS buffer pH 7.1 biosensor at 4ºC, the response range was 0.17 to 1.99
µM.
1. Introducción
En el momento actual, existen varias técnicas que nos permiten medir directamente
ATP en concentraciones fisiológicas, estas son cromatografía líquida, fluorescencia,
quimioluminiscencia, técnicas de bioluminiscencia amperométricas.
Sin embargo, de todas estas técnicas, solo biosensores amperométricos de tiempos de

respuesta cortos, alta especificidad y estabilidad a largo plazo para mediciones in vitro
e in vivo; y estas también son alternativas económicas para productos químicos, en
comparación con las técnicas antes mencionadas, que además de más caras, también
pueden requerir muchos pasos para realizar la detección de analitos, lo que requiere
más tiempo para obtener una respuesta.
Además de todas las ventajas antes mencionadas, son fáciles de maniobrar y se

pueden miniaturizar. Los componentes que influyen en el diseño de un biosensor
ayudan a comprender qué parámetros cambian durante un evento de reconocimiento
en un biosensor. Este conocimiento es esencial para el desarrollo y la optimización de
biosensores. La elección del elemento de reconocimiento biológico es la crucial, que
se toma durante el desarrollo de un nuevo diseño de biosensor, porque la enzima que
se eligió reacciona selectivamente con el analito de interés. Dicha enzima debe ser
estable bajo las condiciones y almacenamiento del biosensor y debe proporcionar un
plazo razonable a largo plazo. Además, un factor importante, en particularmente con
respecto a la comercialización potencial, es que la enzima redox tiene un costo
razonable.
Dicha enzima debe ser estable en las condiciones y almacenamiento del biosensor y
debe proporcionar un plazo razonable a largo plazo. Además, un factor importante,
en particular con respecto a la comercialización potencial, es que la enzima redox
tiene un costo razonable.
4
2. Antecedentes
Se han desarrollado muchos sensores ATP amperométricos, pero se conoce

información sobre cómo estos electrodos están bajo la influencia de diferentes
materiales transductores.
Se ha demostrado que estos biosensores son selectivos para adenosina, selectivos para
guanosina trifosfato, citidina, uridina trifosfato, timidina trifosfato.
También se encontró un biosensor comercial protegido contra interferencias como

serotonina, ascorbato, urato, dopamina, UTP, ADP y adenosina. (Sarissa Biomedical,
2005)
En algunos casos superaron este problema usando un electrodo "nulo" para eliminar
la interferencia (Llaudet, Hatz, Droniou, & Dale, 2005), aunque es una buena
estrategia que el tamaño de la señal de interferencia sea pequeño a la señal medida
para el analito y la estabilidad tanto del sensor como del electrodo "cero" debería ser
bueno en mediciones biológicas. (Masson, Kranz, Mizaikoff, & Gauda, 2008)
También varía la estabilidad de los electrodos amperométricos que tienen

componentes inmovilizados en membranas bioactivas.
Los biosensores de ATP varían de biosensores que muestran una respuesta del 70%
después de 1 semana, que pierden entre un 35% y un 60% después de 2-3 semanas
(Kueng, Kranz, & Mizaikoff, 2004); (Liu & Sun, 2007), y biosensores que pierden un
10% después de 18 días. (Gotoh, Tamiya, Momoi, Kagawa, & Karube, 1987)
3. Fundamento teórico
3.1. Biosensor
Un biosensor es un dispositivo capaz de proporcionar una información analítica
específica cuantitativa o semicuantitativa, utilizando un elemento de
reconocimiento biológico que está en contacto directo con un elemento
transductor. Es un instrumento para la medición de parámetros biológicos o
químicos. Suele combinar un componente de naturaleza biológica y otro
fisicoquímico. (Bănică, 2012)
5
Se compone de tres partes:

✓ El sensor biológico: puede ser un tejido, un cultivo de microorganismos,
enzimas, anticuerpos, cadenas de ácidos nucleicos, etc. El sensor puede
ser tomado de la naturaleza o ser un producto de la biología sintética.
✓ El transductor: acopla los otros dos elementos y traduce la señal emitida
por el sensor.
✓ El detector: puede ser óptico, piezoeléctrico, térmico, magnético, etc.
Figura 1. Estructura de un biosensor.

La naturaleza ha desarrollado un amplio conjunto de biomoléculas o estructuras
biomoleculares que muestran una gran selectividad en el reconocimiento de
alguna propiedad particular de una determinada molécula de entre un conjunto o
una mezcla de ellas. Este fenómeno de reconocimiento selectivo de especies
obviamente puede ser aprovechado con fines analíticos para el diseño y
preparación de sensores de dichas especies. (Pingarrón & Sánchez Batanero,
1999)
3.1.1. Aplicación de biosensores
Los biosensores deben ser de preferencia para una determinada aplicación;
en el caso de que se trate de un diseño basado en un principio general, se
adaptan las condiciones a las necesidades de una tarea analítica específica.
Son usados con frecuencia en atención médica, siendo la identificación de
glucosa una de las más importantes aplicaciones por la dependencia de los
pacientes diabéticos y su continuo monitoreo en tiempo real; también se usa
en el campo dentro de procesos industriales, como el análisis de entes
patógenos en la industria alimentaria y monitoreo ambientan relacionado al
control ecológico. (Borgmann, Schulte, Neugebauer, & Schuhmann, 2011)
6
El diseño y principio de funcionamiento del biosensor dependen de la

muestra que el diseño dicte; por ejemplo, si se tiene una muestra como sangre
u orina (potencial peligro) es preferible que el biosensor sea desechable.
3.2. Biosensores enzimáticos amperométricos
3.2.1. Materiales Transductores
Electrodos de trabajo empleados en biosensores amperométricos son de
naturaleza sólida, donde el electrodo de mercurio es el único electrodo a
temperatura ambiente y su aplicación en biosensores no es común.
Los metales como platino, oro, plata y acero inoxidable han sido empleados
para fabricar electrodos electroquímicos, por presentar a excelentes
propiedades eléctricas y mecánicas.
Tienen una alta inercia química y proporcionan un amplio rango de potencial
de trabajo anódico con baja resistividad eléctrica, además poseen una
estructura cristalina muy pura que proporciona corrientes residuales bajas y
una alta relación señal-ruido
De forma particular, el platino y el oro son utilizados como electrodos de
trabajo para reacciones electroquímicas con potenciales estándar positivos;
mientras que el mercurio es útil para las reacciones con potenciales estándar
negativos.
Al emplear disolventes orgánicos, el platino cuidadosamente pulido hasta
obtener un acabado de espejo, es un electrodo químicamente inerte, a
menudo con muy favorables cinéticas de transferencia electrónica. En estos
medios la adsorción de compuestos orgánicos de los reactivos y los
productos de las reacciones en los electrodos es generalmente insignificante.
Posterior al pulido debe realizarse también una limpieza electroquímica de
la superficie de platino inmediatamente antes de la medición, puede ser
realizada por la polarización del electrodo con una serie de pulsos
voltamétricos cíclicos
Con el desarrollo de la nanociencia y la nanotecnología, las nanopartículas
de metales han atraído cierto sustancial interés, llegando a emplearse
electrodos basados en nanopartículas de plomo en la detección de H2O2 sin
la necesidad de emplear enzimas, principalmente por su alta eficiencia
electrolítica y selectividad de H2O2. (Xiao, Zhao, Zhang, Guo, & Zeng,
2009)
7
3.2.2. Transducción electroquímica

Los biosensores amperométricos son sensores electroquímicos cuya
transducción se basa en la imposición de un potencial como medio de
perturbación para generar una repuesta que en este caso es que la reacción
electroquímica sea consumada.
La amperometría es la medición de la corriente de celda cuando la diferencia
de potencial entre electrodo de trabajo y electrodo de referencia es
controlada, en una solución con agitación o movimiento. Algunas técnicas
relacionadas a la amperometría son: cronoamperometría,
cronocolumbimetría, electrogravimetría, electrografía, etc.
Específicamente para el trabajo de investigación en cuestión, se desarrolla el
biosensor para la determinación de ATP con la técnica de
cronoamperometría; esta es una técnica potenciostática que mide el potencial
de una corriente que resulta de la oxidación o reducción electroquímica de
una especie electroactiva específica seleccionada mediante control del
potencial constante del electrodo de trabajo (generalmente Pt, Au o C) con
respecto a un electrodo de referencia. La ecuación que relaciona la corriente
resultante con la concentración de las especies electroactivas es la ecuación
de Corttrell (comportamiento lineal cuando el proceso se da en condiciones
de estado estacionario)
𝑖 = 𝐾𝐶0 ∗
Donde:
i: Corriente
𝐶0 ∗ : Concentración de analito en solución
K: Constante de proporcionalidad
3.2.3. Sistema de reconocimiento moleculares (membrana bioactiva)
Para el reconocimiento de la biomolécula macromolecular (enzimas,
coenzimas, coenzimas, anticuerpos, células, etc) en cuestión, esta se
inmoviliza sobre superficies conductoras con retención completa de sus
propiedades; dichas superficies pueden ser películas de polímeros orgánicos
electropolimerizadas, se trata de la formación electroquímica de capas de
polímero de espesor controlado. El método electroquímico implica atrapar
las biomoléculas en la superficie mientras ocurre la electrogeneración sobre
la superficie de un electrodo.
8
Otra aplicación indica que se debe dar la adsorción previa de monómeros

anfifílicos y biomoléculas antes de que la etapa de electropolimerización sea
realizada. Una de las ventajas que conlleva la polimerización electroquímica
es que las películas de polímero pueden ser preparadas fácilmente.
4. Metodología
4.1. Diseño de la investigación
Este trabajo está basado en un diseño de exploración para la búsqueda de mejoras
en las condiciones para la construcción de transductores en biosensores de ATP
in vitro, en las cuales se tuvo en cuenta diferentes alternativas del material de los
transductores tales como pastas de carbón vitreo platinizadas, pastas de grafito
platinizadas y platino. También busca especificar las propiedades, características
y rasgos importantes en las señales analíticas de los diferentes diseños de
biosensores de ATP propuestos y la influencia de los materiales transductores en
estos, basándose en los datos obtenidos experimentalmente.
4.2. Variables de investigación
Tabla 1. Variables de investigación.
Variables Independientes Dependientes

Preparación de - Tipo de material transductor: - Corriente de fondo
las pastas de microelectrodo de pasta de grafito y ruido.
carbono y microelectrodo de pasta de
carbón vítreo platinizado.
- Método de preparación de las
pastas de carbono.
Estimación de - Tipo de material transductor: - Área electroactiva
áreas microelectrodo de pasta de grafito de los electrodos
electroactivas platinizado, microelectrodo de con platino en su
pasta de carbón vítreo platinizado superficie.
y microelectrodo de disco de
platino.
Determinación - Tipo de material transductor: - Potencial de
del potencial de microelectrodo de pasta de grafito detección de H2O2.
detección de platinizado, microelectrodo de
H2O2 pasta de carbón vítreo platinizado
9
platino.
Estudio de las - Tipo de material transductor: - Sensibilidades de
características microelectrodo de pasta de grafito las curvas de
de detección de platinizado, microelectrodo de calibración.
H2O2 pasta de carbón vítreo platinizado
platino.
Estabilidad a - Tiempo de funcionamiento: 1, 2, - Sensibilidad de
largo plazo de 3, 4, 5, 6 y 7 días. curvas de
GOx calibración con
glucosa.
Estabilidad a - Tiempo de funcionamiento del - Sensibilidad de
largo plazo de biosensor de ATP: 1, 2, 3, 4 y 5 curvas de
GOx/HEX días. calibración con
ATP.
4.3. Población y muestras de en estudio.

4.3.1. Población.
Se construyeron 12 microelectrodos con cada material transductor:
ultramicrodiscos de platino, pasta de grafito platinizadas y pasta de carbón
vítreo platinizadas.
4.3.2. Muestra.
Se utilizaron 4 microelectrodos de cada tipo. Por otro lado, el tamaño
muestral en el estudio de preparación de las pastas fue de 3 electrodos por
cada pasta.
4.4. Procedimiento
4.4.1. Fabricación de los electrodos.
4.4.1.1. Microelectrodos de disco de platino.
Para la elaboración de este tipo de microelectrodos se usó pequeño
alambre de platino de 50 micrones de diámetro cubierto con teflón
(1cm de largo aprox.), el cual es unido a un alambre de cobre (4 cm
de largo aprox.) con adhesivo conductivo epoxico de plata el cual
10
es secado por una noche recomendablemente. Luego este alambre

resultante es pasado a una micropipeta llena con resina epoxica no
conductiva, después se corta la punta de la pipeta para así obtener
el microelectrodo de disco. Finalmente es pasado por un proceso
de pulido en alúmina y una limpieza electroquímica de la superficie
del electrodo.
Figura 2. Microelectrodo de disco de platino.

4.4.1.2. Microelectrodos de pasta de carbono.
La obtención de las mezclas de pastas de carbono se dio por dos
métodos, uno mezclando polvo y aglutinante en una caja Petri con una
vara agitadora y el otro método mediante mezclas de materiales en
mortero y pistilo. La pasta obtenida se llena en una micropipeta hasta
no dejar espacios entre la pasta y la micropipeta, luego se inserta un
alambre de cobre hasta la mitad de volumen finalmente se fija el
alambre con una gota de resina epoxica no conductiva (dejar secar una
noche).
El paso final para la obtención de los electrodos es hacer la
platinización mediante electrodeposición de nanopartículas de platino,
finalmente así haciendo si respectiva limpieza electroquímica para
tener la seguridad de que estas estén purificadas.
Figura 3. Microelectrodo de pasta de carbono.
11
4.4.2. Estudios de estimación de áreas electronegativas y determinación del

potencial de oxidación de H2O2.
La estimación de las áreas electronegativas de los electrodos fabricados se
determinó mediante la medición de áreas bajos los picos de
adsorción/desorción del hidrogeno en los ciclovoltamperogramas. Y para la
determinación del potencial de oxidación del peróxido de hidrogeno se llevó
a cabo voltamperometrías cíclicas en tres soluciones de H2O2 (1.96, 3.85 y
5.66 mM) disueltas en n 0.5 M H2SO4 a una velocidad 0.05 V/s de barrido
de potencial.
4.4.3. Inmovilización de enzimas.
Una etapa previa a la inmovilización es la determinación del potencial de
oxidación, el cual según los resultados obtenidos fue 0.8V. Para la
inmovilización de enzimas, los electrodos fueron introducidos en una
solución 0.1 M PBS buffer pH 7.1 que contiene 50 mM fenol, 36.19 mg/mL
HEX y 23.81 mg/mL GOx (glucosa oxidasa), las cuales sirven para la
construcción de la membrana bioactiva del sensor mediante
electropolimerización oxidativa de fenol con las enzimas atrapadas en el
polifenol. Para finalmente ser lavados con agua destilada y almacenados a
4°C en una solución PBS Buffer.
Lo esencial de este paso es la preparación de la solución con las enzimas, las
cuales son una solución compuesta de fenol disuelto en PBS y la solución
contiene las enzimas disueltas en PBS las cuales se dejarán que se
homogenicen las dos soluciones por difusión molecular.
4.4.4. Estudio del desempeño del componente GOx del biosensor.
Antes de empezar los experimentos, las soluciones a ser utilizadas fueron
burbujeadas con una mezcla 95% O2 / 5% CO2 durante 15 minutos. Las
calibraciones fueron realizadas añadiendo varias alícuotas sucesivas de 0.5
M glucosa. Luego los experimentos fueron hechos durante 7 días para
estudiar la estabilidad a largo plazo de la glucosa oxidasa (GOx) en respuesta
a varias concentraciones de glucosa.
4.4.5. Caracterización del biosensor de ATP.
Antes de empezar los experimentos también se burbujeo a las soluciones
utilizadas con una mezcla de 95% O2 / 5% CO2 durante 15 minutos. Las
calibraciones del biosensor se dieron con una solución buffer de Krebs para
12
conservar la concentración de la glucosa esto debido a que la detección de

ATP está basada en una reacción competitiva entre la glucosa oxidasa (GOx)
y la hexoquinasa (HEX). Toda la calibración fue hecha en 5 días para así
tener un estudio a largo plazo del biosensor de ATP.
4.4.6. Análisis de datos.
En la investigación de la influencia del material transductor del
microelectrodo de un biosensor enzimático, los datos experimentales son
analizados de diferentes formas según la etapa o proceso que este. Como en
el análisis de la influencia del método de preparación de los microelectrodos
de los diferentes materiales propuestos, para su posterior análisis de las áreas
electroactivas, la determinación de del potencial de detección del peróxido
de hidrogeno y también estandarización de cada uno de los biosensores,
Todo esto se comparó con diseños al azar (ANOVA y ANCOVA) con los
cuales en comparación dio resultados de confianza muy buenos para así
determinar una mejor alternativa en el material transductor para la
construcción de biosensores enzimáticos de ATP.
5. Resultados y Análisis de Resultados.
5.1. Método de preparación de las pastas de carbono
Se estudia la influencia del método con el que se prepara las pastas de carbono,
utilizando como parámetros a la corriente de fondo (background) y ruido.
Tabla 2. Corrientes background y ruido para varios metales preparados para

los dos métodos.
Método Petri Mortero

Material
Grafito 32.58 ± 0.84 8.16 ± 0.04
Carbón vítreo 37.14 ± 0.05 9.75 ± 0.19
Con los datos de la Tabla 2, se analiza en un diseño de varianza para un diseño

factorial AxB, donde A es el material transductor y factor B es el método utilizado
para preparar dicho material.
13
Según el análisis de varianza, no hay diferencias significativas al 95% en alguna

de las interacciones, se comprueba con la prueba de Fisher (LSD) por la amplia
sensibilidad del método.
Figura 4. Resultado de comparaciones de

corrientes de background entre los métodos de
mezcado en la obtención de pastas de carbono
En la figura 4 se representa uqe un mejor método para preparar pastas de carbono

es mezclando polvo y aglutinante con mosrtero y pistilo
5.2. Áreas electroactivas

Para hallar las áreas electroactivas; se integran los picos de adsorción/desorción
de los ciclovoltamperogramas con el programa OriginPro 9.1 para el área bajo la
curva. El factor de conversión es de 210 μC/cm2
En esta fase solo se hacen uso de electrodos de pasta de carbono preparados con
mortero y pistilo.
Tabla 3. Cargas eléctricas y áreas electroactivas para varios materiales de

electrodos.
Material Carga eléctrica Área (mm2)

Grafito / Pt 0.46 ± 0.131 0.220 ± 0.062
Carbón vítreo / Pt 0.674 ± 0.215 0.321 ± 0.102
Platino (1*10^(-3)) 3.329 ± 0.789 1.585 ± 0.376
14
Con los datos en la tabla 3, se realiza un ANOVA, diseño al azar donde el factor
de estudio es el material transductor y la variable dependiente es el área
electroactiva del electrodo. Según el análisis de varianza se tiene una diferencia
de 95% correspondiente a los materiales transductores; por lo que las medias de
uno o más materiales es o son diferentes.
Para la comprobación de que material es el que se diferencia, se realiza la prueba

Fisher que indica que existe diferencia significativa entre los materiales: pastas de
carbono platinizadas y los microelectrodos de disco de platino.
El tamaño de las áreas no aporta ninguna información nueva ya que existen

electrodos de una amplísima gama de tamaños, en esta investigación se
requieren microelectrodos ya que se pretende diseñar biosensores para
monitoreo de ATP en matrices biológicas y el hecho de miniaturizar los
electrodos puede contribuir a tener tiempos de respuesta más bajos así como
corrientes capacitivas bajas.
5.3. Demostración del potencial de detección de H2O2:

Se tomó voltamperometrías cíclicas para diferentes concentraciones de H2O2 para
determinar la influencia del material transductor en la posición del pico de
oxidación.
Tabla 4. Potenciales de oxidación de H2O2 para varios metales transductores.
Material Potencial
Platino 1.015 ± 0.015
Grafito / Pt 0.990 ± 0.030
Carbón vítreo / Pt 0.969 ± 0.039
Con los datos presentes en la tabla 4, se realiza un análisis de varianza donde el

factor de estudio es el material de transducción y la variable dependiente es el
potencial de detección del H2O2. Según los resultados, no existe diferencia
significativa al 95% en los potenciales de detección de H2O2, para comprobarlo
se realiza la prueba Fisher
15
Figura 5. Resultados de sensibilidades de los electrodos en la

detención de H2O2
Con estos resultados se toma la decisión de que no se continuará con las pastas de
carbono en la siguiente fase de la construcción de biosensores de ATP,
quedánsonos solamente con los microelectrodos de disco de platino como la mejor
opción en la construcción de biosensores.
5.4. Estudio de sensibilidades y límites de detección para H2O2:

Se construyen curvas de calibración, aplicando la ecuación de Corttrell (detallada
en pág. 7 del presente informe), con el fin de determinar sensibilidades y límites
de detección. Para la construcción del gráfico, se resta la corriente media del
background a cada medida de corriente. Se normalizan o aproximan a una recta
que mejor se ajuste a los datos; también se construyeron gráficas de densidad de
corriente vs. Concentración de analito.
Figura 6. Respuestas electroquímicas a H2O2
16
Nótese que se tienen las corrientes corregidas restando el background para

distintas concentraciones de H2O2. En A) microelectrodos de platino B) pasta de
grafito y telenizada C) Pasta de carbón vítreo platinizada. A la izquierda se tienen
correspondidas a curvas de calibración vs. Corriente. En la derecha, se tienen
densidad de corriente vs. Concentración
Se ve que los electrodos de pasta de carbono no cumplen con los criterios de

linealidad, descartado porque indica medidas muy dispersas.
Según el análisis de varianza existe diferencia significativa al 95%, lo que indica

que las medias de uno o más materiales son diferentes. Para verificar lo dicho
anteriormente se realizó 3 con prueba Fisher, mostrando que todas las
sensibilidades son distintas unas de otras con respecto a material transductor.
5.5. Evaluación de la enzima GOx mediante curvas de calibración de glucosa.
Se sabe por el punto 7.3 que los electorodos de pasta de carbono no tuvieron
buenas características en linealidad; esta fase de la investigación se basa en los
microelectrodos de disco de platino, que luego fueron cubiertas por una membrana
bioactiva para cuantificar la velocidad de esta.
17
Figura 7. Respuesta electroquímica a glucosa.
Se puede notar que en la figura anterior, la curva de calibración por 7 días

presenta una respuesta lineal aceptable; el valor de GOx casi no :o
18
Según el análisis de varianzas, no existen diferencias significativas. Para

comprobar, luego debo tomar la prueba de Fisher (LSD) puede perder por su
amplia sensibilidad.
5.6. Estudio de estabilidad a largo plazo del biosensor de ATP.
Estudio con respecto al tiempo, se construyen calibraciones durante 5 días; se
realiza a las curva de calibración e ATP y e la substracción background
Figura 8. Respuesta electroquímica a ATP
Se observa que se tiene un valor aceptable como regresión lineal durante los 5
días, la sensibilidad del biosensor decrece después del primer día y segundo; sin
embargo permanece casi invariable en los días siguientes.
19
Tabla 5. Sensibilidades y límites de biosensor de ATP durante varios días de

funcionamiento
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

Sensibilidad 12.45 ± 7.40 ± 0.55 4.33 ± 0.34 4.83 ± 0.34 4.67 ± 0.32
0.87
Límite de 0.86 ± 0.68 0.52 ± 0.19 1.00 ± 0.70 0.46 ± 0.18 1.59 ± 0.88
detección
Con los datos presentados anteriormente, se puede realizar un ANOVA en donde

el factor de estudio es el día de medición y la variable dependiente es
sensibilidad de los sensores. Los resultados y el análisis de varianzas indicaron
que existen diferencias significativas al 95% en los 5 días de calibraciones de
biosensor ATP. Para comprobar lo anteriormente mencionado, la prueba de
Fisher menciona que existen diferencias significativas correspondiendo a las
sensibilidades.
20
Bibliografía
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21

Trabajo 2-Grupo10-Bioingeniría

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Universidad Nacional de Ingeniería

Facultad de Ingeniería Química y Textil

- Castillo Barzola Angie Lucerito 20172214C

- Terrones Fernandez Ersim Antony 20172648C

Profesor responsable: Ing. Neira Montoya Enrique

Fecha de entrega de la práctica: 25 / 06 / 2021

Periodo Académico 2021-I

Figura 1. Estructura de un biosensor. 6

Tabla 1. Variables de investigación. 9

Las membranas bioactivas de los biosensores de ATP se han convertido en sustratos de

Enzyme biosensor amperometric microelectrodes are currently attractive in monitoring

Sin embargo, de todas estas técnicas, solo biosensores amperométricos de tiempos de

Además de todas las ventajas antes mencionadas, son fáciles de maniobrar y se

Se han desarrollado muchos sensores ATP amperométricos, pero se conoce

También se encontró un biosensor comercial protegido contra interferencias como

También varía la estabilidad de los electrodos amperométricos que tienen

Se compone de tres partes:

Figura 1. Estructura de un biosensor.

El diseño y principio de funcionamiento del biosensor dependen de la

3.2.2. Transducción electroquímica

Otra aplicación indica que se debe dar la adsorción previa de monómeros

Tabla 1. Variables de investigación.

Variables Independientes Dependientes

4.3. Población y muestras de en estudio.

es secado por una noche recomendablemente. Luego este alambre

Figura 2. Microelectrodo de disco de platino.

Figura 3. Microelectrodo de pasta de carbono.

4.4.2. Estudios de estimación de áreas electronegativas y determinación del

conservar la concentración de la glucosa esto debido a que la detección de

Tabla 2. Corrientes background y ruido para varios metales preparados para

Método Petri Mortero

Carbón vítreo 37.14 ± 0.05 9.75 ± 0.19

Con los datos de la Tabla 2, se analiza en un diseño de varianza para un diseño

Según el análisis de varianza, no hay diferencias significativas al 95% en alguna

Figura 4. Resultado de comparaciones de

En la figura 4 se representa uqe un mejor método para preparar pastas de carbono

5.2. Áreas electroactivas

Tabla 3. Cargas eléctricas y áreas electroactivas para varios materiales de

Material Carga eléctrica Área (mm2)

Para la comprobación de que material es el que se diferencia, se realiza la prueba

El tamaño de las áreas no aporta ninguna información nueva ya que existen

5.3. Demostración del potencial de detección de H2O2:

Con los datos presentes en la tabla 4, se realiza un análisis de varianza donde el

Figura 5. Resultados de sensibilidades de los electrodos en la

5.4. Estudio de sensibilidades y límites de detección para H2O2:

Figura 6. Respuestas electroquímicas a H2O2

Nótese que se tienen las corrientes corregidas restando el background para

Se ve que los electrodos de pasta de carbono no cumplen con los criterios de

Según el análisis de varianza existe diferencia significativa al 95%, lo que indica

5.5. Evaluación de la enzima GOx mediante curvas de calibración de glucosa.

Figura 7. Respuesta electroquímica a glucosa.

Se puede notar que en la figura anterior, la curva de calibración por 7 días

Según el análisis de varianzas, no existen diferencias significativas. Para

Tabla 5. Sensibilidades y límites de biosensor de ATP durante varios días de

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

Con los datos presentados anteriormente, se puede realizar un ANOVA en donde

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