PRACTICA PROFESIONAL

ENTRENAMIENTO Y APOYO A LAS DIFERENTES ACTIVIDADES TECNICO

CIENTIFICAS PARA LA DETERMINACION DE PERFILES GENETICOS CON

MARCADORES DE ADN EN LA EMPRESA GENES S.A.S DE LA CIUDAD DE MEDELLIN

CHRISTIAM CAMILO CARDONA BERMUDEZ

CODIGO: 1611319

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

SAN JOSÉ DE CÚCUTA

2021
 PRACTICA PROFESIONAL

ENTRENAMIENTO Y APOYO A LAS DIFERENTES ACTIVIDADES TECNICO

CIENTIFICAS PARA LA DETERMINACION DE PERFILES GENETICOS CON

MARCADORES DE ADN EN LA EMPRESA GENES S.A.S DE LA CIUDAD DE MEDELLIN

CHRISTIAM CAMILO CARDONA BERMUDEZ

CODIGO: 1611319

TUTOR:

Juan José Builes Gómez

Director Científico

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

SAN JOSÉ DE CÚCUTA

2021
 TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN.............................................................................................................1
1. TITULO.....................................................................................................................2
2. OBJETIVOS..............................................................................................................2
2.1 OBJETIVO GENERAL......................................................................................2
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.............................................................................2
3. MARCO TEORICO...................................................................................................3
3.1 GENES S.A.S.....................................................................................................3
3.1.1 Definición....................................................................................................3
3.1.2 Misión..........................................................................................................3
3.1.3 Visión...........................................................................................................3
3.2 EXTRACCION DE ADN...................................................................................3
3.2.1 TECNICAS DE EXTRACCION...................................................................4
3.3 AMPLICACIÓN DE PCR..................................................................................4
3.4 ELECTROFORESIS CAPILAR........................................................................5
3.5 MARCADORES GENETICOS.........................................................................7
4. METODOLOGÍA......................................................................................................9
5. CRONOGRAMA.....................................................................................................10
BIBLIOGRAFIA.............................................................................................................11
 INTRODUCCIÓN

Las pruebas de ADN son consideradas el estándar de oro como evidencia en cierto tipo de casos,

especialmente en la identificación humana. Sin embargo, esto no siempre fue así, ya que

antiguamente el análisis de huellas dactilares, la determinación de marcadores genéticos clásicos

como grupos sanguíneos (AB0, Rh, etc.), o la declaración de un testigo podían ser determinantes

para inculpar a alguien como responsable de un delito. Sin embargo, muchas de estas evidencias

tenían un bajo potencial discriminatorio, o no permitían determinar sobre un razonamiento

lógico el valor probatorio de las mismas. (RangelVillalovos, H. 2018).

Desde el descubrimiento de regiones polimórficas en el ADN, que podían ser aplicadas en el

campo forense y/o en la identificación de perfiles genéticos para pruebas de paternidad,; las

metodologías analíticas y los marcadores genéticos utilizados han evolucionado paulatinamente.

(RangelVillalobos, H. 2018)., Desde hace alrededor de dos décadas las repeticiones cortas en

tándem, más conocidas por sus siglas en inglés como STRs (Short Tandem Repeats), se

convirtieron en los marcadores genéticos de elección en los análisis de ADN con fines

investigativos; en estos, los alelos y los genotipos se representan por números;. Al al analizar

varios STRs se genera un código numérico que conocemos como perfil genético o de ADN, y es

el que sirve para descartar o establecer relaciones de parentesco, entre las muestras biológicas

obtenidas con fines de identificación. (Carracedo, A. 2013). OJO: esta referencia no está en la

bibliografía

Este trabajo practico consiste en recibir un entrenamiento inicial y posteriormente brindar apoyo

a las diferentes actividades técnico-científicas que se realizan en el Laboratorio de Genes S.A.S

para la determinación de perfiles genéticos y su posterior aplicación en las pruebas de paternidad

y relaciones biológicas.

1. TITULO

ENTRENAMIENTO Y APOYO A LAS DIFERENTES ACTIVIDADES TECNICO

CIENTIFICAS PARA LA DETERMINACION DE PERFILES GENETICOS CON

MARCADORES DE ADN EN LA EMPRESA GENES S.A.S DE LA CIUDAD DE

MEDELLIN

2. OBJETIVOS

2.1 OBETIVO GENERAL

Recibir un entrenamiento inicial y posteriormente brindar apoyo en las diferentes actividades

técnico-científicas desarrolladas por el Laboratorio Genes S.A.S de la ciudad de Medellín.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Adquirir destrezas en el área de biología molecular aplicando los procedimientos

indicados en el Procedimiento Técnico Científico del Laboratorio Genes SAS.

 Practicar de forma adecuada la utilización de los implementos para la obtención de una

muestra biológica (sangre, saliva, entre otras) como fuente de ADN y posterior

ordenamiento para el análisis de la misma

 Aprender y aplicar las diferentes técnicas de extracción de ADN con el uso de reactivos

de extracción como lo son: Chelex , y Swab Solución (Promega CO). y que hacen estas

técnicas hoy en día más eficientes.

 Apoyar el proceso Reacción en Cadena de la Polimerasa (de PCR) para la amplificación

de fragmentos de ADN mediante el uso de sistemas multiplex de loci STR ligados a los

cromosomas autosómicos y a los cromosomas sexuales Y y X.

 Conocer las técnicas de electroforesis en geles de secuenciación y capilar utilizando los

equipos FMBIO IIe y el equipo ABI 3500 Genetic Analyzer, respectivamente, para el

análisis correcto de los genotipos de los individuos.

 Recibir entrenamiento y apoyar en la realización de análisis de resultados, cálculos

matemáticos tanto manuales como computacionales y realización de informes de ensayo.

3. MARCO TEORICO

3.1 GENES S.A.S

3.1.1 Definición

Es una empresa líder en Colombia en la identificación humana y el establecimiento de

Relaciones Biológicas utilizando marcadores de ADN, principalmente en el diagnóstico de la

Paternidad Biológica. Cuenta con una infraestructura tecnológica y logística sólida,

promoviendo la investigación constante como una necesidad y obligación para su

crecimiento.

3.1.2 Misión
El Laboratorio Genes es una empresa de servicios, líder en la identificación humana y el

establecimiento de las relaciones biológicas, principalmente el diagnóstico de la paternidad

biológica, utilizando marcadores de ADN con los más altos estándares de calidad.

3.1.3 Visión

Nos consolidaremos como una de las organizaciones más reconocidas en el campo del

Diagnóstico de las Relaciones Biológicas entre individuos a nivel nacional e internacional.

3.2 EXTRACCION DE ADN

Todas lasComo muchas técnicas de biología molecular comienzan con la obteniendo el ADN

molde. Sin embargo, el objetivo de esta técnica es obtener ADN de diferentes partes fuentes,

tales como lo son células bucales, semen, sangre, cabello, líquido amniótico, entre otras, a

través de técnicas procedimientos ya definidoas o técnicas experimentales actualmente

utilizadas entre las diferentes metodologías. (Sambrook J, Fritsch SF, Maniatis T, 1989).

OJO: esta referencia no está en la bibliografía

3.2.1. Técnicas de Extracción

 Lisis celular: es decir, la destrucción de las células, ya sea epiteliales (por ejemplo,

mucosa oral en saliva, fluidos vaginales, leucocitos en sangre, etc.). Este paso en

muchos casos requiere un paso previo para obtener las células, de sangre separar los

leucocitos (que si tienen ADN) de los eritrocitos (sin ADN); de osteocitos,

descalcificar el hueso; de tejido desintegrarlo y homogeneizarlo, entre otros.

 Purificación: para separar al ADN de las proteínas y los restos celulares que dejó la

lisis celular previa.

  Precipitación: que consiste en separar al ADN mediante su deshidratación en alcohol

absoluto y dejarlo secar.

 Resuspensión: para rehidratar el ADN con una solución que lo protege de la posible

degradación.

1.1 Sin embargo, existen otros métodos de extracción bastante utilizados en genética, como

el Chelex, el papel, Swap Swab Solución™ KIT (PROMEGA CO), las resinas

magnéticas, y la extracción diferencial ESTO QUEDA MUY RARO ACA, LA

METODOLOGIA QUE DESCRIBES NO ES LA QUE USAMOS NOSOTROS, CREO

QUE DEBERIAS ORIENTAR ESTA PARTE DE EXTRACCIÓN A DESCRIBIR DE

FORMA GENERAL QUE ES EL CHELEX Y EL SWAB SOLUTION

3.3 AMPLIFICACION POR PCR

El objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa, más bien conocida por sus siglas en inglés

como PCR (del inglés, polimerase chain reaction), consiste en amplificar o generar millones de

copias de secuencias del genoma, en este caso STRs, lo que generando el perfil genético.

(Rangel-Villalobos H. 2010). La PCR consiste en 25-30 ciclos en los que suceden los siguientes

tres pasos en cada ciclo. (Castellano AM. 1999), ): 1) desnaturalización, por calor se

desnaturalizan (separan) las cadenas de ADN, 2) alineamiento de los iniciadores o primers, que

se unen por complementariedad de bases y delimitan las regiones que se van a replicar, y 3)

extensión, en cada ciclo de PCR se duplica la secuencia blanca diana (STRs), por lo que en 25 a

30 ciclos teóricamente habrá millones de copias, facilitando su análisis posterior (Figura 3).

OJO: A ESTE PARRAFO LE FALTA MAS CLARIDAD

 Figura 3. Amplificación exponencial de una secuencia de interés mediante PCR.

Actualmente la técnica de PCR en genética forense ha sido mejorada ya que incluye varios pares

de primers para amplificar de 15 a 24 marcadores simultáneamente, en la llamada PCR

múltiplex, la química de amplificación de los kits comerciales para perfiles genéticos ha

mejorado de forma importante, haciéndolos más resistentes a los inhibidores que suelen contener

las muestras biológicas de casos forenses, propios del suelo, sangre coagulada, etc.

3.4 ELECTROFORESIS CAPILAR (EC)

3.4.1. ELECTROFORESIS EN GELES DE SECUENCIACIÓN

Aca debes describir esta metodología….

3.4.2. ELECTROFORESIS CAPILAR (EC)

Los diferentes alelos de los marcadores STRs se diferencian por el número de veces que se repite

una secuencia corta de 2 a 5 pb, esto significa que el tamaño va a ser diferente entre un alelo y

otro. Para ver estas diferencias se emplea la EC, donde el los productos de PCR de cada muestra

se separan por acción de un campo eléctrico a través de un capilar relleno de polímero por acción

de un campo eléctrico, proceso que dura alrededor de 30 minutos por muestra. Como producto
final de parte de la EC, también se detectan los productos para ofrecernos una representaciónse

obtiene una gráfica de la cada corrida corrido llamada electroferograma.

La ventaja de la EC es que por su relación área/volumen, los capilares dispersan eficientemente

el calor, lo que permite aplicar voltajes elevados y separar de forma rápida y precisa los

fragmentos amplificados (Butler JM, Buel E, Crivellente F, Bruce RM. 2006). Para este fin,

en los laboratorios de genética de que determinación de perfiles genéticos poseen destacan los

secuenciadores analizadores genéticos de la marca Applied Biosystems®. Por ejemplo, el ABI-

Prism 310 de un capilar, el 3100 o 3130 con 4 y 16 capilares, respectivamente. Hace pocos años

se introdujo el modelo ABI Prism 3500 con 8 o 24 capilares, el cual ya reconoce seis en lugar de

cinco fluorescenciasfluorocromos, además de presentar un mayor rango de detección, evitando

efectos de saturación indeseables que dificultan la interpretación de los perfiles genéticos.

REFERENCIA?

El proceso de genotipado se auxilia de ladders o escaleras alélicas que contienen una mezcla con

todos los alelos de cada STR igualmente marcados con la fluorescencia del STR. La

comparación de los picos de cada muestra con la escalera y los rangos preasignados para

identificar cada alelo (bins) permite asignar con relativa facilidad los alelos y finalmente el

genotipo de una persona para todos los STRs. Para que este proceso sea exitoso, el software de

análisis requiere saber conocer el tamaño de los fragmentos de ADN,; para ello, en el tubo de cada

muestra se incluye durante la preparación previa a la EC un estándar de tamaño o size standard,

cual presenta una fluorescencia particular. Finalmente, en el electroferograma se observa una

serie de picos que –de acuerdo a su color y posición– indican los genotipos que tiene en

individuo para cada STR, lo que constituye su perfil genético. Si un individuo presenta uno o dos

picos (alelos), indica que su genotipo es homocigoto o heterocigoto, respectivamente (Figura 4).
 Figura 4. Perfil genético de un individuo

3.5 MARCADORES GENETICOS

Los marcadores más empleados para realizar una prueba de ADN son los microsatélites,

repeticiones cortas en tándem o STRs. Como su nombre lo dice, los STRs se componen de

secuencias repetidas cortas (p. ejem. GATC) que dan lugar a diversos alelos que se nombran por

el número de veces que se encuentre la secuencia repetida; por ejemplo, el alelo tres presentará

tres veces la secuencia GATC (es decir, GATC, GATC, GATC), con la misma lógica para todos

los alelos. En la población podrían existir los alelos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, etc., y un número

aún mayor de genotipos (por ejemplo, 6/6, 6/7, 6/9; 7/7, 7/9, 10/12, etc.). BIBLIOGRAFIA

Éstos tienen la ventaja, respecto a los dinucleótidos (p. ejem. GA) o trinucleótidos (p. ejem.

GCT), por generar menos artefactos durante la amplificación conocidos por su nombre en inglés

como stutter, que significa tardamudeo. Los stutter resultan del deslizamiento de la polimerasa

durante la PCR, amplificando un fragmento adicional que mide una unidad de repetición menos
que el alelo real13. En los electroferogramas se ve como un pico de menor tamaño a la izquierda

del pico que representa al alelo (Figura 4). En los STRs di y tri nucleótidos, los stutter suelen ser

muy grandes, casi igual o hasta mayores que el alelo real, lo que provoca genotipos no

reproducibles o difíciles de interpretar. En cambio, los STRs pPenta nucleótidos son muy

estables y casi no generan stutter, pero generan productos de amplificación más grandes que

suelen no amplificarse cuando el ADN esta parciamente degradado. A pesar de ello, la empresa

Promega® incluye algunos “pentas” en sus kits debido a su gran polimorfismo y a que

amplifican genotipos claramente interpretables. En las últimas generaciones las químicas de

amplificación de los kits comerciales de identificación humana han incluido DNA polimerasas

que generan menos stutter, por lo que ha disminuido su impacto como artefacto. (Rangel, H.

2018).

4. METODOLOGIA
La metodología del presente plan de trabajo, se establece en base basada a en los objetivos

específicos planteados, los cuales encaminan a un objetivo final o principal, basado en el

entrenamiento y apoyo a las diferentes actividades técnico científicas para la determinación de

perfiles genéticos con marcadores de ADN en la empresa Genes S.A.S de la ciudad de Medellín.

5. CRONOGRAMA
 ABRIL MAYO JUNIO
FECHAS SEMANALES
Semanas Semanas Semanas
ACTIVIDADES 1 2 1 2 3 4 1 2 3 4
Inducción y reconocimiento del laboratorio.
Inicio elaboración Plan de Trabajo.
(19 al 22 de abril).
Finalización Plan de Trabajo.
Atención Usuarios – Toma de Muestras.
(26 al 29 de abril).
Entrega Plan de Trabajo.
Extracción ADN Chelex.
Aislamiento ADN SwabSolution Kit.
(3 al 6 de mayo).
Entrega INFORME TECNICO DE AVANCE I.
PCR: VeriFiler Express, Power Plex Fusion,
Argus 12-X, Y Filer Plus.
(10 al 13 de mayo).
Electroforesis Capilar ABI3500.
Electroforesis Geles de Poliacrilamida FMBIO IIe.
(17 al 20 de mayo).
Lectura de Resultados Electroferogramas.
Lectura de Resultados Geles de Poliacrilamida.
(24 al 27 de mayo).
Análisis de Resultados: Paternidades Compatibles.
Análisis de Resultados: Paternidades
Incompatibles.
Entrega INFORME TECNICO DE AVANCE II.
(31 de mayo al 3 de junio).
Cálculos Estadísticos.
(7 al 10 de junio).
Informe de Resultados.
Entrega INFORME TECNICO FINAL.
(14 al 18 de junio).
Sustentación de la Práctica Profesional.
(22 de junio)
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Butler JM, Buel E, Crivellente F, Bruce RM. (2004). Tipificación forense del ADN mediante

electroforesis capilar utilizando los analizadores genéticos ABI Prism 310 y 3100 para el análisis

de STR. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15188225/

Edwards A, Hammond AH, Jin L, Caskey CT, Chakraborty R. (1992). Variación genética

en cinco loci de repetición en tándem triméricos y tetraméricos en cuatro grupos de población

humana. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1740333/

Hill C, Kline M, Mulero J, Lagacé R, Chang C, Hennessy L, et al. (2007). Revista J Forensic

Sci. Estudio de concordancia entre el kit de amplificación PCR AmpFlSTR MiniFiler y los kits

convencionales de tipificación de STR. Disponible en:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17553078/

Mullis KB, Ferre F, Gibbs RA. La reacción en cadena de la polimerasa. (1994). Disponible en:

http://mgcub.ac.in/pdf/material/20200405104203bcf83eecdc.pdf

Rangel, V. (2018). Las pruebas de ADN en el contexto forense. Disponible en:

http://portal.amelica.org/ameli/jatsRepo/153/153759008/153759008.pdf