Micro Biolog I A

Microbiología
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
ESPE
2008
Manual De Laboratorio de Microbiología I . ESPE-2008
MICROBIOLOGÍA l
Instructora:
Nadia Vieira
nadiavieirac@hotmail.com
EMAIL DEL CURSO:
cuarto A cuartoaespe@yahoo.com
cuarto B cuartobespe@yahoo.com
cuarto C cuartocespe@yahoo.com
CLAVE: micro2008
ORGANIZACIÓN DE LOS TEMAS DEL CURSO
Revisar el programa analítico de la asignatura proporcionado por las instructora. En

este programa están descritos los capítulos de libros y los artículos científicos a
revisar cada semana.
EVALUACIÓN:
Cada unidad se evaluará sobre 20 puntos de la siguiente manera:
4 puntos examen de teoría
4 puntos examen de laboratorio
4 puntos informes de laboratorio
4 puntos lecciones y trabajos
4 puntos participación en clase y exposiciones
ASISTENCIA:
En la Escuela Politécnica del Ejercito, la asistencia a las clases es obligatoria por lo
que se tomará lista después de 10 minutos de la hora de inicio de la clase, después
de lo cual no se permitirá el ingreso, POR FAVOR NO INSISTA!
LOS INFORMES, DEBERES, TRABAJOS Y LECCIONES.
Los informes, deberes y trabajos pueden ser presentados a mano o en computador.

NO DESPERDICIAR LAS HOJAS EN CARÁTULAS.
Recuerde, la profesora no pedirá los informes, deberes o trabajos NUNCA, es SU

responsabilidad entregarlos al INICIO (durante los 10 primeros minutos) de la clase.
NO se recibirán informes, deberes o trabajos atrasados, fuera de los 10 minutos, por
ningún motivo.
Si no va a asistir a la clase el informe, deber o trabajo puede ser enviado por correo
electrónico a la instructora hasta las 4PM del día anterior, si la instructora no le
responde el correo, usted debe asegurarse de que éste llegó correctamente. Los
Nadia Vieira y Alma Koch 2

trabajos también pueden ser enviado con alguno de sus compañeros de clase.
Se tomará una lección semanal escrita corta al inicio de la clase, se evaluarán los
contenidos revisados la semana anterior, artículos científicos enviados para revisión,
trabajos de consulta, etc.
Si usted falta a la lección deberá presentar justificación avalada por la Coordinadora

de la Carrera, para ser reevaluado.
¿CÓMO SON LOS INFORMES EN LA CLASE DE MICROBIOLOGÍA I?
Los informes siempre serán entregados el primer día de la semana posterior al

laboratorio.
Los informes deben contener:
TÍTULO DE LA PRÁCTICA (0,1 PTO)

Debe ser preciso pero informativo.
INTRODUCCIÓN (0,5 PTO)

Es una revisión bibliográfica o de fundamentos teóricos. Usted debe escribir al
menos 3 párrafos bien estructurados de lo más general o lo más específico,
recuerde: cada párrafo debe tener su cita bibliográfica. El último párrafo debe
contener una hipótesis, que es una posible RESPUESTA que se va a evaluar
durante los experimentos del laboratorio.
MATERIALES Y MÉTODOS (0,5PTO)

Es una descripción del procedimiento en el que se nombran los materiales utilizados.
Utilice subtítulos si es necesario. Debe ser escrito en pasado y de forma impersonal,
por ejemplo:
Se incubó la muestra en la incubadora a 37 grados C durante 24 horas.
RESULTADO (0,7 PTO)

Son todas las OBSERVACIONES, GRAFICOS, FOTOGRAFIAS, que serán
obtenidos durante la clase, usted debe utilizar hojas de papel bond y realizarlos
durante la práctica de laboratorio, por lo tanto nunca pueden ser presentados en
computador. Los resultados obtenidos en clase deben llevar la firma de la profesora.
Utilice los mismos subtítulos que utilizó para describir los materiales y métodos.
DISCUSIÓN (1,5 PTO)

Es la parte más importante del informe, usted debe analizar sus resultados y
compararlos con información bibliográfica. Siempre debe tener citas bibliográficas.
Evite el “blah blah”, fundamente sus palabras con datos bibliográficos
CONCLUSIONES (0,4 PTO)

En base a sus resultados y su discusión, concluya. Este es su aporte personal por lo

que no tiene citas bibliográficas. Evite el “blah blah”.
BIBLIOGRAFÍA (0,3 PTO)

Se escriben los datos de donde se obtuvo la información. Utilice textos con autor de
responsabilidad. Está prohibido usar enciclopedias como bibliografía.
El no seguir el formato especificado tiene una penalización de 1 pto

Las faltas de ortografía serán penalizadas con 1 pto
Los nombres científicos mal escritos serán penalizados con 1pto.
CUESTIONARIO
Contestar a las preguntas de cada práctica, si existen.
¿CÓMO HACER UNA CITA BIBLIOGRÁFICA EN LA INTRODUCCIÓN Ó EN LA

DISCUSIÓN?
En una cita, usted informa el lugar de donde obtuvo la información, por ejemplo:
Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) was first shown to cause diarrheal disease in
otherwise healthy volunteers in 1971 by DuPont et al.
Según Correa (2002), los indices de infección nosocomiales en el Hospital Eugenio

Espejo han disminuído en un 37%.
Existen muchas razones prácticas para predecir si un compuesto particular es

biodegradado en productos tóxicos (Martin, 1998).
¿CÓMO ESCRIBIR LA BIBLIOGRAFÍA?
De revista científica:
Akinyemi KO, Oyefolu AO, Opere B, Otunba-Payne VA and Oworu AO. 1998.
Escherichia coli in patients with acute gastroenteritis in Lagos, Nigeria.
Nature.75:512-5
De libro:
Bowles, A., Truper, H., Dworking, A. 1999. The prokaryotes. 2da edición. McGraw-
Hill. New Cork. USA.
Del Internet:
Partridge, J. 1997. Plant Pathology Concepts and Principles. (en línea:
www.unl.edu/ianr/pro; consultado el 23 de agosto del 2007)
PARTICIPACIÓN EN CLASE
Durante esta clase se espera una actuación ética de su parte, cualquier plagio será
calificado con cero en el trabajo sin derecho a reconsideración y será enviado un
informe al director/directora de la carrera.

Como plagio se entiende a:

Duplicar la información de forma textual del Internet o libros, sin el uso de comillas o
sin la cita bibliográfica.
Dos trabajos idénticos en su totalidad ó en alguna parte del mismo.
Copia ó intento de copia durante exámenes o pruebas.
Su actuación durante la clase es evaluada, se toma en cuenta el cumplimiento de las

normas de seguridad y de trabajo dentro de laboratorio, la participacióndurante las
discusiones y exposiciones, EL USO DEL CELULAR ESTÁ PROHIBIDO, NO
PUEDE INGRESAR CON CELULAR AL LABORATORIO!
Si la profesora considera que usted no cumple con las normas de bioseguridad, le
pedirá que abandone el laboratorio.
Recuerde que estamos trabajando con microorganismos que podrían atentar a su

salud, a la de sus compañeros, familiares y todas las personas que estén en
contacto con material contaminado, por lo cual usted tiene la obligación de
REPORTAR a la instructora cualquier accidente que observe ó lo que usted
considere necesario, siempre se mantendrá la confidencialidad. Quedarse callado es
ser cómplice y se considerará como co-responsable del hecho.
Espero esta clase permita que ustedes exploten sus capacidades analíticas, de
redacción, ir más allá de la información proporcionada por la instructora, lo que
aprendan en la clase depende de su interés, su autoeducación, su curiosidad y su
trabajo.
INVENTARIO Y LIMPIEZA DEL LABORATORIO
La instructora junto con los estudiantes organizará los grupos de desinfección del
laboratorio y esterilización y lavado de material. Todo esto coordinado con la
Asistente de Laboratorio Jésica Maisincho.
El inventario de los equipos y materiales es responsabilidad de los estudiantes. Se

debe verificar la presencia de cada uno de los materiales y equipos al inicio y
finalización del semestre. El inventario es coordinado entre los estudiantes y la
Asistente de Laboratorio. Hay que recordad que al finalizar el semestre se debe
reponer el material y equipo roto, perdido o dañado. Es por esto que es muy
importante que cada estudiante asuma su responsabilidad si daña, rompe o pierde
material o equipo, caso contrario todos los estudiantes que utilizan las instalaciones
deberán reponerlos.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA I
Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo especiales

que poseen agentes infecciosos de riesgo para las personas. Por lo
tanto es importante trabajar de una forma adecuada utilizando métodos
seguros para manejar los materiales infecciosos y reducir o eliminar la
exposición de las personas a estos agentes.
Uno de los principales objetivos de esta clase es enseñar a manipular

los microorganismos adecuadamente. Aunque los microorganismos con
los que se trabaje no sean considerados patógenos, todos los cultivos
de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución.
Existen una serie de normas de bioseguridad que permiten cumplir con

este objetivo, las cuales se detallan a continuación.
N O R MAS DE B I O S EG U R ID AD Y BU E N AS P R ÁC TI C AS
DE T R ABAJ O P AR A E L L ABO R AT O RI O DE
M IC R O BI OL O GÍ A
1. El acceso al laboratorio es restringido a las personas que están

tomando la clase, asistentes de laboratorio e instructores.
2. Trabaje con CALMA y CONCENTRACIÓN.
3. Es obligatorio el uso de bata larga de algodón, destinada

EXCLUSIVAMENTE para el Laboratorio De Microbiología. (Solo podrá
retirarse para su aseo en una bolsa de plástico. Se recomienda lavar
individualmente con jabón). No podrá usarse en otras áreas de la
facultad. Rotúlelo claramente con su nombre y especifique
MICROBIOLOGÍA en el mandil de este laboratorio.
4. Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos

escrupulosamente con agua y jabón, después de manejar organismos
viables, después de removerse los guantes y ANTES DE SALIR DEL
LABORATORIO.
5. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al

finalizar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de
trabajo.

6. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio.

Los microorganismos deben manejarse cerca de la llama del mechero o
dentro de la cámara de bioseguridad
7. Esta prohibido comer, beber, fumar, maquillarse ó usar lentes de

contacto. Cuando se manipulen microorganismos evite hablar sin
necesidad, no llevarse las manos a la nariz, boca, ojos etc.
8. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos

peligrosos biológico infecciosos que se generen en la realización de la
práctica.
9. No pipetear con la boca. En caso que el profesor lo indique se deberá

usar guantes y/o mascarilla, o propipetas.
10. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de microbiología es

la generación de aerosoles con microorganismos, se debe evitar su
producción y manejarse siempre alrededor de la llama del mechero o en
una cabina de seguridad
11. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la

exposición a esta radiación es peligrosa y se deben proteger los ojos y
evitar la sobre exposición en la piel.
12. En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el

Laboratorio notificar inmediatamente al instructor o al personal técnico
para tomar las medidas higiénicas y de seguridad apropiadas, así como
su registro.
13. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este

será desechado.
14. Coloque sus pertenencias personales en los canceles fuera del

laboratorio. Hágalo en todas las clases. No las deje amontonadas sobre
la mesa de trabajo ya que puede contaminarse o provocar un accidente
15. No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente

prohibido retirar del Laboratorio cultivos o cepas a menos que así lo
indique el profesor. Al finalizar la práctica entregar el material empleado
debidamente separado.
17. Deje las llaves de gas y de agua cerradas y los aparatos

eléctricos apagados antes de abandonar el laboratorio.

18. Si sufre una cortadura o quemazón, inmediatamente vaya a la llave

de agua fría y exponga la zona de lesión. Lávela con jabón y póngase
desinfectante.
19. Si tiene el cabello largo, manténgalo recogido, las uñas deben estar
cortas y no se deben utilizar pulseras, anillos, bufandas, zapatos
descubiertos, faldas o pantalones cortos ni zapatos de tacón.
20. Limpie el microscopio antes y después de utilizarlo.
21. Limpie la balanza después de utilizarla.
22. Todo el material que usted utiliza debe ser lavado, secado y
guardado.
23. No desperdiciar insumos ni reactivos.

EMERGENCIAS BI OLÓGICAS
CONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Defina y aisle el área contaminada

Alerte a sus compañeros y a su instructor
Remueva los vidrios o deshechos utilizando siempre pinzas, palas,
escoba, NUNCA SUS MANOS.
Aplique papel absorvente necesario
Aplique un desinfectante por 30 minutos: puede utilizarce cloro, savlón u
otro, evitar el uso de alcohol por su naturaleza de evaporación el cual
disminuye el tiempo de contacto.
Remover los papeles y colocarlos en las fundas rojas de basura.
CONTAMINACIÓN PERSONAL
Limpie el área expuesta con abundante agua y jabón.

Avise a su instructor.
ELIMINACIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO
Todos los medios de cultivo deben ser autoclavados antes de

eliminarlos.
Los agares autoclavados deben ser desechados en una funda roja,
nunca eliminados en el lavabo, los caldos autoclavados pueden ser
eliminados en el lavabo.
Las puntas de micropipeta utilizadas con medios con microorganismos,
deben ser desinfectadas en un recipiente con una solución cloro-agua
1:1 durante 30 minutos antes de ser desechados en las fundas rojas,
NUNCA SE AUTOCLAVA NADA CON CLORO PORQUE SE
PRODUCEN GASES TÓXICOS.
Los papeles que se utilizan para limpiar las mesas pueden eliminarse
en el recipiente de basura común con funda negra.
TRAIGA ESTA LISTA A TODOS SUS LABORATORIOS PARA QUE

RECUERDE EL MODO ADECUADO DE PROCEDER!!

PRÁCTICA NO. 1: LA UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS
OBJETIVO:
Demostrar la facilidad del contagio de bacterias en el trabajo de laboratorio.
Comprobar la ubicuidad de los microorganismos ambientales, y discutir el significado
de la presencia de microorganismos en determinados ambientes.
INTRODUCCIÓN:
Debido a su enorme diversidad metabólica los microorganismos pueden colonizar
prácticamente cualquier hábitat, es decir los encontramos en todas partes. Son parte
de la flora normal de humanos y animales, son parásitos de muchos organismos y
abundan en el suelo y sistemas de agua.
Es muy importante que usted interiorice los procedimientos básicos del laboratorio
para evitar dispersar microorganismos indeseables que pudieran causar problemas a
su salud y la del resto de personas que trabajan en el edificio.
En esta práctica se va a demostrar qué tan fácil resulta la transmisión de bacterias a
partir de un objeto contaminado que a simple vista no se lo identifica como tal.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Chocolate en barra (cada grupo debe traerlo)
Un cultivo de B. subtilis en caldo de 6 h
Cajas de agar nutriente estériles
jabón en barra
lápiz
hispos estériles
tubos con caldos de cultivos estériles
EJERCICIO NO. 1
1. Encender el mechero y marcar 7 cajas con el número 1 y literales, a, b……
2. Una persona del grupo debe coger el chocolate que se le proporcionará.
3. Con la mano con que cogió el chocolate, tocar la superficie de la primera caja de
agar e, inmediatamente, estrechar la mano de la segunda persona del grupo.
4. La segunda persona debe tocar la superficie de la segunda caja de agar e,
inmediatamente, estrechar la mano de la tercera persona del grupo.
5. Repetir el procedimiento hasta completar las cajas.
6. Lavarse las manos muy bien con agua y jabón. Al final ponerse desinfectante.
7. Incubar a 37 grados centígrados las cajas por 24 horas
Nadia Vieira y Alma Koch

10
EJERCICIO NO. 2
1. Encender el mechero y marcar 7 cajas con el número 2 y literales, a, b….
2. Una persona del grupo debe coger el chocolate.
3. Con la mano con que cogió el chocolate, tocar la superficie de la primera caja de
agar e, inmediatamente, estrechar la mano de la segunda persona del grupo.
4. La segunda persona debe tocar la superficie de la segunda caja de agar e,
inmediatamente, coger la toalla de la tercera persona del grupo.
5. La tercera persona del grupo debe tocar la toalla y, de igual forma, tocar la
superficie de la caja correspondiente y coger el jabón de la cuarta persona con la
misma mano.
6. La cuarta persona debe coger el jabón, tocar la superficie de la caja 4 y con la
misma mano, tocar la mesa de trabajo en el 1ugar señalado.
7. La quinta persona debe tocar el 1ugar contaminado de la mesa, tocar la superficie
de la caja 5 y coger el lápiz de la sexta persona.
8. La sexta persona debe coger el lápiz, tocar la superficie de la caja 6 y tocar, el
mandil de la séptima persona.
9. La séptima persona debe tocar el mandil y sembrar la caja 7.
10. Lavarse las manos muy bien con agua y jabón para luego ponerse desinfectante.
11. Incubar las cajas a 37 grados centígrados por 24 horas
EJERCICIO NO.3
1. Por grupo, exponer una caja Petri con agar nutritivo siguiendo una de las
siguientes instrucciones:
1.-al aire del laboratorio por 30 minutos
2.- al aire de los exteriores del laboratorio por 30 minutos
3.- soplar sobre el agar por 5 minutos
4.- presionar los labios sobre el agar
5.- presionar monedas sobre el agar
6.- cualquier otro método
2. Incubar las cajas a 37 grados centígrados por 24 horas
RESULTADOS:
Ejercicio 1 y 2 Dibuje lo observado
Ejercicio 3 Tabule los resultados de cada grupo.
DISCUSIÓN:
Haga un análisis comparativo con los demás grupos del curso.

11
PREGUNTAS PARA RESPONDER EN LA CLASE

1. ¿Por qué es importante tener cuidado en el trabajo de laboratorio?
2. Escriba 5 medidas de seguridad en un Laboratorio de Microbiología
3. Utilizando el número de colonias como indicador, ¿cuál es el que presenta mayor
contaminación? ¿Cuál es la explicación posible?
4. ¿Existió alguna caja sin microorganismos? ¿Usted cree que el lugar en el que se
tomó esa muestra es estéril? ¿Por qué?
PREGUNTAS PARA RESPONDER EN EL INFORME
1. Hacer un cuadro de los tamaños relativos de bacterias, hongos, protozoos y virus.

2. Citar tres enfermedades contagiosas: medio de contagio, agente causal, daño
producido en el ser humano.
3. Citar 4 bacterias simbiontes con el ser humano y su función

12
PRÁCTICA NO. 2: TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
OBJETIVOS:
1. Aprender la utilización de material fundamental.
2. Realizar frotis bacterianos y tinciones simples.
3. Mediante tinciones simples, observar bacterias al microscopio y estudiar su
morfología y agrupación.
4. Diferenciar grupos bacterianos de acuerdo a sus reacciones de tinción.
5. Aprender técnicas básicas y fundamentales en la preparación de placas.
TINCIONES
La morfología bacteriana puede ser estudiada de tres formas: observando
directamente organismos vivos sin tinción, viendo células bacterianas muertas
teñidas y contrastando el medio en donde están las células para resaltar las
bacterias.
Las bacterias y la mayoría de microorganismos son casi transparentes, tienen
tamaño pequeño y no presentan suficiente contraste con el medio que les rodea
como para ser perfectamente visibles y diferenciadas.
Mediante la tinción y contraste se hace fácil la observación, diferenciación y
estudio de las células. Los colorantes que se usan para este efecto son derivados de
las anilinas. Actualmente se utilizan técnicas simples, diferenciales y tinciones
negativas.
En la tinción negativa se puede estudiar la morfología de las células
bacterianas. La nigrosina o la tinta china no penetran en la célula pero el área que
rodea a las células se opaca y obscurece por lo que las células se observan como
objetos transparentes en un fondo negro.
Las bacterias difieren unas de otras química y físicamente, lo que hace que
reaccionen de forma distinta al mismo procedimiento de tinción. De esta manera se
pueden distinguir tipos bacterianos y tipos de estructuras celulares.
La tinción diferencial es un proceso que implica varios tratamientos y varios
colorantes aplicados en secuencia.
TINCIÓN GRAM
Es la tinción diferencial bacteriológica más usada. Se llama así en honor a su
inventor, el Dr. Cristian Gram (1884).
La Tinción Gram se compone de cuatro reactivos diferentes y se requiere algo
de práctica para que funcione correctamente. El violeta de genciana es,
generalmente, el colorante primario de la serie Gram. El propósito de este primer
paso es impartir color a todos las bacterias en el frotis. El segundo reactivo de la
serie es una solución diluida de yodo (yodo Gram), que actúa como mordente (una
sustancia que aumenta o refuerza la unión entre el colorante y su sustrato). El tercer
reactivo se conoce como decolorante porque disuelve y arrastra fuera de algunas
células al colorante primario, se emp1ea una mezc1a de acetona y etano1 95% en

13
proporciones 30% y 70%, respectivamente. El cuarto reactivo es el colorante de

contraste, la safranina. Aquellos organismos que se destiñeron por la acción del
decolorante se tornaron invisibles, haciéndose necesario aplicar un colorante de
diferente color para poder observarlos. Así, se designa Gram negativo a cualquier
organismo que tome la coloración roja del colorante de contraste, es decir, de la
safranina. Los organismos Gram positivos han reaccionado completamente con el
violeta de genciana sin ser decolorados y, por lo tanto, no pueden ser teñidos por la
safranina, permaneciendo de un color azul o violeta.
La tinción Gram constituye el punto inicial del proceso de caracterización
bacteriana. La tinción Gram es una herramienta de gran valor taxonómico. Al
aplicarla, se divide a las bacterias en cuatro categorías bien definidas, tomando en
cuenta, también, la morfología: cocos Gram. positivos, cocos Gram. negativos,
bacilos Gram. positivos y bacilos Gram. negativos.
No se conoce a ciencia cierta cuál es el mecanismo que regula este
comportamiento diferencial. Una de las posibles explicaciones postula que la pared
celular de las células Gram positivas es más sensible a la deshidratación con
alcohol, el mismo que actúa cerrando los poros de la pared celular. En estas
condiciones, el complejo yodo-violeta de genciana no puede escapar hacia el
exterior de la célula resultando la retención del colorante primario. La pared celular
de organismos Gram negativos es más rica en lípidos que la de los Gram positivos y,
aparentemente, no cierra sus poros durante el tratamiento con alcohol, por lo cual el
decolorante arrastra todo el colorante primario. Por lo tanto, al aplicar la tinción Gram
a una mezcla de varios tipos de bacterias, algunos organismos aparecen azules y
otros rojos. Las especies que se tiñen de azul son Gram positivas y las que se tiñen
de rojo son Gram negativas. Es preciso añadir que la coloración Gram de muchas
especies es variable. Además, no todas las bacterias Gram positivas retienen el
colorante primario con la misma intensidad, por lo cual pueden aparecer desde
violeta intenso hasta celestes. También la edad de los cultivos determina los
resultados finales de esta tinción. Únicamente se obtienen resultados confiables
cuando se utilizan cultivos jóvenes de hasta 24 horas.
Es conveniente mencionar algunas observaciones relativas a los riesgos
posibles en la ejecución de Gram la decoloración es el paso critico de la tinción; si se
decolora en exceso se corre el riesgo de debilitar las paredes y que estas no
respondan como deben hacerlo. Por otro lado, si se decolora muy poco, incluso las
células Gram negativas retendrán el colorante primario y aparecerán Gram positivas.
También es importante hacer el frotis con una cantidad moderada de bacterias; si se
toma mucha muestra aparecerá una mancha oscura en donde no se visualizarán
células individuales.
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO

El éxito de la mayoría de procedimientos de tinción depende de la
preparación adecuada de un frotis. Para hacer un frotis es necesario dispersar una
pequeña cantidad de muestra sobre la superficie de un portaobjeto limpio, tratando
de disponer de toda el área. La capa delgada resultante se seca al aire. A
continuación se la fija a la llama. Este último procedimiento no solo mata a las
bacterias, sino que coagula las sustancias proteicas de las células, fijando así las
células al vidrio. La preparación queda, entonces, lista para la aplicación de la
tinción.

14
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:
EJERCICIO NO.1: FROTIS BACTERIANO

MATERIALES
Cultivo de 24 horas obtenidos en la práctica anterior
Cultivos de una bacteria conocida
Saliva
Portaobjetos
Asa bacteriológica
Mechero
Gradilla
Agua destilada
PROCEDIMIENTO:
1. Lave meticulosamente un portaobjeto con agua y jabón. Séquelo bien.
2. Marque en un extremo una señal que le indique la superficie sobre la que va a
trabajar. Identifique la placa con sus iniciales, las del microorganismo y la fecha.
3. Coloque una gota de agua pequeña en el centro del portaobjeto.
4. Encienda el mechero. La llama debe ser azul y de tamaño mediano.
5. Para proceder, observe la gráfica que se le proporcionará. Coja el asa como si
fuera un lápiz, colóquela perpendicularmente en la llama del mechero hasta que se
torne roja incandescente. Pase por la llama la parte del mango que está
inmediatamente por encima del alambre que forma el asa. Retire el asa del fuego
directo, manténgala al lado de la llama (para evitar que se vuelva a contaminar) y
espere a que se enfríe por unos segundos. ó. Inmediatamente después de esterilizar
el asa y haberla enfriado apropiadamente, coja el tubo de cultivo bacteriano en la
otra mano y retire el algodón con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa.
Flamee la boca del tubo por pocos segundos e inserte el asa estéril en el tubo, de
manera que no tope el vidrio. Tome la muestra deslizando el asa sobre la
"nata"(bacterias) cuidando de no dañar el medio de cultivo. La muestra debe ser muy
pequeña. (No es necesario que usted la vea sobre el asa, recuerde que son
microorganismos. Una muestra grande no permitirá buenos resultados y deberá
repetir el frotis y la tinción).
6. Retire el asa cargada sin que tope las paredes del tubo y deposite la muestra
sobre la gota de agua en el portaobjeto. Mézclela bien y extiéndala de manera que
se forme una película delgada sobre la superficie disponible. Esterilice nuevamente
el asa (esto le evitará contaminarse usted, su mesa de trabajo y sus preparaciones).
Este paso es fundamental en cualquier trabajo de este tipo.
Cuando se toma la muestra a partir de un cultivo liquido, NO es necesario poner la
gota de agua en el portaobjeto. Se agita el cultivo sin que el medio tope el algodón,
se toma la muestra directamente con el asa y se extiende. Las bacterias ya están en
un medio líquido que permite la formación de la película sobre el portaobjeto.

15
7. Seque el frotis al aire tomando la placa con el pulgar y el índice en un extremo y

moviendo la mano horizontalmente. Debe quedar totalmente seca.
8. Fije la preparación pasando brevemente el portaobjeto (con la muestra hacia
arriba) cuatro o cinco veces por la llama. No debe calentarse demasiado.
9. Proceda a realizar la tinción.
EJERCICIO 2. TINCIÓN SIMPLE

MATERIALES:
Frotis preparados en el ejercicio anterior
Tintes
Mechero
Microscopio
Aceite de inmersión
Papel filtro
PROCEDIMIENTO:
1. Cubra completamente el frotis con uno de los colorantes y espere un minuto. Lave
suavemente con agua de la llave. No aplique presión ó de agua porque perdería las
células.
2. Seque con papel filtro presionando cuidadosamente sobre el portaobjeto. De otra
forma se perdería toda la muestra. Descarte el papel en el lugar apropiado.
3. Observe al microscopio. No se olvide de seguir el método de enfoque, es decir,
comience con el lente de menor aumento y, paulatinamente, llegue al lente de
inmersión. Busque un área de la placa en donde vea células individuales. Detalle
forma, tamaño y agrupación.
RESULTADOS:
Dibujar detalladamente las bacterias observadas en el lente de inmersión. Incluya el
nombre binomial completo de las bacterias conocidas, la técnica usada, escala o
aumento. Describa la morfología y agrupación.
EJERCICIO NO.3 TINCION NEGATIVA

MATERIALES
Cultivos conocidos de bacterias
solución de nigrosina o tinta china
Mechero

16
PROCEDIMIENTO:
1. Depositar en el centro del porta una gota de agua destilada y resuspender el
microorganismo. NO REALIZAR EXTENSIÓN
2. En un extremo del porta se deposita una gota de solución de nigrosina o de
tinta china.
3. Con otro portaobjetos se forma un ángulo de 30 grados con el primero,
tocando la gota de nigrosina y mediante un movimiento extensivo se realiza
un frotis.
4. Se deja secar al aire la preparación o con calor suave. En esta técnica NO se
fija la preparación y tampoco se elimina el colorante.
5. Observar al microscopio
RESULTADOS
Dibujar lo observado.
EJERCICIO NO4. TINCIÓN DIFERENCIAL: TINCIÓN GRAM

MATERIALES:
Cultivo B. subtilis y E. coli en agar nutriente inclinado
Mezcla de las dos bacterias anteriores Set de tinción Gram
Portaobjetos
Asa bacterio1ógica
Mechero
Gradilla
Agua destilada Papel filtro Microscopio
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis de cada cultivo.
2. Cuando estén listos, tiña como sigue:
a) Cubra completamente el frotis con violeta de genciana y espere 1 minuto. No deje
que se seque ni ponga muy poco colorante. Lave cuidadosamente con agua
corriente.
b) Cubra el frotis con yodo Gram por 1 minuto. Lave cuidadosamente con agua
corriente.
c) Decolore gota a gota con alcohol acetona hasta que salga transparente.
Aproximadamente use 10 gotas. Este proceso debe cubrir todo el frotis, de otra
manera quedarían espacios sin decolorar y producirían resultados falsos. Lave con
agua cuidadosamente.
d) Cubra con safranina por 1 minuto. Lave cuidadosamente con agua corriente.
Seque por presión con un pedazo de papel filtro.

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e) Observe al microscopio con aceite de inmersión. Localice áreas en donde las

células estén separadas. Las bacterias Gram positivas aparecerán azules o violetas
y las Gram negativas rojas, rosadas o naranjas.
RESULTADOS:
1. Grafique sus observaciones.
2. Señale qué reacción presentan y especifique claramente el nombre de cada
organismo.
3. Señale la morfología de cada uno.
PREGUNTAS:
1. Nombre varias estructuras bacterianas que no puedan ser vistas con técnicas de
tinción simple.
2. Enumere los pasos de la preparación del frotis bacteriano que evitan la
contaminación del cultivo, de la muestra y de la persona que lo realiza.
3. ¿Qué pasaría si no se fijan las bacterias al portaobjetos antes de ser teñidas?
4. Explique los fundamentos de la tinción simple.
5. Describa una explicación, diferente a la que se menciona aquí, que explique la
respuesta de las bacterias a la tinción Gram.
6. Elabore un cuadro en donde se tomen en cuenta los cuatro pasos de la tinción, el
color de la célula en cada paso y si corresponde a Gram positiva o a Gram negativa.
7. Haga una lista de diez bacterias Gram. positivas y diez bacterias Gram negativas.
Señale el papel que desempeña cada una en relación al ser humano.
8. ¿Por qué la edad del cultivo afecta a la tinción Gram?

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PRÁCTICA NO. 3 TINCIÓN DE ESPORAS Y CÁPSULAS
OBJETIVOS:
1. Observar las formas y tamaños de las endosporas en varias especies
bacterianas.
2. Comparar la distinta disposición de las endosporas dentro de la célula
vegetativa
3. Entender el fundamento de las tinciones negativas.
4. Observar la morfología de las cápsulas.
INTRODUCCIÓN
En las tinciones específicas se pone de manifiesto estructuras específicas de los

microorganismos como por ejemplo, el flagelo, nucleoide, endosporas, entre otros.
Cuando las condiciones ambientales son desfavorables algunos géneros

bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, son capaces de producir
en su interior formas de resistencias denominadas endosporas. Cada célula
vegetativa forma en su interioir una única endospora. Las endosporas son
extremadamente resistentes a numerosos factores físicos y químicos, y además
pueden permanecer viables durante largos períodos de tiempo.
Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables, la endospora germina

generando una única célula vegetativa. Las endosporas poseen una pared celular
especialmente consistente rodeada de una serie de capas hidrofóbicas que hacen
de la endospora una estructura de difícil tinción.
En las tinciones negativas, los colorantes no fijan ni penetran a las células, como
consecuencia se ven a las bacterias en negativo, es decir sin teñir, contrastando con
el fondo que sí parece coloreado.
Algunas especies bacterianas están rodeadas de una capa gruesa denominada

cápsula constituida por polisacáridos excretados por la propia bacteria. Las cápsulas
son responsables de la resistencia a la fagocitosis, asimismo, proporcionan a la
bacteria la capacidad de adhesión a superficies y resistencia a la desecación. La
tinción de cápsulas no se realiza por métodos ordinarios, si el frotis es calentado
antes de una tinción previa, la cápsula puede ser destruida y no ser observada, pero
si no se fijan las células a la placa, éstas serán desprendidas en el lavado. Sin
embargo la cápsula puede ser observada por una combinación de tinciones
negativas y simples.
EJERCICIO NO1. TINCION DE ENDOSPORAS
MATERIALES
Cultivos de Bacillus sp.
Verde de malaquita 5%
Safranina 0.5%

19
Pinzas de madera (cada grupo debe traer)

Mechero
Microscopio
Papel filtro
PROCEDIMIENTO
1. Preparar frotis bacterianos.
2. Colocar un fragmento de papel filtro sobre la muestra del portaobjetos y
aplicar el colorante verde malaquita sobre el portaobjetos hasta
impregnar bien el papel (el papel impide que el colorante salpique).
Tomar el portaobjetos con la pinza y mediante pases cortos sobre el
mechero Bunsen calentar la preparación durante 5 minutos sin permitir
que hierva la muestra. Añadir más colorante si este se evapora, la
muestra no debe hervir ni secarse.
3. Retirar el papel filtro y lavar la preparación con abundante agua para
eliminar el exceso de colorante.
4. Teñir con safranina durante un minuto.
5. Lacar con abundante agua el exceso de colorante.
6. Secar la preparación entre dos papeles de filtro con cuidado de no frotar.
7. Observar al microscopio.
RESULTADOS
Dibujar lo observado
EJERCICIO NO2. TINCIÓN DE CAPSULAS
MATERIALES
Caldo de cultivo inoculado con Klebsiella
Tintachina
Portaobjetos y cubreobjetos
Papel filtro
Microscopio
Safranina, cristal violeta
PROCEDIMIENTO
1. Limpiar bien los porta y cubreobjetos.
2. Tomar una gota de cada caldo proporcionado.
3. Colocar una gota de tinta china y mezclar bien.
4. Con otro cubreobjetos hacer una extensión de esta mezcla
5. Fijar y secar la muestra con el mechero
6. Teñir el frotis con safranina o cristal violeta por un minuto y lavarlo.
7. Dejar secar al ambiente, no aplicar calor
8. Absorver el exceso con papel filtro con cuidado de no frotar
9. Examinar al microscopio, trabajar con el diafragma del condensador casi
cerrado para aumentar el contraste.
RESULTADO
Dibujar lo observado

20
CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se apreciarían tanto la célula vegetativa como la endospora si

únicamente las visualizáramos tras una tinción de Gram?
2. ¿A qué puede deberse que no vea endosporas en todas las células de
una preparación de bacterias formadoras de endosporas?
3. ¿Cuáles son las funciones de la cápsula bacteriana?
4. ¿Qué relación existe entre las cápsulas y la virulencia bacteriana?

21
PRÁCTICA NO. 4: DIVERSIDAD MICROBIANA.
OBJETIVOS:
1. Conocer la clasificación general de los seres vivos estudiados en Microbiología.
2. Observar al microscopio las características morfológicas y estructurales
representativas de bacterias, hongos y protozoos.
INTRODUCCIÓN:
La Microbiología estudia las entidades biológicas que son demasiado pequeñas para
poder ser observadas a simple vista. Estos son los virus y microorganismos como:
algas, bacterias, hongos y protozoos. La mayoría son unicelulares y cada uno se
caracteriza por estructura y fisiología propia.
EJERCICIO NO1. LEVADURAS

Las levaduras son hongos unicelulares. Pueden ser elipsoides, esféricas o cilíndricas
y son más grandes que el promedio de las bacterias. Debido a su tamaño, se
pueden observar varias estructuras al microscopio compuesto.
MATERIALES:
Cultivo fresco 6-12h de Saccharomyces cerevisiae en agar sabouraud inclinado
Solución de etanol 40%
Solución de hidróxido de potasio 0.1 M
Solución de azul de toluidina 0.1% en etanol 10%
Solución de etanol 10%
Portaobjetos
Asa bacteriológica
Mechero
Gradilla
Microscopio
Papel filtro
PROCEDIMIENTO:
1. Preparar dos frotis del cultivo de levadura.
Al primer frotis:
2. Bañe, por un minuto, el portaobjeto con etanol 40% y enjuague cuidadosamente
en la llave de agua.
3. Cubra el frotis con solución de KOH y déjelo reaccionar durante media hora. No
permita que se seque. Añada KOH cuando sea necesario.

22
4. Lave bien en la llave y luego aplique el azul de metileno por dos minutos.
Enjuague cuidadosamente.
5. Cubra la muestra con etanol 10%. Sacuda el exceso de alcohol y seque al aire.
Al segundo frotis:
Siga el mismo proceso a excepción del punto 3 (omitir baño con KOH).
6. Observe al microscopio. Compare ambas preparaciones. La segunda demuestra
que para poder diferenciar el núcleo es necesaria la hidrolización previa del
citoplasma (tratamiento con KOH).
Los núcleos se tiñen de azul oscuro y el citoplasma de celeste.
RESULTADOS:
Grafique sus observaciones. Diferencie núcleo y trate de detectar gémulas. Rotule
apropiadamente.
Es necesario que para este laboratorio usted se ayude con bibliografía. Venga
preparado.
EJERCICIO NO2. MOHOS

Los mohos son hongos relativamente grandes y es fácil estudiar su morfología. Se
desarrollan como cadenas largas de células (hifas) que dan lugar a una colonia
visible con aspecto algodonoso, llamada micelio. La observación de muchas de sus
estructuras puede ser hecha directamente al microscopio en un montaje húmedo.
Al preparar este montaje húmedo siempre se corre el riesgo de desorganizar
algunas de las delicadas estructuras. Para evitarlo, se preparan micro cultivos con el
objetivo de observar la colonia directamente, sin dañarla.
MATERIALES:
Cultivo de hongos selectos en medio Sabouraud
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asa bacteriológica
Gradilla
Mechero
Agua destilada
Microscopio
PROCEDIMIENTO:
1. Coloque una gota pequeña de agua destilada en un portaobjeto.
2. Con el asa, tome una muestra del cultivo y póngala cuidadosamente sobre la gota
de agua.

23
3. Coloque un cubreobjeto sobre la muestra.

4. Observe al microscopio: formas, tamaños, diferenciación.
Localice esporas, esporangios, hifas y estructuras celulares como: núcleo, tabiques,
gránulos y vacuolas.
RESULTADOS:
Grafique y rotule apropiadamente. Establezca tres diferencias entre mohos y
levaduras.
EJERCICIO NO.3 PROTOZOOS

Los protozoarios y las son eucariotes unicelulares que carecen de tejidos
especializados.
MATERIALES:
Agua de florero, de laguna, acequia, o cualquier fuente en la que se pueda encontrar
estos microorganismo (cada grupo debe traer al menos una muestra)
Microscopio
Información bibliográfica para identificar lo observado
PROCEDIMIENTO:
Coloque una gota de agua de la muestra en un portaobjetos y cúbrala con un
cubreobjetos. Observe en el microscopio.
RESULTADOS:
Grafique en detalle las muestras observadas. Rotule apropiadamente. Asegúrese de
conocer el nombre completo de cada organismo.
EJERCICIO NO.4 CIANOBACTERIAS

Las cianobacterias son bacterias que poseen clorofila y pueden realizar fotosíntesis
anoxigénica.
MATERIALES:
Muestras con cianobacterias
Microscopios
Información bibliográfica de cianobacterias

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PROCEDIMIENTO:
Prepare un montaje con las cianobacterias proporcionadas, cubra con el
cubreobjetos y observe.
RESULTADOS:
Grafique cada organismo, establezca su nombre completo y el aumento
correspondiente o la escala utilizada.
PREGUNTAS:
1. Establezca cinco diferencias entre hongos, bacterias y protozoos.
2. En base a consulta bibliográfica:
a) elabore esquemas de los organismos observados, con sus partes principales.
b) compárelos con los realizados en clase.
c) establezca qué función desempeña cada uno en la naturaleza y su relación con
los seres humanos.
3. Haga un esquema general de la clasificación de hongos.
4. Haga un esquema general de la clasificación de los protozoos.
5. Establezca el procedimiento para la realización de un frotis sanguíneo como
diagnóstico de enfermedades causadas por protozoos.
6. ¿Qué es la fotosíntesis anoxigénica?

25
PRÁCTICA NO.5 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS:
Conocer términos y conceptos de uso frecuente en microbiología relacionados
con el cultivo de las bacterias.
Describir los procedimientos rutinarios para la preparación de medios de
cultivo.
INTRODUCCIÓN
Como todas las otras formas vivientes, las bacterias requieren nutrientes y un
medio ambiente favorable para desarrollarse. Estas condiciones deben ser
proporcionadas en el laboratorio en donde se elaboran ambientes artificiales
semejantes a los naturales.
Gran parte de los estudios en microbiología depende de la capacidad de

cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto es posible si se
dispone de medios de cultivos adecuados.
Esencialmente, los medios de cultivos son de dos tipos: líquidos y sólidos. A los
medios líquidos se los usa generalmente en tubos de ensayo, se los conoce
como caldos de cultivo y están compuestos de agua, azúcares y proteínas,
principalmente.
Los medios sólidos son utilizados en caja Petri o tubos de ensayo en forma
inclinada y están formados por caldo de cultivo al cual se le añade agar, que es
la sustancia solidificante, obtenido a partir de algas marinas. El agar
químicamente está constituido por galactán que es un polímero de galactosa y
no puede ser desdoblado por las bacterias. Cambia a estado liquido a una
temperatura entre 92 y 100 grados centígrados y se solidifica entre 42 y 47
grados centígrados.
Con el fin de dar características determinadas y especificas a los medios de

cultivo, para el aislamiento e identificación de cada tipo bacteriano, se añaden
al agar diferentes sustancias como colorantes, sangre, carbohidratos,
aminoácidos, sales, antibióticos y muchas más. Los medios sólidos se usan
para el crecimiento masivo en tubo de cultivos puros y para el aislamiento de
colonias en caja Petri. Los medios líquidos permiten tener crecimiento rápido y
masivo.
Los medios semisólidos se usan para investigar la motilidad bacteriana y,

además, la condición anaerobia o aerobia de crecimiento.
Los medios de los cuales se conocen todos los componentes se denominan

medios sintéticos o medios definidos. Se emplean frecuentemente en
investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está metabolizando el
microorganismo.

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Los medios que contienen algunos ingredientes cuya composición química

exacta se desconoce se denominan medios complejos. Estos medios tienen
componentes como peptonas, extractos de carne, extracto de levadura que
proveen de fuente de carbono, energía, nitrógeno y factores de crecimiento.
Estos medios pueden satisfacer las necesidades nutricionales de diversos

microorganismos y se pueden utilizar cuando se desconocen las necesidades
nutricionales en particular.
Los medios que mantienen el crecimiento de muchos organismos se

denominan medios enriquecidos. Los medios selectivos favorecen el
crecimiento de microorganismos particulares inhibiendo a otros; mientras que
los medios diferenciales diferencian grupos distintos de bacterias e incuso
permiten una identificación tentativa por las características biológicas de los
microorganismos.
Los medios de cultivo deben suplir de ciertos requerimientos nutricionales

básicos para que las células puedan crecen, estos son la fuente de carbono,
energía, nitrógeno, minerales, vitaminas y factores de crecimiento.
MATERIALES:
Extracto de carne
Peptona
Agar
Extracto de levadura
Glucosa
Cajas Petri estériles
Erlenmeyeres
Agua destilada
Probeta 250 mI
pHmetro
Tubos de ensayo estériles con algodón
Mechero
Gradilla
Reverbero + agitador- magnético
Trípodes - mallas
Balanza
Medios Complejos
NaOH 1M
HCl 1M
PROCEDIMIENTO:
1. Ponga 250 ml de agua destilada en un erlenmeyer de 1000 ml.

Aparte pese lo siguiente:
2.5 g de peptona
1.5 g de extracto de carne

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2. Mezcle esto con el agua y caliente hasta que la peptona y el extracto se hayan
disuelto. Debe agitar continuamente y tener cuidado de que no se riegue.
3. Ajuste el volumen a 500 ml añadiendo agua destilada.
4. Divida la solución preparada en el punto 1 en 4 partes de 125 mI cada una en

cuatro erlenmeyeres de 500 mI y prosiga como sigue:
Erlenmeyer A) No haga nada más. Esto es CALDO NUTRITIVO.
B) Añada 1.875 g de agar-. Agite y lleve a ebullición, agitando constantemente,

hasta que se disuelva el agar. Esto es AGAR NUTRIENTE.
C) Añada 0.625 g de glucosa y agite hasta que se disuelva. Esto es CALDO DE

GLUCOSA.
D) Añada 1.25 g de extracto de levadura. Agite y lleve a ebullición. Esto es CALDO

NUTRIENTE ENRIQUECIDO CON EXTRACTO DE LEVADURA.
5. Mida el pH de cada medio. Ajústelo a pH 7.0 con 1M HCl o 1M NaOH.
6. Ponga los caldos (erlenmeyeres A, C y D) en tubos de ensayo estériles

ROTULADOS CORRECTAMENTE* con tapón de algodón. Coloque 3 ml en cada
uno.
7. Lleve erlenmeyer B y los tubos con los medios al autoclave para ser esterilizados.
8. Después de autoclavar, permita que el medio se entibie y dispénselo en las cajas

Petri, aproximadamente 20ml en cada tubo. Recuerde que las cajas Petri deben
estar previamente esterilizadas en la estufa y rotuladas. Tape y deje enfriar.
PREPARACIÓN DE MEDIOS COMPLEJOS
CAJA PETRI TUBO DE ENSAYO

Agar MacConkey Agar Citrato de Simmons
Agar Manitol Agar TSI
Agar XLD Caldo MRVP
Agar Hektoen Agar Bilis Esculina
Agar EMB Agar SIM
1.-Lea atentamente las instrucciones de preparación de los medios. Algunos medios

NO se autoclavan, ponga atención.
2.- Organice al curso de manera que cada grupo tenga al menos 2 cajas Petri y 2
tubos de cada uno de los medios que se preparen. Recuerde que para los cálculos
en el volumen de preparación, cada caja Petri lleva aproximadamente 20 ml de
medio y los tubos de ensayo llevan 3 ml.

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CONSULTA PARA EL SIGUIENTE LABORATORIO.
Elabore una tabla con información de cada uno de los medios complejos separados,
cuál es el uso más común, qué significan los cambios de color si se producen, qué
tipo de información nos dan. Esta tabla será de utilidad para prácticas posteriores.
*ROTULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO:

Los medios de cultivo deben ser claramente identificados e identificables.
Deben tener el nombre del medio, la fecha de preparación se debe detallar en
el recipiente, gradilla o funda que contenga a todo el lote de medios.

29
PRÁCTICA NO 6. TÉCNICAS ASÉPTICAS DE CULTIVO Y OBTENCIÓN DE

CULTIVOS AXÉNICOS
OBJETIVOS:
1. Familiarizarse con el manejo aséptico de microorganismos y con las

técnicas de aislamiento en placa de Petri
2. Obtener colonias aisladas utilizando uno o más métodos
INTRODUCCIÓN:
En vista de que las bacterias son microorganismos omnipresentes y en general, las

poblaciones microbianas se componen de muchas especies, se utilizan diversas
técnicas para separar unos microorganismos de otros y para obtenerlos en forma
pura.
El estudio organizado de cualquier organismo requiere que se examine una especie

a la vez; el método analítico no se puede aplicar cuando se tratan de varias especies
juntas.
Para obtener un cultivo puro, idealmente, se debería aislar una sola célula
bacteriana (individual) y luego transferirla a un medio estéril hasta que se divida,
generando muchas bacterias. Sólo en este caso se puede tener la certeza de que la
herencia de cada miembro de la población es idéntica, excepto por las mutantes
espontáneas.
A pesar de que es muy difícil aislar una sola célula, existen técnicas capaces de
aproximar este ideal, aunque no se puede tener certeza absoluta de haberlo logrado.
Sin duda, la técnica más comúnmente empleada para lograr un cultivo puro es el
método llamado "sembrado por estrías": se raya tanta superficie como sea posible,
partiendo de una muestra muy pequeña, con el propósito de que las bacterias, al
desprenderse del asa, caigan esparcidas individualmente. Si caen individualmente,
cada una se divide dando lugar a una colonia.
COLONIA: descendencia de una bacteria, que perfectamente aislada e individualizada

sobre una superficie de agar, puede ser transferida a otro medio de cultivo estéril y
así obtener un cultivo puro.
TÉCNICAS ASÉPTICAS PARA CULTIVAR MICROORGANISMOS
Las técnicas asépticas aseguran que no se introducen microorganismos

contaminantes en los medios de cultivo, siempre y cuando estos sean manipulados
de una forma correcta. Los procedimientos generales son:
1. DESINFECCIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO: el lugar de trabajo debe ser previamente

desinfectada para matar todos los microorganismos presentes, en este proceso se
destruyen células vegetativas y virus, pero no endoesporas.

30
2. AGUJAS Y ASAS: estos implementos deben ser esterilizados en la llama del

mechero hasta que se torne al rojo vivo, antes de la transferencia bacteriana.
3. FLAMEACIÓN DE LOS TUBOS E INOCULACIÓN: antes de insertar el asa en los tubos de

cultivo, se debe retirar la tapa y flamear la boca de los tubos. Después de la
inoculación en los tubos, se debe volver a flamear la boca de los mismos.
4.- FLAMEACIÓN DEL ASA O AGUJA: después de la inoculación se debe flamear el asa
ó aguja para destruir cualquier microorganismos restante. Después de eso, estos
implementos deben ser colocados en un receptáculo, nunca sobre el mesón de
trabajo.
5.- INOCULACIÓN EN LAS CAJAS PETRI: la tapa de las cajas es mantenida de forma
diagonal para proteger la superficie del agar de cualquier contaminación del aire. Al
final se tapa la caja.
6.- DESINFECCIÓN FINAL DEL ÁREA DE TRABAJO: cuando todo el trabajo ha sido
completado, el área debe ser desinfectada para eliminar cualquier microorganismo
que podría haberse depositado durante el proceso.
EJERCICIO NO. 1: SIEMBRAS Y TRANSFERENCIAS DE CULTIVOS BACTERIANOS A TUBOS

CON MEDIO DE CULTIVO
a) Sembrar desde un tubo con agar a un tubo con medio líquido
b) Sembrar desde un tubo con caldo a un tubo con medio sólido con superficie
inclinada
MATERIALES
Tubo con caldo de cultivo
Tubo con agar inclinado
Tubo con caldo inoculado con una bacteria
Tubo con agar inoculado con una bateria
PROCEDIMIENTO
1. Escoja el tubo con cultivo bacteriano que va a utilizar y los tubos con caldo y
agar inclinado, respectivamente.
2. Marque e identifique los tubos, debe poner su nombre, fecha y organismo
utilizado.
3. Esterilice el asa. En la otra mano debe tener tanto el cultivo de donde va a sacar
la muestra como el tubo a donde va a transferirla.
4. Destape el cultivo bacteriano usando el dedo meñique de la mano que sostiene
el asa. Destape el otro tubo con el dedo anular de la misma mano. El algodón debe
permanecer en el dedo hasta que tenga que volver a tapar el tubo; nunca deje la
tapa sobre la mesa, eso contaminaría al cultivo y a la mesa.
5. Pase las bocas de los tubos varias veces por la llama, para destruir cualquier
microbio indeseable que pudiera estar pegado al vidrio.
6. Introduzca el asa estéril en el tubo con bacterias, sin tocar las paredes del
mismo. Extraiga la muestra y transfiérala al otro tubo para realizar la siembra; si es
caldo, agite brevemente el asa dentro de este; si es agar inclinado, deslice el asa
en forma de zig zag continuo sobre la superficie, evitando destruir al agar. Saque el

31
asa del segundo tubo sin tocar las paredes de vidrio.

7. Vuelva a flamear las bocas de los tubos.
8. Tape los dos tubos; cada uno con el tapón respectivo (acordándose de cómo los
destapó).
9. Esterilice el asa y colóquela en un lugar seguro.
10. Ponga a cada tubo en la cesta de cultivo correspondiente e incube a 37 grados
centígrados por 18h.
RESULTADOS: 0bserve los crecimientos, en medio sólido la presencia de
crecimiento masivo y en liquido, la turbidez. Haga tinción Gram.
Esta es la técnica básica, que si se sigue correctamente, le garantizará, hasta en
un 99%, la pureza de sus cultivos y su propia seguridad. No se olvide: TRABAJE
SIEMPRE CERCA DEL MECHERO y ponga atención a las instrucciones.
ANALICE:
¿Fueron sus transferencias exitosas? ¿Qué evidencia tiene de que esto es así?
¿Por qué es necesario flamear las bocas de los tubos antes y después de la
inoculación de los microorganismos?
EJERCICIO NO.2 SEPARACIÓN MECÁNICA DE COLONIAS EN AGAR EN CAJA PETRI.
MATERIALES
Tubo con un caldo inoculado con un cultivo mixto

Cajas Petri con agar Nutritivo
Cajas Petri con agares selectivos y diferenciales previamente preparados
INOCULACIÓN POR AGOTAMIENTO DE ESTRÍAS
1. Tome una pequeña cantidad de muestra con el asa esterilizada.

2. Inocule una caja Petri con agar nutriente (marcada e identificada
apropiadamente) siguiendo los siguientes pasos:
a) Reparta el inóculo, con el asa, trazando líneas paralelas continuas sobre un

tercio de la superficie del agar. Esterilice el asa.
b) Con el asa fría (estéril) pase una línea (por una sola vez) sobre el rayado
anterior de manera que coja bacterias. Dispérselas sobre otro tercio del agar.
Esterilice el asa.
c) Repita el procedimiento anterior en el tercio restante de la caja. Cada rayado
debe hacerse solo una vez. Las líneas deben estar muy cerca unas de otras pero no
deben tocarse. No lastime el agar.
Ponga la caja, en forma invertida (con la tapa hacia abajo), en la cesta o portacajas
correspondiente e incube a 37 grados centígrados por 18h. Observe el crecimiento
bacteriano y aprenda a diferenciar crecimiento masivo de colonia.

32
EJERCICIO NO.3 SEPARACIÓN POR PROPIEDADES.
1. Utilice cajas Petri y tubos con los agares selectivos y diferenciales preparados en
la práctica anterior. Márquelas e identifíquelas apropiadamente.
2. Aisle bacterias a partir del cultivo mixto mediante agotamiento de estrías.
4. Incube las cajas a 37 grados centígrados por 18 horas.
5. Observe los crecimientos en los diferentes medios.
6. Realice una tinción Gram de las diferente colonias aisladas..
RESULTADOS:
Observe detenidamente las cajas de todos los ejercicios hechos. Busque colonias
perfectamente aisladas y definidas. Seleccione varias colonias diferentes y anote
sus características de acuerdo a la terminología estándar que se proporciona en la
figura. Señale la reacción a la tinción Gram., forma y agrupación correspondiente a
cada colonia seleccionada.
En la discusión analice qué hizo bien y qué hizo mal. De alternativas para mejorar lo
que hizo mal.
CUESTIONARIO
1. ¿En qué consiste el aislamiento de una colonia?
2. ¿Qué técnica le parece más eficaz? Por qué?
3. ¿Por qué es indispensable incubar las cajas en posición invertida?
4. ¿Para qué sirven las características de las colonias de acuerdo a cada medio?
5. Explique, en detalle, en qué consiste un medio selectivo y un medio diferencial.
6. Sugiera otra técnica de aislamiento de colonias a partir de una muestra.
Descríbala.
7. ¿Por qué es necesario obtener un cultivo puro?
8. ¿Cuál es el propósito del mantenimiento y preservación de cultivos puros?
Explique.

33
PRÁCTICA NO.7 RECUENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
• Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC)

• calcular el número de UFC/ml de una muestra problema a partir del
recuento de colonias.
INTRODUCCIÓN
En muchos estudios microbiológicos es importante conocer con exactitud el número

de microorganismos presentes en una muestra. Los métodos de recuento bacteriano
más utilizados son las medidas indirectas del crecimiento microbiano como la
medida de turbidez, o medidas directas como el recuento de colonias tras siembra
de diluciones sucesivas de la muestra.
Frecuentemente, las muestras naturales tienen un número muy elevado de

microorganismos, por lo que se requiere diluirla para poder efectuar recuentos. Para
ello, se realizan diluciones seriadas que posteriormente se siembran en placas con
el medio de cultivo adecuado.
Esta técnica nos permite conocer el número de microorganismos viables en una

determinada muestra. El método habitual para la determinación de células viables se
basa en contar el número de colonias.
MATERIALES POR GRUPO
7 tubos con 9ml de solución salina estéril

pipeta automática o pipetas estériles
varillas de vidrio acodadas
alcohol
cajas Petri con Agar Nutritivo preparado
Standard Plate Count Agar para preparar .
caldo nutritivo con bacteria problema
caldo nutritivo estériles
PROCEDIMIENTO INICIAL:
1. Tomar 1ml de la muestra problema y transferir al primero de los tubos con 9 ml de

solución salina estéril. ESTA ES LA DILUCIÓN 10-1.
2. Homogenizar totalmente la primera dilución y proseguir de la misma forma hasta
la dilución a la 10-7.
EJERCICIO NO.1: MÉTODO CUANTITATIVO, PLAQUEO SUPERFICIAL
1. Transferir con una pipeta estéril 0,1ml de cada dilución de la muestra a las cajas

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Petri con Agar Nutritivo. Este inóculo debe extenderse de forma homogénea por toda
la superficie de la placa, para lo cual utilizareos la vailla de vidrio acodada,
previamente esterilizada (impregnándola de alcohol y pasándola por la llama del
mechero).
2. Incubar las placas en posición invertida a 37 oC durante 24 horas.
3. Después del período de incubación examinar las placas. Las colonias aparecerán
sobre la superficie del agar. Cada colonia representa los descendientes de una UFC.
Contar únicamente aquellas placas que contengan un número entre 30 y 300
colonias. Un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la presencia de
errores debido a fluctuaciones estadísticas y un número mayor a 300 puede ser
excesivo para poder contarlas con exactitud.
4. Calcular con estos datos el número inical de UFC/ml de muestras:
UFC/ml= número de colonias x factor de dilución / ml sembrados en la placa.
Por ejemplo si en la placa correspondiente a la dilución 10-3 contamos 200 colonias,

el UFC /ml sería 200 x 103 / 0,1 (volumen añadido a la placa) = 2 x 106 UFC/ml.
Es preciso cerciorarse de que cada una representa un solo tipo de microorganismo.

Para ello realizaremos un examen macroscópico de la colonia y si considera
necesario una tinción gram.
EJERCICIO NO.2: RECUENTO POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
1. Preparar Standard Plate Count Agar, esterilizarlo y mantenerlo a 40-50 grados

centígrados hasta su utilización.
2. Marcar 7 cajas Petri estériles con los datos de la bacteria y la dilución
correspondiente.
3. Transferir con una pipeta estéril 0,1ml de cada dilución de la muestra a las cajas
Petri estériles y vacías
4. Verter aproximadamente 20 ml del Standard Plate Count Agar, tapar la caja Petri y
rotarla gentilmente para mezclar el agar con el inóculo. ESTE PASO ES CRÍTICO
5. Después de que el medio se ha enfriado totalmente, incubar por 24 horas a 37
grados.
sobre la superficie y en el interior del agar. Cada colonia representa los
descendientes de una UFC. Contar únicamente aquellas placas que contengan un
número entre 30 y 300 colonias. Un número menor de 30 colonias por placa puede
suponer la presencia de errores debido a fluctuaciones estadísticas y un número
mayor a 300 puede ser excesivo para poder contarlas con exactitud.
7. Para ayudarse al conteo, colocar la caja Petri sobre el contador Québec. Se
cuenta cada colonia independientemente del tamaño.
8. Calcular con estos datos el número inical de UFC/ml de las muestras:
UFC/ml= número de colonias x factor de dilución / ml sembrados en la placa
Por ejemplo si en la placa correspondiente a la dilució 10-3 contamos 200 colonias, el

35
UFC /ml sería 200 x 103 / 0,1 (volumen añadido a la placa) = 2 x106 UFC/ml.
EJERCICIO NO.3: MÉTODO CUANTITATIVO: MICROGOTAS
1. Dividir las cajas Petri en 3 partes. Transferir con una pipeta estéril 10µl de cada
dilución de la muestra en forma de gota, no mueva la caja. Transfiera 3 gotas por
cada dilución. Sin mover la caja Petri, espere que las gota se sequen.
2. Incubar las placas en posición invertida a 37 oC durante 24 horas.
sobre la superficie del agar. Cada colonia representa los descendientes de una UFC.
Contar únicamente aquellas placas que contengan un número entre 30 y 300
colonias. Un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la presencia de
errores debido a fluctuaciones estadísticas y un número mayor a 300 puede ser
excesivo para poder contarlas con exactitud.
4. Calcular con estos datos el número inical de UFC/ml de muestras:
UFC/ml= número de colonias x factor de dilución / ml sembrados en la placa
Por ejemplo si en la placa correspondiente a la dilució 10-3 contamos 200 colonias, el

UFC /ml sería 200 x 103 / 0,1 (volumen añadido a la placa) = 2 x106 UFC/ml.
Es preciso cerciorarse de que cada una representa un solo tipo de microorganismo.

Para ello realizaremos un examen macroscópico de la colonia y si considera
necesario una tinción gram.
EJERCICIO NO.4: CONTEO MICROSCÓPICO.
Consultar el método de conteo utilizando una cámara de Neubauer. Para este

ejercicio utilizar las diluciones -3, -5 y -7.
EJERCICIO NO.5: DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO POR DENSIDAD ÓPTICA.
La turbidez nos da un rápido indicio de que el cultivo está creciendo pero no nos
informa del número de células que existen. La turbidez puede medirse en un
espectrofotómetro porque el cultivo bacteriano actúa como una suspensión coloidal y
cuando la luz atraviesa el cultivo, es absorbida por las células, por lo que bajo ciertos
límites, la luz absorbida (densidad óptica OD) es proporcional a la cantidad de
células presentes. Para demostrar este principio se debe medir la absorbancia de un
cultivo a varias diluciones. Los valores son graficados como una función de la
dilución del cultivo.

36
MATERIALES
Cultivo bacteriano
cubetas para espectrofotómetro
micropipeta
caldo nutritivo estéril
tubos para diluciones
PROCEDIMIENTO
Calibrar el espectrofotómetro con el caldo nutritivo estéril a 460nm.
Las cubetas deben ser lavadas con alcohol y agua destilada.
Realizar diluciones 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100.
Medir la absorbancia de cada una de las diluciones.
Si la absorbancia de la mayor dilución es mayor a 1, proseguir con mayores
diluciones.
RESULTADOS
Graficar la curva y comparar los resultados de la absorbancia con los datos
obtenidos por los otros métodos
PREGUNTAS
Aplicando esta técnica se sembraron 2 placas de medio de cultivo a partir de
las diluciones -4 y -5. Tras la incubación de las placas durante 24 horas, no
apareció ninguna colonia. ¿Significa esto que no había ninguna bacteria en la
muestra problema?
Se toman 2,5 gramos de tierra y se resuspenden en una solución salina estéril

hasta un volumen final de 50 ml. A continuación , se hacen diluciones decimales
y se siembran 0,2ml de cada una sobre un medio adecuado. Tras la
incubación, en la placa de la dilución 10-6 se desarrollan 200 colonias. Calcule el
número UFC por gramo de tierra.
CONSULTE
¿En qué consiste el método del Número Más Probable? prepare esta consulta para
exposición en la clase.

37
PRACTICA NO. 8 INFLUENCIA AMBIENTAL Y CONTROL DEL CRECIMIENTO DE

MICROORGANISMOS
OBJETIVOS
Entender el efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano.
Aplicar métodos de desinfección y esterilización y analizar las diferencias de cada
uno.
EJERCICIO NO1.-EFECTOS DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO
Los microorganismos crecen en un amplio rango de temperatura que se extiende

desde bajo 0° C grados hasta más de 100° C. La temperatura afecta varios factores
metabólicos en la célula. Las enzimas son directamente afectadas por la
temperatura y pueden degradarse ó perder su actividad.
Las membranas celulares y el transporte también altera el transporte de nutrientes y
la fluidez.
En este experimento se intentará medir el efecto de la temperatura en la producción
de un pigmento y en el crecimiento bacteriano.
MATERIALES POR GRUPO:

2 tubos con agar nutritivo
5 tubos con caldo nutriente
agar nutritivo inoculado con Serratia sp. y agar inoculado ó con Escherichia coli,
ó Bacillus sp., ó Staphylococcus epidermidis ó Serratia sp.
PROCEDIMIENTO
1. Marque los tubos de la siguiente manera:
- Tubos con agar inclinado: poner 25 °C y 38 °C. Los dos serán inoculados con
Serratia.
-Los caldos serán inoculados con una de las cuatro especies (una diferente cada
grupo) con las siguientes temperaturas: 4°C, 25 °C, 38 °C, 55 °C y Temperatura
ambiente (TA).
2. Inocular cada tubo con el organismo adecuado
3. Incubar a la temperatura adecuada
RESULTADOS
Comparar los agares nutrientes inoculados con Serratia. Dibuje la apariencia de este
crecimiento.
Agite los caldos y compárelos con un caldo nutritivo estéril, note la diferencia en la
turbidez y tabúlela como +, ++ ó +++ dependiendo del crecimiento observado.
Intercambie sus resultados con los otros grupos para completar la información.

38
ANALICE:
¿Qué temperatura es la óptima para la formación del pigmento? investigue cómo
esta producción está controlada por la temperatura.
En base a los datos del curso, ¿cuál es la temperatura de crecimiento óptimo para
los organismos investigados?
EJERCICIO NO2.-EFECTOS LETALES DE LA TEMPERATURA
Para comparar la susceptibilidad de diferentes organismos a las temperaturas

elevadas se pueden utilizar dos métodos: el punto de muerte termal y el tiempo de
muerte termal. El punto termal de muerte es la temperatura a la cual un organismo
es matado en 10 minutos, mientras que el tiempo termal de muerte es el tiempo
requerido para matar una suspensión bacteriana a una temperatura dada. Estas
variables se ven afectadas por el pH, humedad, composición del medio, edad de las
células, entre otras.
Para este ejercicio el curso se dividirá en 5 grupos, cada uno de los cuales trabajará
con los dos microorganismos a una temperatura asignada.
MATERIALES POR GRUPO :

10 cajas de agar nutritivo
1 micropipeta de 100 a 1000ul ó pipetas de vidrio de 1 ml
puntas para la micropipeta
1 hot plate
1 vaso de precipitación
1 caldo de cultivo de E. coli
1 caldo de cultivo de B. subtilis
1 varilla de vidrio y alcohol para esterilizarla.
1 tubo de ensayo con agua para medir la temperatura del experimento.
1 termómetro
El grupo 1 trabajara a 50º, el grupo 2 a 60º y el grupo 3 a 70o, el grupo 4 a 80o C, el

grupo 5 a temperatura de ebullición.
PROCEDIMIENTO:
1. Preparación del baño maría: cada grupo calentará agua y la mantendrá a la
temperatura indicada, esta temperatura será verificada colocando el termómetro en
el interior del tubo de ensayo con agua, que estará dentro del baño maría.
2. Marque a cada caja con agar nutritivo con el nombre del organismo y los
siguientes tiempos: control, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos (una
caja para cada organismo a cada tiempo)
3. Agite el cultivo y transfiera 100ul a la caja marcada CONTROL y con la varilla de
vidrio esparza. TRABAJE BAJO EL MECHERO.
4. Coloque los cultivos bacterianos y el caldo nutritivo en el baño de agua y coloque
el termómetro dentro del caldo nutritivo sin cultivo. No cometa el error de insertar el
termómetro dentro del cultivo de organismos.

39
5. Desde cuando el cultivo llegue a la temperatura indicada vigile cuidadosamente y

después de 10 minutos transfiera 100 ul a la caja marcada con el tiempo 10 minutos.
Repita esta operación para los dos cultivos
bacterianos y en intervalos de 10 minutos hasta que todas las cajas hayan sido
inoculadas.
6. Incube las cajas a 37º C.
RESULTADOS:
Tabular sus resultados junto con los resultados de los otros grupos. Analice la
presencia (+) o ausencia(-) de los microorganismos.
Analice el punto termal de muerte de cada organismo. Determine el tiempo termal
de muerte de cada organismo. ¿Existen diferencias entre los dos organismos?
Explique las razones.
INVESTIGUE:
-Tres razones de por qué las endosporas son más resistentes al calor que las
células vegetativas.
-El nombre de cuatro enfermedades causadas por bacterias formadoras de
esporas.
-Tres métodos para destruir esporas.
EJERCICIO NO.3 EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DEL ETANOL COMO ANTISÉPTICO
MATERIALES POR PERSONA:

1 caja Petri con agar nutritivo
Por grupo
Un vaso de precipitación con etanol al 70%
Torundas con etanol al 70%.
PROCEDIMIENTO
Lleve a cabo este experimento antes de lavarse las manos.
1. Divida la caja Petri en 4 y marque con A, B, C y D.
2. Trabaje bajo el mechero: Presione la yema del pulgar izquierdo en el cuadrante A.
Sin tocar ninguna superficie presione la yema del pulgar izquierdo en el cuadrante B.
3. Presione la yema del pulgar derecho en el cuadrante C y desinfecte ese pulgar
por uno de los siguientes métodos: la mitad del grupo lo sumergirá en etanol por 5
segundos, y la otra mitad limpiara su pulgar con una torunda con alcohol.
4. Deje que el alcohol se evapore completamente de la piel y presione la yema del
pulgar derecho en el cuadrante D.
5. Incubar la placa a 37º.
RESULTADOS.
Cuente el número de colonias que aparece en cada cuadrante de todas las
personas de su grupo y llene una tabla similar a esta:

40
ANALICE
¿Qué efecto tiene el alcohol a nivel de las bacterias de la piel?
Existieron diferencias entre sumergir el pulgar en alcohol o limpiarlo con torundas,
que método es mas efectivo?
Existen supervivencia de microorganismos después del tratamiento con alcohol.

¿Qué tipo de microorganismos podrían ser.
¿Por qué es imposible esterilizar la piel humana?
EJERCICIO NO.4 EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE AGENTES QUÍMICOS Y

DESINFECTANTES

Antisépticos y desinfectantes en 3 diluciones diferentes
3 Cajas Petri con agar nutriente
Pinzas
Papel filtro cortado en discos pequeños (con una perforadora)
Aplicadores de algodón estériles
Cultivos bacterianos en caldo
Gradilla
Mechero
PROCEDIMIENTO
1. Inocule la caja Petri con la bacteria siguiendo la instrucción que se le dará.
2. Con un marcador, en el vidrio divida la caja Petri en cuatro partes y marque cada
una.
3. Esterilice la punta de las pinzas y déjela enfriar. Tome un disco de papel filtro e
imprégnelo con un químico. Escurra el exceso. Coloque el disco en el centro de
cada una de las cuatro partes, sobre la superficie del agar inoculado con la bacteria.
Proceda de la misma forma con las otras sustancias hasta completar cuatro discos
en las cuatro partes en que dividió la caja.
4. Incube a 37o C por 18 horas.

41
RESULTADOS
Grafique y anote sus observaciones
CONSULTE
1. Explique brevemente otros agentes físicos y sus métodos de aplicación en el
control microbiano.
2. Explique brevemente otros agentes químicos y sus métodos de aplicación en el
control microbiano.

42
PRÁCTICA NO.9 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN

BACTERIANA
OBJETIVOS
- Aprender a interpretar pruebas bioquímicas de identificación bacteriana.
- Poner en práctica las técnicas de separación de colonias y obtención de cultivos
puros previamente aprendidas.
- Entender el fundamento de cada prueba realizada.
INTRODUCCIÓN
Una identificación bacteriana se puede realizar tras el estudio de las características

de la tinción Gram, morfológicas y bioquímicas de los organismos. La identificación
bioquímica se fundamenta en las características metabólicas específicas de cada
microorganismo en la detección de la actividad de ciertas enzimas. Esta
especificidad depende del genotipo de las bacterias expresado en las proteínas que
se expresan, por eso la caracterización de las enzimas es una herramienta útil para
la identificación y clasificación bacterianas.
En el mercado existe una gran variedad de medios de cultivo diseñados no sólo para
permitir el crecimiento y multiplicación de los microorganismos, sino también para
inhibir a algunos o resaltar determinadas características metabólicas.

2 tubos con agar nutritivo inclinado inoculado con dos diferentes bacterias
problema.
2 tubos con agar nutritivo
Medios selectivos y/o diferenciales

2 cajas Petri con agar MacConkey lactosa (MKL)
2 cajas Petri con agar XLD
2 cajas Petri con agar EMB
2 cajas Petri con agar SS
2 cajas Petri con agar Sangre
2 tubos de ensayo con agar inclinado (conocido como pico de flauta) Manitol Sal
2 tubos de ensayo con agar inclinado TSI
2 tubos de ensayo con agar inclinado CITRATO
2 tubos de ensayo con agar horizontal SIM
2 tubos de ensayo con caldo UREA
2 tubos de ensayo con caldo MRVP
MATERIAL POR CURSO

Discos para la prueba Oxidasa
Peroxido de Hidrogeno al 3% para la prueba de catalasa.
Reactivo de Kovac
Hidróxido de potásico 0,1M y Alfa naftol para RMVP (rojo de metilo-Voges
Proskauer)

43
PROCEDIMIENTO
Primera semana:
1. DÍA:
-Preparar los medios de cultivo necesarios siguiendo las indicaciones de la
instructora y siguiendo las instrucciones de preparación de cada medio. LEER LAS
ETIQUETAS CON ATENCION, NO TODOS LOS MEDIOS SE AUTOCLAVAN.
-Sembrar dos bacterias diferentes tipo y aislar colonias en agar, SANGRE y MKL
por agotamiento de estrías. Incubar a 37 grados por 24 horas
2. DÍA:
-Analizar mediante tinción Gram. a las colonias de bacterias aisladas en los agares
SANGRE y MKL. Verificar qué tipo de bacterias se han aislado en cada uno de los
agares. Observar posibles hemólisis en la placa de agar sangre, y los cambios de
coloración en la placa de agar MKL.
- A partir de colonias de cocos Gram positivos realizar la prueba de la catalasa.

Averiguar qué géneros de cocos Gram positivos se pueden diferenciar con esta
prueba.
- Sembrar los cocos Gram. positivos en agar manitol sal e incubar por 24H a
37 grados C.
-A partir de las colonias de los bacilos Gram negativos realizar la prueba del
citocromo C oxidasa. Se recomienda hacer esta prueba a partir de una colonia que
está creciendo en agar sangre. UTILIZAR PALILLOS ESTÉRILES. Averiguar por qué
es importante esta prueba en la identificación de bacilos Gram negativos
-Inocular un tubo con agar nutritivo con una sola colonia de cocos Gram. positivos y
otro tubo con bacilos gram negativos para en lo posterior trabajar con un cultivo
axénico. Incubar por 24 horas a 37 grados.
Segunda semana:
1. DÍA:
-Inocular cada uno de los diferentes medios (XLD, EMB, SS) con los cultivos puros
sembrados en el agar nutritivo inclinado de cada una de sus bacterias problema.
-Inocular los tubos de las bacterias bioquímicas cortas siguiendo las siguientes
instrucciones:
TSI: Con una aguja de inoculación se toma una pequeña cantidad del cultivo puro y
se siembra por picadura hasta el fondo del tubo. Se retira la aguja siguiendo el
mismo camino de entrada y, sin volver a cargar el asa, se siembra en estría la
superficie del pico de flauta.
CITRATO: se toma una pequeña cantidad del cultivo puro y se siembra en estría la
superficie del pico de flauta

44
SIM: se toma una pequeña cantidad de cultivo puro y se siembra por picadura hasta
el fondo de tubo, se retira el asa o la aguja de inoculación siguiendo el mismo
camino de entrada.
-Para las dos pruebas bioquímicas en caldo, se toma una pequeña cantidad del
cultivo puro y se inoculan a los caldos con una agitación posterior.
-Incube todos los medios a 37o C por 18-24 horas
2. DÍA
-Algunas pruebas bioquímicas requieren la adición de reactivos para analizar su
resultado.
-Analice los resultados en los medios de cultivo y compare sus resultados con los
otros grupos.
RESULTADOS
Grafique cada uno de los medios de cultivo con los cambios de coloración si estos
existen.
Grafique el resultado de sus pruebas bioquímicas antes y después de la inoculación
para que se de cuenta del cambio de color.
En el curso existen siete diferentes bacterias problema. Realice una tabla con los
resultados de los crecimientos en cada uno de los medios de cultivos y los
resultados de las pruebas bioquímicas.
CONSULTA
Es importante entender el fundamento y la interpretación de los distintos medios de
cultivo y pruebas bioquímicas por lo cual usted para este laboratorio debe consultar
y presentar información de el fundamento de cada agar o prueba bioquímica. Cómo
se reconocen las pruebas positivas y las negativas, qué significa cada resultado, si
necesitan o no otros reactivos para revelar el resultado y para qué sirven estos
reactivos:
1. Agar sangre
2. Prueba de la citocromo c oxidasa
3. prueba de la catalasa
4. Agar citrato
5. Agar TSI
6. Agar manitol-sal
7. Prueba del indol
8. Prueba del rojo de metilo
9. Prueva de Voges Proskauer
10. Agar SIM
11. Agar urea
12. Agar XLD
13. Agar EMB
Esto deberá ser entregado el primer día de la primera semana de esta práctica
Para el primer día de la segunda semana de esta práctica busque una clave que

45
nos permita identificar los siguientes géneros: Salmonella, Shigella, Klebsiella,

Serratia, Proteus, Escherichia y Enterobacter.

46
ANEXOS
Rutas metabólicas comunes
Medios de cultivo
Reactivos, Soluciones Tamponadas y Colorantes
Tinciones
Bacterias, Hongos, Levaduras y Bacteriófagos
Control del Crecimiento Bacteriano
Cultivo en anaerobiosis
Bibliografía útil

47

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

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ORGANIZACIÓN DE LOS TEMAS DEL CURSO

Revisar el programa analítico de la asignatura proporcionado por las instructora. En

LOS INFORMES, DEBERES, TRABAJOS Y LECCIONES.

Los informes, deberes y trabajos pueden ser presentados a mano o en computador.

Recuerde, la profesora no pedirá los informes, deberes o trabajos NUNCA, es SU

Nadia Vieira y Alma Koch 2

Si usted falta a la lección deberá presentar justificación avalada por la Coordinadora

¿CÓMO SON LOS INFORMES EN LA CLASE DE MICROBIOLOGÍA I?

Los informes siempre serán entregados el primer día de la semana posterior al

Los informes deben contener:

TÍTULO DE LA PRÁCTICA (0,1 PTO)

INTRODUCCIÓN (0,5 PTO)

MATERIALES Y MÉTODOS (0,5PTO)

Se incubó la muestra en la incubadora a 37 grados C durante 24 horas.

RESULTADO (0,7 PTO)

DISCUSIÓN (1,5 PTO)

CONCLUSIONES (0,4 PTO)

Nadia Vieira y Alma Koch 3

En base a sus resultados y su discusión, concluya. Este es su aporte personal por lo

BIBLIOGRAFÍA (0,3 PTO)

El no seguir el formato especificado tiene una penalización de 1 pto

¿CÓMO HACER UNA CITA BIBLIOGRÁFICA EN LA INTRODUCCIÓN Ó EN LA

Según Correa (2002), los indices de infección nosocomiales en el Hospital Eugenio

Existen muchas razones prácticas para predecir si un compuesto particular es

¿CÓMO ESCRIBIR LA BIBLIOGRAFÍA?

Nadia Vieira y Alma Koch 4

Como plagio se entiende a:

Su actuación durante la clase es evaluada, se toma en cuenta el cumplimiento de las

Recuerde que estamos trabajando con microorganismos que podrían atentar a su

INVENTARIO Y LIMPIEZA DEL LABORATORIO

El inventario de los equipos y materiales es responsabilidad de los estudiantes. Se

Nadia Vieira y Alma Koch 5

Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo especiales

Uno de los principales objetivos de esta clase es enseñar a manipular

Existen una serie de normas de bioseguridad que permiten cumplir con

1. El acceso al laboratorio es restringido a las personas que están

2. Trabaje con CALMA y CONCENTRACIÓN.

3. Es obligatorio el uso de bata larga de algodón, destinada

4. Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos

5. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al

Nadia Vieira y Alma Koch 6

6. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio.

7. Esta prohibido comer, beber, fumar, maquillarse ó usar lentes de

8. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos

9. No pipetear con la boca. En caso que el profesor lo indique se deberá

10. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de microbiología es

11. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la

12. En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el

13. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este

14. Coloque sus pertenencias personales en los canceles fuera del

15. No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente

17. Deje las llaves de gas y de agua cerradas y los aparatos

Nadia Vieira y Alma Koch 7

18. Si sufre una cortadura o quemazón, inmediatamente vaya a la llave

20. Limpie el microscopio antes y después de utilizarlo.

21. Limpie la balanza después de utilizarla.

23. No desperdiciar insumos ni reactivos.

Nadia Vieira y Alma Koch 8

Defina y aisle el área contaminada

Limpie el área expuesta con abundante agua y jabón.