2018

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR

ELABORARON:

DRA. NAYALI A. LÓPEZ BALDERAS

DR. ROBERTO LAGUNES TORRES
DRA. ROSA MARÍA TORRES HERNÁNDEZ
DRA. MARTHA LETICIA ZAMUDIO AGUILAR
DR. RAUL MARISCAL REYES
DR. JONATHAN GARCÍA ROMÁN
DR. ÁNGEL ALBERTO PUIG LAGUNES
DRA. MONTSERRAT MELGAREJO GUTIÉRREZ

Fecha de Elaboración: 2018

AREA DE CIENCIAS DE LA SALUD
Misión
Formar Médicos Cirujanos competentes para promover la salud, prevenir,
diagnosticar, tratar y rehabilitar las enfermedades que afectan a la población; a
través de un programa educativo de calidad, pertinente, que fomenta la
investigación, distribución del conocimiento, innovación y la sustentabilidad.

Visión
En el año 2030 el programa educativo de Licenciatura de Médico Cirujano de la
Universidad Veracruzana, es reconocido por formar profesionales competentes y
humanistas en los ámbitos estatales, nacionales e internacionales; a través de la
docencia, investigación, difusión de la cultura, y vinculación con los sectores de la
sociedad, con una organización académica y administrativa moderna, innovadora
y sustentable, fundamentada en la legislación universitaria.
 Perfil de egreso
El egresado de la licenciatura de médico cirujano de la Universidad Veracruzana,
es el profesional que tiene por objeto de estudio la salud de las personas a nivel
individual y colectivo; las funciones profesionales que desarrolla son promoción de
la salud, prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de enfermedades.
Las necesidades sociales que atiende el médico cirujano se enfocan en el primer
nivel de atención, donde se brinda prevención, primaria, secundaria y terciaria a la
sociedad orientada hacia la resolución de los problemas demográficos Y
epidemiológicos de la región. Así mismo, puede desarrollar actividades de
docencia, investigación y servicio que le permita hacer acercamientos muy
puntuales con las poblaciones, diseñar las estrategias y diseñar los escenarios
para derivar hacia los siguientes niveles de atención que permita una real atención
integral, siendo el principal elemento de articulación de todo el sistema de salud,
entonces socialmente incide en los cambios de los estilos de vida para procurar un
estado de salud constante.
Los espacios laborales son principalmente consultorios, clínicas y unidades
hospitalarias de los ámbitos públicos, sociales y privados. En el campo de la
promoción, investigación y docencia se amplían los sectores de acuerdo al
abordaje de las problemáticas de salud.
Competencias genéricas
El egresado de médico cirujano de la Universidad Veracruzana desarrollará seis
competencias profesionales que a continuación se detallan:
1. Comunicación médico – paciente. Comunicarse con el paciente y/o familia, a
través de un lenguaje asertivo, claro, preciso, empático, respetuoso y en un clima
de confianza, con la finalidad de otorgar atención médica de calidad.
2. Educación para la salud. Educar al individuo, familia y comunidad sobre la
conservación de la salud y prevención de las enfermedades, aplicando estrategias
educativas para la promoción de la salud y prevención de la enfermedad, con una
actitud de respeto, tolerancia, justicia, equidad, solidaridad, y responsabilidad
 social, fundamentándose en los enfoques teóricos metodológicos de la educación
para favorecer un ambiente saludable y mejorar la calidad de vida.
3. Diagnóstico médico. Diagnosticar en el paciente las condiciones de salud y/o
enfermedad a partir de la elaboración e interpretación correcta del expediente
clínico, considerando la integración bio-psico-social del paciente, con una actitud
de disciplina, lealtad, confidencialidad, respetando la dignidad de la persona, con
la finalidad de emitir su juicio médico.
4. Tratamiento del paciente. Tratar las patologías detectadas en los pacientes,
aplicando los medios terapéuticos necesarios basados en evidencias científicas y
con actitudes de disciplina, lealtad, confidencialidad, respeto a la dignidad de la
persona para prevenir, curar, paliar las enfermedades y restablecer la salud.
5. Investigación. Investigar problemas de salud que afectan a los sujetos de una
comunidad, aplicando la metodología científica en el marco de la bioética médica,
asumiendo una actitud de responsabilidad, compromiso y honestidad; con la
finalidad de generar nuevos conocimientos y encontrar alternativas de solución.
Administración en salud. Administrar los recursos disponibles aplicando las etapas
del proceso administrativo con honestidad, solidaridad, lealtad, equidad y
disciplina, con la finalidad de ofrecer servicios de salud con calidad.
 INTRODUCCIÓN

El presente Manual de Prácticas de Laboratorio tiene como objetivo la aplicación práctica

y reforzamiento de algunos de los conocimientos teóricos adquiridos durante el programa
de la experiencia educativa de BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR, con la finalidad de
que al término del curso el alumno obtendrá una visión general sobre la diversidad y
organización celular, así como de la función de los procesos moleculares que ocurren en
las células. Reconocerá los principios de algunas técnicas en la biología celular y
molecular que le permitan comprender los avances en investigación y su aplicación clínica
y biotecnológica.

Como Objetivos secundarios podemos enunciar:

I. Comprender la composición, estructura y función de diferentes células.
II. Visualizar la relevancia de la regulación osmótica e integridad de la membrana
celular.
III. Describir el proceso y regulación del ciclo celular.
IV. Conocer las propiedades químicas y funcionales de los ácidos nucleicos.
V. Comprender los fundamentos de las técnicas de biología molecular básicas y sus
aplicaciones clínicas.

El presente Manual es solamente una GUIA para la realización de las prácticas

seleccionadas de conformidad con los recursos de que disponemos. Se sugiere realizar
una revisión de conceptos básicos para poder comprender los objetivos y metodología de
cada práctica. Para su análisis, discusión y entrega de reporte deberán realizar lecturas
complementarias. Los maestros y alumnos deberán consultar las fuentes de información
correspondientes para poder darle una base científica a cada una de las prácticas. Este
manual estará disponible de manera digital, y los alumnos podrán imprimirlo cuando lo
consideren necesario

El presente Manual incluye prácticas en las que puede ser necesario la colaboración con
dependencias de la misma Universidad, como es el Instituto de Investigaciones y/o
externas como el Lab. de Genética y Biología Molecular del Hospital e Alta Especialidad
de Veracruz.
REGLAMENTO GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y
CELULAR

1. Ser puntual. Se tendrá una tolerancia máxima de 10 minutos de retardo.

2. Para entrar o permanecer en el laboratorio se deberá portar siempre una bata
blanca.
3. Traer el material de trabajo necesario (pluma, lápiz, lápices de colores, y el
indicado en el manual de prácticas).
4. Estudiar con la debida anticipación los temas que se van a revisar en cada
práctica.
5. Es obligatorio que durante la práctica se tomen apuntes, dibujos o fotografías,
pues éstas NO SE REPITEN y se anexarán en el reporte de la misma.
6. Al término de la práctica, el alumno deberá guardar correctamente su
microscopio, limpiar su área de trabajo y regresar el material solicitado limpio y en
buenas condiciones. En caso de daño al material, aparatos, desaparición de
equipo o de piezas del equipo o daño a los inmuebles del laboratorio, el (los)
alumno(s) responsable(s) deberán cubrir el costo de los desperfectos
ocasionados.
7. Comportarse de acuerdo a las normas de disciplina establecidas en la Ley
orgánica y su estatuto de la Universidad Autónoma Veracruzana.
8. Prohibido: Usar gorra, introducir y consumir líquidos y alimentos en los
laboratorios, fumar y utilizar lenguaje altisonante e irrespetuoso, así como el uso
de teléfonos celulares para actividades que no sean tomar evidencia de la
práctica.
9. No correr o empujarse dentro del laboratorio.
10. Cuando sea necesario manejar muestras humanas es obligatorio el uso de
guantes de látex o nitrilo
11. No pipetear ninguna solución con la boca.
 NORMAS DE SEGURIDAD

1. Identificar los accesos en el laboratorio para salir inmediatamente en caso de

un siniestro (incendio, sismo); hacerlo con orden, recordar que el laboratorio
está en el tercer piso.

2. ACCIONES A TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE

A. CORTADURAS:
1. En caso de heridas pequeñas dejar que sangre unos segundos, tener
cuidado de no dejar partículas de vidrio en la herida y aplicar un
desinfectante.
2. Las heridas de mayor importancia deberán ser atendidas por un médico,
tomando medidas de hemostasia por medio de la presión.

B. CHOQUES ELÉCTRICOS:
Son muy raros en el laboratorio, pero no por ello deben de olvidarse las
recomendaciones como son: Nunca tocar un aparato eléctrico con las manos
húmedas o cuando se esta parado sobre piso mojado. Siempre apagar y
desconectar los aparatos antes de cualquier manipulación.

C. QUEMADURA CON REACTIVOS QUÍMICOS ¿?¿

 INDICACIONES PARA LA REALIZACIÓN Y REPORTE DE LAS PRACTICAS
EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR

1. Ser puntual. Se tendrá una tolerancia máxima de 10 minutos de retardo.

2. Estudiar y traer impresa la técnica de la práctica, ya que al azar el profesor
puede pedir a cualquier alumno que explique los procedimientos a realizar antes
de comenzar.
3. Cuando sea indicado en el manual, presentar resueltos los cuestionarios o
temas previos antes de iniciar la práctica.
4. Investigar y mostrar antes de iniciar la práctica los riesgos de salud de las
sustancias químicas que se manejarán en la práctica.
5.-Entregar el reporte de la práctica la sesión siguiente (Digital y/o impreso). El
reporte deberá incluir:
o Caratula
o Introducción (incluye los temas y cuestionarios previos)
o Competencia
o Material y Método
o Resultados
o Discusión (Análisis) de Resultados (Observaciones)
o Conclusiones
o Bibliografía
INDICE.
1.-PRÁCTICA 1: MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO
2.- PRÁCTICA 2: ORGANELOS CELULARES , MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Y DE BARRIDO .
3.-PRÁCTICA 3:
 PRACTICA No 1.
MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO

NOMBRE………………………………………………….FECHA…………….
GRUPO………………………………………

INTRODUCCIÓN

Debido a que la mayoría de las células son demasiado pequeñas para ser
observadas y estudiadas a simple vista, el origen y avance de la biología celular
dependió de los avances tecnológicos y de la creación de un instrumento en
particular, el microscopio. Los microscopios son instrumentos que producen una
imagen aumentada de un objeto, su desarrollo permitió la identificación y estudio
de las células, y posteriormente la explicación de fenómenos vivientes, tanto en
condiciones normales como patológicas. Actualmente ciertos tipos de
microscopios pueden brindar un análisis altamente detallado de las estructuras
celulares. Por lo tanto, conocer los componentes y particularidades de los
diferentes tipos de microscopios les permitirá a los alumnos comprender sus
aplicaciones clínicas y en investigación.

COMPETENCIAS:

 Identifica los componentes del microscopio óptico.

 Analiza y clasifica la función de las diferentes partes del microscopio.
 Ejecuta los pasos para el buen uso del microscopio en el laboratorio.
 Identifica las principales formas de obtención de la muestra.
 Reconoce la importancia de la fijación
 I- AUTOEVALUACIÓN
1. Identifica y nombra cada una de las partes que forman el microscopio

2. Completa el siguiente cuadro mencionando brevemente para que sirve cada una de las
partes del microscopio óptico

BAS
E
BRAZ
O
CABEZA
L
CONDENSADOR

DIAFRAGM
A

OBJETIVO

OCULAR

PLATINA

REVÓLVER

TORNILLO DE CARRO
MÓVIL
TORNILLO
CONDENSADOR

TORNILLO
MACROMÉTRICO

TORNILLO
MICROMÉTRICO
3. Describe la forma correcta de transportar un microscopio.

2. EJERCICIO PRÁCTICO.
PARTE I. Instrucciones de USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO:
1. Conecta el microscopio, enciéndelo y regula la luz para evitar un exceso de brillo,
posteriormente ajusta los oculares (regula la distancia interpupilar, de modo en
que observes un solo campo de visión).
2. Si todo el campo visual no se observa iluminado, ajusta el condensador
(subiéndolo o bajándolo mediante el tornillo del condensador) hasta lograr que
todo el campo este iluminado. Si es necesario ajusta el diafragma abriendo o
cerrándolo para contrastar tu preparación.
3. Coloca la laminilla en la platina, utiliza la pinza de sujeción metálica para
sujetarla. Posteriormente, hay que centrar el tejido utilizando para esto el tornillo
del carro móvil.
4. Coloca en posición el objetivo de menor aumento (4x), girando el revolver si es
necesario. La posición correcta se logra alineando el objetivo con el orificio de la
fuente de luz.
5. Mientras observas la preparación por los oculares, mueve el tornillo
macrométrico para acercar la superficie del espécimen al objetivo lo más cercano
posible. Este movimiento se realiza en forma lenta hasta empezar a observar la
imagen de la preparación o sentir el tope.
6. Utiliza el tornillo micrométrico para enfocar la imagen.
7. Cuando se obtenga una imagen nítida de la preparación, recorre el tejido de un
extremo a otro moviendo la preparación con los tornillos del carro móvil. Realiza
este recorrido preferentemente en línea, para abarcar toda la preparación. Elige el
sitio donde continuarás observando a mayor aumento.
8. Para continuar la observación con los siguientes objetivos solo gira el revolver
hacia el siguiente objetivo (10x/15x/20x) hasta que quede alineado, si se realizó
correctamente el enfoque en el objetivo anterior, únicamente será necesario
enfocar la imagen con el tonillo micrométrico moviéndolo muy lentamente.
9. Para cambiar nuevamente al objetivo (40x), también llamado seco fuerte, gira el
revolver a la siguiente posición y ajusta la imagen con el tornillo micrométrico.
 SE DEBE EVITAR MANIPULAR BRUSCAMENTE EL TORNILLO
MACROMÉTRICO EN OBJETIVOS MAYOR AUMENTO (EJEMPLO:
OBJETIVO 40X o 100X). YA QUE PUEDES ROMPER LA PREPARACIÓN
Y/O RAYAR EL OBJETIVO.
10. Al utilizar el objetivo de inmersión (100x) se requiere del uso de aceite de
inmersión. Se gira parcialmente el revolver para coloca los objetivos 40x y 100x
en forma de A, permitiendo un espacio para colocar el aceite. Posteriormente se
alinea el objetivo 100x al haz de luz y se ajusta el enfoque con el tornillo
micrométrico.
AL FINALIZAR LA OBSERVACIÓN CON EL OBJETIVO 100X, MOVER
EL REVOLVER AL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO PARA
PERMITIR LA LIMPIEZA DEL ACEITE DEL OBJETIVO.
11. Al finalizar apaga la fuente de luz, coloca el microscopio en la posición inicial:
con objetivo de menor aumento, la platina abajo centrada y hacia atrás.
Retira cuidadosamente la laminilla y finalmente enreda el cable. RECUERDA
LIMPIAR LA LAMINILLA EN CASO DE HABER USADO

3. MATERIAL
Microscopio de luz
Aceite de inmersión
Preparaciones (las proveerá el profesor)

4. PROCEDIMIENTO.
1. Por equipos identificarán los principales componentes del
microscopio
2. Iniciar la identificación de células con el objetivo de 4X
3. Subir el condensador, utilizando el tornillo portacondensador
4. Colocar el objetivo 10X
5. Ajustar la distancia interpupilar. Enfocar una preparación
6. Cerrar el diafragma de campo completamente se observa una luz
difusa
 7. Con el tornillo porta condensador ajustar la altura, descender hasta
observar el diafragma de campo, se ver un polígono
8. Centrar el polígono con los tornillos posteriores
9. Abrir el diafragma lentamente hasta que los vértices del polígono
desaparezcan y el área iluminada cubra todo el campo
10. Contrastar con el diafragma de iris del condensador
11. Observar las preparaciones en 40X y 100X (usando aceite de
inmersión)
12. Registrar sus observaciones con las diferentes preparaciones

5. RESULTADOS.
Describa y esquematice las células que ha observado. Anotando el tipo de
preparación, tinción y objetivo con el que se observo

Tipo de preparación:
Método de tinción:
Objetivo:
Aumento total:
Descripción:

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS.
Responda los siguientes cuestionamientos:
¿Se logró el objetivo planteado?
¿Qué es amplificación, resolución y cuál es el límite de resolución del microscopio
óptico?
¿Por qué se requiere el uso del aceite de inmersión?
 7- Actividad Complementaria:
Investigar las características de los diferentes tipos de microscopia y sus
aplicaciones: Microscopio de Contraste de fases, Microscopio de Luz ultravioleta,
Microscopio Electrónico de transmisión , Microscopio Electrónico de Barrido,
Microscopio Confocal, Estereomicroscopio, Microscopio con aditamientos
especiales: filtro para luz polarizada, condensador de Nomarsky

RECUERDA: SIEMPRE AL FINALIZAR LA OBSERVACIÓN DE

LAMINILLAS, REGRESAR EL MICROSCOPIO EN LAS MISMAS
CONDICIONES EN QUE SE TE FUE ENTREGADO: EN SU
POSICIÓN INICIAL (COLOCANDO EL OBJETIVO DE MENOR
AUMENTO, PLATINA ABAJO CENTRADA Y ATRÁS) Y CABLE
APROPIADAMENTE ENRROLADO.

Bibliografía.
PRÁCTICA No. 2
ORGANELOS CELULARES Y MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Y DE BARRIDO
NOMBRE………………………………………………….FECHA…………….
GRUPO………………………………………

INTRODUCCIÓN:
Un microscopio electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para formar
imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar
amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud
de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones "visibles".
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll en 1925 y 1932,
quienes se basaron en los estudios de Louis Victor de Broglie acerca de las propiedades
ondulatorias de los electrones.

COMPETENCIAS:
Analiza y establece la diferencia entre estructura y ultraestructura celular,
mediante el uso de microfotografías.
Diferencia Organelos membranosos y no membranosos.
Comprende las característica funcionales de los organelos
Conoce las correlaciones clínicas de enfermedades representativas de los
elementos celulares,mediante la búsqueda de información.

1. EJERCICIOS DE CORRELACIÓN

CON LA INVESTIGACIÓN DE LA PRÁCTICA 1 DESCRIBE BREVEMENTE CADA

TIPO DE MICROSCOPIOS Y COLOCA UN EJEMPLO DE CADA UNO.

2.-RESPONDE EL SIGUIENTE CUESTIONARIO:

1.-Enlista las diferentes localizaciones en que podemos encontrar el núcleo celular

2.-Enliste la diferentes formas del núcleo

3.-Diferencia entre eucromatina y heterocromatina

4.-Como esta formado el nucleolo

5.-Cuantos nucléolos poseen la mayoría de las células

6.-Que diferencia existe entre el contenido del material genético que reciben las
células que se dividen por meiosis y las que se dividen por mitosis

7.-Realiza un diagrama que muestre el cíclo celular.

8.-Realiza un diagrama que explique como se lleva a cabo el proceso de apoptosis

2.-Identificación de microfotografías de organelos celulares:

Observa las microfotografías siguientes. Describe que tipo de Microsopio se utilizo
en cada imagen. Describe el nombre del organelo,con una breve descripción de su
función
BIBLIOGRAFIA
PRACTICA No. 3
DIVERSIDAD CELULAR

I. COMPETENCIA: Observar y describir la estructura celular en distintos

organismos unicelulares y pluricelulares

II: FUNDAMENTO
Las células son estructuralmente complejas, pero es indispensable tener precisión
para regular y controlar las distintas funciones celulares. A pesar de las diferencias
en tamaños y formas, las células comparten similitudes en procesos básicos
(información genética, síntesis de proteínas, conversión de energía y estructura de
membranas), por tal motivo, aún las células de distintos organismos, las células
que conforman sus tejidos y los organelos dentro de éstas muestran una
estructura y apariencia común. A partir de las diferencias estructurales se
identificaron dos tipos de células: procariotas y eucariotas. Las células procariotas
son más pequeñas, carecen de núcleo, no tienen organelos membranosos
complejos, ni los asociados con la respiración, diferente proceso de división
celular, etc

III. INFORMACIÓN PREVIA. Investigar las características en común y diferencias

entre procariontes y eucariontes

IV. MATERIAL.
Microscopio
Papel seda
Aceite de inmersión
Colorantes: Giemsa, Acetorceina, azul de metileno, safranina, lugol
Barniz de uñas transparente
Solución fisiológica
Gotero
 Papel secante
Hoja de bisturí
Porta y cubreobjetos

Material proporcionado por alumno: Cada equipo podrá traer el material para
observar un tipo de célula específico:
A. Cebolla.
B. Hojas de Elodea.
C. Bacterias (cultivo proporcionado por el profesor)
D. Organismos en gota de estanque
E. Hongos
F. El académico podrá proporcionar laminillas con cortes histológicos de
tejidos humanos para visualizar diferentes celulares.

V. PROCEDIMIENTO.
A. Observación de células de cebolla.
1. Separar cuidadosamente la membrana de la cara interna de una de las
capas de la cebolla.
2. Cortar con la hoja de bisturí una porción que se colocará sobre el
portaobjetos
3. Añadir una o dos gotas de solución salina, colocar el cubreobjetos y
absorber con papel secante el exceso de líquido. Sellar inmediatamente la
preparación con barniz de uñas, dejar secar el barniz y llevar al
microscopio.
4. Realizar la primera observación en objetivo 5X, después en 10X,
documentar la organización celular. Posteriormente visualizar a 40 X y
documentar. La observación a 100X (con aceite de inmersión), permitirá
observar en algunas células movimientos de pequeñas vesículas que se
mueven por debajo de la pared celular en la periferia.
5. Hacer una segunda preparación (repetir todos los pasos anteriores), pero
en lugar de solución salina adicionar algún colorante (Azul de metileno o
safranina) dejar colorante por 3min y enjuagar con agua, sellar igualmente
con barniz y realizar las mismas observaciones.

B. Observación de células en hoja de Elodea.

1. En un portaobjetos deposite una hoja de elodea
2. Poner una gota de safranina, colocar un cubreobjetos, observar y
documentar con los objetivos de 10X y 40X.

C. Observación de células procariontes. Conseguir un cultivo bacteriano de

preferencia no patógeno (E. coli) y describir macroscoópicamente la
colonia. Posteriormente se preparará un frotis, se coloca una gota de agua
destilada estéril en el portaobjetos, se recolecta una colonia de medio sólido
y se mezcla, realizando un extendido uniforme. Se debe extender la gota
sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina. Debe
evitarse preparar un frotis demasiado grueso. Dejar secar las preparaciones
(frotis) a temperatura ambiente. Cuando se haya secado el frotis pasar el
portaobjetos por la llama del mechero con la capa del frotis hacia arriba, no
aplicar calor en forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la
estructura de los microorganismos que se van a teñir.
Observación A. Solución salina y colorante
1. Hacer un frotis de una colonia, colocar inmediatamente solución salina
isotónica. Colocar el cubreobjetos, absorber exceso de líquido y sellar con
el barniz de uñas.
2. Observar inicialmente con el objetivo 40X, se observan objetos refringentes.
3. Observar con objetivo 100X con aceite de inmersión, se observará la forma
y tamaño celular.
4. Realizar un segundo frotis, ahora tiñendo con un colorante. Observar con
los mismos aumentos y documentar.
Observación B. Tinción de Gram

1. Preparar frotis fijos (con calor) a partir de cada uno de los cultivos bacterianos
2. Agregar sobre la preparación cristal violeta durante 60 segundos.
3. Lavar con agua destilada
4. Añadir lugol durante 60 segundos.
5. Lavar con agua destilada
6. Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos.
7. Lavar con agua destilada
8. Agregar safranina durante 60 segundos.
9. Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión y con el objetivo
de 100X

D. Organismos en una gota de agua de estanque.

1. Colocar en un portaobjetos una gota del agua de estanque
2. Agregar una gota de solución salina isotónica, retirar el exceso de líquido y
sellar con barniz de uñas.
3. Observar con objetivo 10X para localizar microorganismos, posteriormente
cambiar al objetivo 40X y documentar, se observarán organismos en
movimiento.
4. Con el objetivo 100X se pueden observar organismo con flagelos y cilios.
Describir las estructuras y trayectorias de los microroganismos.

E. Observación de células fúngicas.

1. Realice la observación macroscópica de las colonias de hongos presentes
en su muestra
2. Colocar una gota (lo más pequeña posible) de lactofenol en el portaobjeto
 3. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente (aprox. 2cm). Poner la parte
adhesiva sobre la colonia en la muestra de vegetal, pan o tortilla con
hongos.
4. Colocar la cinta adhesiva sobre el colorante en el portaobjeto, esta actuará
como cubreobjetos.
3. Observar y documentar con los objetivos de 10X y 40X.

VI. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Discutir sobre las diferencias en tamaño y estructuras observadas, según
los tipos de organismos y objetivos utilizados.
¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los reactivos utilizados en
la técnica de coloración de Gram?
¿Qué importancia diagnóstica tiene la tinción de Gram?
¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los colorantes utilizados en
práctica?

VII. CONCLUSIONES

VIII. Bibliografía.
Practica 4
CONTEO CELULAR ,USO DE LA CÁMARA DE NEUBAUER.

Introducción

En “Biología Celular” es común trabajar en situaciones donde es necesario conocer el

número de células presentes en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan
cultivos celulares se precisa saber cuántas células se encuentran en un momento x (t1)
con respecto al número de células que inicialmente se sembraron (t0), o cuando se
requiere que un determinado número de células sean expuestas a tratamientos distintos y
ver sus efecto (tratamiento in vitro). En tales casos se requiere de un instrumento que
permita contar directamente, o bien, calcular la concentración celular en un medio.
Una alternativa a este problema es contar directamente el número de células presentes
en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si consideramos, por
ejemplo, a las células procariontes que miden generalmente menos de 10 µm (>1X10-6 m
o 1X10-3 mm o bien 0.010 mm) y por lo tanto se pueden encontrar muchas en un volumen
muy pequeño. No obstante, se cuenta con la cámara de Neubauer, la cual es un
instrumento muy útil que permite contar células de distintos tamaños.
El hemocitómetro (cámara de neubauer) tiene la apariencia de un portaobjetos grueso,
que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra grabada con
un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas (Figura 1). Esta cámara cuenta
también con un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos
compartimientos. Por último, la cámara de Neubauer se complementa con un
cubreobjetos cuyo grosor es mayor, también, que el de los cubreobjetos convencionales.
La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos se encuentra definida, así como el área
de la cuadricula en el portaobjetos; por lo tanto, es posible calcular el volumen contenido
en cada compartimiento de la cámara de Neubauer. De esta manera, es posible conocer el
volumen de muestra celular que se coloca en la cámara, ahora solo resta conocer el
número de células presentes en ese volumen[1]. Ver la Nota 1.

http://www.marienfeld-superior.com/index.php/334/articles/camaras-de-recuento.html

COMPETENCIA
  Que el estudiante conozca y realice un conteo celular con el uso correcto de una
cámara de Neubauer
 Que el estudiante realice los cálculos necesarios para estimar el número celular de
una suspensión celular

Habilidades y destrezas
Uso correcto de la cámara de Neubauer
Calculo correcto del número de células presentes en distintas diluciones de una
suspensión celular

Material
Microscopio de campo claro
Cámara de Neubauer
Cubreobjetos
Agua destilada
Micropipeta 250 μl

Método
Diluir en 100 mL de agua destilada un gramo de levadura seca comercial. Agitar hasta que
la muestra se vea homogénea.
Pipetear 100 μl de la muestra celular con una micropipeta y colocar en una muesca de la
cámara de Neubauer y permitir que la suspensión ingrese a la cámara por capilaridad.
Evitar que se formen burbujas.
Colocar la cámara en la platina de un microscopio de campo claro con iluminación Kohler y
utilizar el objetivo de 10X para localizar el cuadro central de la cámara. La cuadrícula que
se utiliza como guía para el conteo es la e 0,2 X 0,2 mm. Tener cuidado de no contar dos
veces la misma célula.
Para conocer el número de células en la muestra original realizar el siguiente cálculo: A X B
XC
Donde A= Células en la cámara
B= Factor de dilución
C= Factor de corrección (proporcionado por el fabricante de la cámara)
Considerar:
Que el área central de la cámara es de 1mm2. Esta área está subdividida en 25 cuadrados
pequeños (1/25 mm2); cada uno de los cuales está delimitado por líneas triples y con una
subdivisión de 16 (1/400 mm2).
Que generalmente la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.
El factor de corrección de 104 convierte 0,1 mm3 a 1 mL (0,1 mm3 = 1 mm2 X 0,1).
Mecanismos de evaluación
Para evaluar el desempeño del estudiante se debe considerar el uso adecuado del equipo
de laboratorio, los resultados obtenidos, el respeto al reglamento de laboratorio así como
la realización de las siguientes actividades:
1) Reporte escritos de la práctica
2) Problema: en una cámara de Neubauer se contaron 206 y 186 espermatozoides de una
suspensión celular diluida 1:50. Pregunta: ¿Cuál es el número de espermatozoides/mL en
la suspensión original?

Nota 1. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos puede cambiar en función del

fabricante; por lo tanto, también puede variar el volumen de la muestra contenida en los
compartimientos de la cámara. Lo anterior tiene dos implicaciones: 1) los cálculos que
deben realizar para conocer el número de células presentes en una muestra serán
distintos en función del fabricante de la cámara, y 2) siempre se deberá citar al fabricante
de la cámara y de ser posible también el modelo, con objeto de dar a conocer las
condiciones exactas del trabajo realizado.
Bibliografía
Jiménez L F y Merchant H.: Biología Celular y Molecular. Prentice Hall. 2003. México
Karp G.: Biología Celular y Molecular. McGraw-Hill Interamericana. 1996. México
Practica 5

AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA

POR CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD.

Introducción

La sangre periférica es la fuente primaria de obtención de células mononucleares

(linfocitos y monocitos). El proceso de separación de células mononucleares del resto de
los elementos formes de la sangre, se basa en la diferencia de densidad existente entre
ambos (Fig. 1).
Aislamos células mononucleares de sangre periférica o PBMCs (Peripherial Blood
Mononuclear Cells), utilizando un reactivo llamado Lymphoprep para crear un gradiente
de densidad.

Cuando ponemos la sangre sobre el Lymphoprep, y lo sometemos a centrifugación, se

separan las distintas especies celulares en función de su densidad. Si tenemos en cuenta que
los hematíes y los granulocitos (salvo los basófilos) tienen una densidad mayor a la del
Lymphoprep, éstos caerán al fondo. Por el contrario, las células mononucleares al tener
menor densidad, quedarán por encima del Lymphoprep. Las plaquetas tienen una densidad
menor que los monocitos, por lo que flotan con el plasma, en la parte superior del tubo.

La densidad del Lymphoprep es de 1.077 g/ml, y como podemos observar en el gráfico

(Fig. 1) no solo aislamos los linfocitos sino también basófilos y los monocitos, aunque la
parte más abundante es la de linfocitos que son los que nos interesan en esta práctica[2].

MUESTRA
Sangre total extraída por punción venosa, anticoagulada con heparina o EDTA. (1 ml
aprox. por alumno )

MATERIALES

- Pipetas Pasteur 3ml.

- Tubos 10ml.
- Guantes de látex

REACTIVOS

- Lymphoprep.
- PBS (ó RPMI)

Tiempo
1 hora

MÉTODO

1. NOS PONEMOS LA BATA Y LOS GUANTES

2. Diluir la sangre en una proporción 1:1 de tal forma que cojamos 3ml de sangre y 3ml de PBS en un
tubo de 10ml (o RPMI en condiciones de esterilidad).
3. Añadimos 3ml de Lymphoprep en un tubo de 10ml.
4. Añadimos en el tubo anterior la sangre diluida con la ayuda de una pipeta Pasteur, de modo que caiga
por las paredes del tubo con un flujo continuo. Para ello dejaremos resbalar la primera gota con el
tubo inclinado levemente para que sea más difícil que se mezclen las fases.
5. Centrifugamos durante 30’ a 2000 rpm (ó 900 g). La ecuación que relacione las rpm y las g es la
siguiente:
2
g = 11.17 x r (cm) x (rpm / 1000) r= radio del rotor de la centrífuga
1. Después de la centrifugación, observamos varias capas: (Fig. 2).

7. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, recogemos la nube de mononucleares con cuidado de no mezclar
las fases y de no coger Lymphoprep. OJO!!!!!!! Aspiramos con la pipeta previamente apretada antes
de introducirla en el tubo.
8. Llevamos las células a un tubo de 10ml y añadimos PBS hasta completar el tubo con el fin de lavar las
células y centrifugamos durante 10’ a 1400 rpm, para lavar y eliminar las plaquetas.
9. Decantamos el sobrenadante y resuspendemos en 1ml ó 2ml, según el tamaño del “pellet” o botón
celular.
10. Congelar el pellet a -20°C para su posterior uso.

EN CASO DE USAR EL MATERIAL PARA USOS SUBSECUENTES SE DEBERA TENER EN CUENTA:

En condiciones de esterilidad, esta técnica se realiza en cabina de flujo laminar, se suele utilizar medio de
cultivo RPMI al hacer la dilución, y los lavados suelen ser dos y también con el medio indicado. Esto es debido
a que en el medio de cultivo crecen muy bien los hongos que lo pueden contaminar (por ello suplementamos
el medio con antibiótico – antifúngico).
Practica 6
EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO CON FENOL/CLOROFORMO Y
PRECIPITACIÓN CON ALCOHOL.

Introducción

Es uno de los métodos más comúnmente usados y útiles para el aislamiento y concentración
de ADN y ARN a partir de soluciones acuosas, la extracción con fenol/cloroformo es
seguida por la precipitación con etanol. El fenol usado en este protocolo es amortiguado
para evitar que los productos oxidados del fenol dañen a los ácidos nucleicos. Se debe tener
cuidado ya que el fenol puede producir severas es cancerígeno, también puede provocar
quemaduras en la piel y puede dañar la ropa. En el método presentado se recomienda la
solución fenol/cloroformo (50/50%) para la extracción. En la mayoría de los casos, esta
mezcla provee una buena desnaturalización de las proteínas y una fuerte interfase entre la
fase acuosa y la fase orgánica. Si existe problema por la presencia de una gran cantidad de
espuma durante la extracción, se puede agregar alcohol isoamílico para obtener la siguiente
proporción fenol/cloroformo (50/49%) y alcohol isoamílico (1%).
Durante la precipitación con etanol, las sales y otros solutos como residuos de fenol y
cloroformo se mantienen en solución mientras que los ácidos nucleicos forman un
precipitado blanco que puede ser fácilmente colectado por centrifugación. Para una
eficiente precipitación, la concentración del ácido nucleico debe ser de al menos 10 µg/mL.
Concentraciones menores pueden ser precipitadas, pero la cantidad recuperada será muy
baja. Para facilitar la precipitación de concentraciones bajas de ácidos nucleicos, se puede
incubar el precipitado a -20°C por 4 horas o por toda la noche y centrifugar por 30 min[3,
4].

Obtención de ADN de hígado de células mononucleares de sangre periférica

Métodos

Obtención y lisis del órgano

1. Las células fueron obtenidas en prácticas anteriores.
2. Retirar el sobrenadante del pellet de células mononucleares.
3. Añadir al tubo de células mononucleares (1.5 ml); 400 µL de buffer de lisis (NaCl 150
mM, EDTA 100 mM, SDS 0.5 %)
4. Vortexear por 30 seg, o agitar fuertemente por 1 min.

Extracción de ADN con Fenol/Cloroformo

5. Agregar un volumen de fenol/cloroformo (50:50) igual al volumen inicial de la solución
(0.4 ml). Mezclar las fases con movimientos repetidos de inversión durante 10 seg.
6. Separar las fases en la microcentrífuga (12,000 rpm) por 2 min. La fase orgánica es la
que se ubica en la parte inferior del tubo debido a su mayor densidad, además de su
característico color amarillo.
7. En la parte superior se va a encontrar la fase acuosa. Con una micropipeta recuperar con
mucho cuidado esta fase acuosa, teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase. Nota: si
es posible no recupere toda la fase acuosa con tal de no contaminar la fase acuosa con la
fase orgánica.
8. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf-1.5 mL limpio. Evitar arrastrar parte de la
interfase y sobre todo no transferir nada de la fase orgánica.
Si se aprecia un precipitado blanco en la interfase se deben repetir los pasos 5-8 sobre la
fase acuosa recuperada.

Precipitación con isopropanol/etanol

9. Agregar un volumen de isopropanol igual del de la fase acuosa. Agitar brevemente por
inversión.
10. Centrifugar a max vel. 14,000 y después drenar el sobrenadante.
11. Agregar 1 volumen de etanol al 70% en agua, enfriado previamente en el congelador o
en hielo. Mezclar con vortex o por inversiones repetidas. Incubar en hielo por 10 min.
12. Precipitar el ácido nucleico por centrifugación a 14,000 rpm por 10 min. Si la muestra
es mayor a 10 µg, el precipitado puede ser visto como un pequeño punto blanco a un lado
de la parte más baja del tubo.
13. Con una micropipeta, drenar todo el líquido del tubo.
14. Para secar el precipitado, colocar los tubos bocabajo y abiertos sobre un papel secante
hasta que la totalidad del etanol se haya evaporado (15 min aprox).
15. Agregar 100 µL de agua bidestilada estéril y disolver el ADN mediante pipeteo suave.
Grandes cantidades de ácidos nucleicos son difíciles de resuspender, asegurarse de que el
ADN está completamente disuelto antes de continuar.
16. Congelar el extracto de ADN a -20°C para su posterior uso.

Comentario
Si la concentración del ácido nucleico es muy alta (más de 300 µg/mL) se puede formar un
precipitado visible sin necesidad de enfriar la muestra. Una vez que se forma un precipitado
visible, no es necesario enfriar la muestra, ni esperar para colectar este precipitado por
centrifugación[3, 4].

SOLUCIONES STOCK ó MADRE

NaCl 5 M
NaCl 29.225 g
Agua, cbp 100 ml
Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Almacenar a TA. Estable
indefinidamente

EDTA 0.5 M pH 8
Ácido etilendiaminotetracético, disódico 18.61 g
Agua 80 ml
Ajustar a pH 8
Agua, cbp. 100 ml
Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Estable indefinidamente a
TA.

SDS al 10%
SDS 10 g
Agua, cbp 100 ml
Disolver lentamente el SDS (grado electroforético) en 70 ml de agua, evitando la formación
de espuma y aforar. Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo.
Almacenar a TA. Estable indefinidamente. No es necesario filtrar

SOLUCIONES DE TRABAJO

Buffer de lisis (NaCl 150 mM, EDTA 100 mM, SDS al 0.5%)
NaCl 5 M 3 ml
EDTA 0.5 M pH 8 20 ml
SDS al 10% 5 ml
Agua cbp 100 ml
Guardar en un frasco de vidrio de 100 mL. Estable indefinidamente.
Practica 7
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE DNA POR
ESPECTROFOTOMETRÍA

Introducción

Cuando se trabaja con DNA es crucial saber exactamente cuánto DNA está presente en una
solución. Afortunadamente las concentraciones de DNA pueden ser medidas de forma
eficiente a través de espectrofotometría de absorbancia ultravioleta. La cantidad de
radiación UV absorbida por una solución de DNA es directamente proporcional a la
cantidad de DNA en la muestra. Usualmente la absorbancia es medida a 260 nm, a esta
longitud de onda una absorbancia (A260) de 1 corresponde a 50 mg de DNA de doble
cadena por ml. Mediciones de al menos 1 fl de una solución de DNA pueden ser llevadas a
cabo en espectrofotómetros diseñados especialmente para este propósito.
La absorbancia ultravioleta también puede ser usada para verificar la pureza de la
preparación de DNA. Con una muestra pura de DNA, el cociente de absorbancias a 260 y
280 nm (A260/A280) es 1.8. Cocientes menores a 1.8 indican que la preparación está
contaminada, ya sea con proteínas o con fenol [5].

Metodología

1. Hacer una dilución 1:50 con el ADN obtenido. Esto es; poner 4 µl de la muestra de ADN
en 196 µl de agua bidestilada estéril. Mezclar por pipeteo suave. Trasferir a la cubeta de
cuarzo ó añadir directamente 1 µl si se cuenta con un nanodrop.
2. Obtener la lectura de la solución blanco (100 µl de agua bidestilada ó 1µl si se cuenta
con nanodrop).
3. Colocar la cubeta de cuarzo con la muestra en el espectrofotómetro y leer la densidad
óptica a una longitud de onda de 260 nm ó 1 µl si se cuenta con un nanodrop.
4. Para calcular la concentración se debe considerar que 1 UA260 = 50 µg/µl de ADN. Hacer
los cálculos correspondientes para la lectura obtenida.
5. Si se desea evaluar la pureza de la muestra, tomar una segunda lectura a 280 nm.
Determinar la razón de las lecturas obtenidas a 260/280 nm. Si esta proporción es mayor a
1.75, la absorción observada es probablemente debida a ácidos nucleicos. Si esta
proporción es menor a 1.6, puede haber proteína u otros contaminantes (residuos de fenol u
otros componentes orgánicos) en la muestra. En este caso, se recomienda la reextracción
con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol.
TABLA DE MANIPULACIONES

M1. Diluciones para espectrofotometría

Equipo DNA (µl) agua(µl) Dilución
1 4 196 1:50
2 4 196 1:50
3 2 98 1:50
4 1:50

TABLA DE RESULTADOS

R1. Lecturas en el espectrofotómetro y concentración del ADN

DNA A260 A280 A260/A280 Concentración (µg/ml)
(diln 1:50) Lectura F Dilución Valor real
Equipo 1 50
Equipo 2 50
Equipo 3 50
Equipo 4 50

Referencias

1. Vega-Castillo LF. Manual de Practicas de Biología Celular: Universidad Autonoma

del Estado de México; 2013. 18 p.
2. Moreno R. LYMPHOPREP: Aislamiento de células mononucleares en sangre
periférica por centrifugación en gradiente de densidad. 2004.
3. MOLINA NB. Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos
de Giardia lamblia. Parasitología Latinoamericana. 2006;61.
4. Soto-Zárate CI. Manual de Practicas de Biología Molecular Universidad Nacional
Autonoma de México; 2016. 41 p.
5. Brown TA. Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction: Wiley-Blackwell; 2010.
320 p.
Práctica 8

AMPLIFICACIÓN DE UN GEN A TRAVÉS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE

LA POLIMERASA (PCR)

Introducción

En esta práctica, la PCR será usada para amplificar una región corta del cromosoma 17,
la cual corresponde a un gen muy importante en el control de calidad del DNA, el gen
BRCA 1. Mutaciones en el gen BRCA 1 (Breast Cancer 1) se han asociado con un
incremento en el riego de desarrollar cáncer de mama [6].
Las proteínas BRCA 1 y 2 juegan un papel muy importante en la reparación del DNA,
específicamente en el Sistema de Reparación de Recombinación Homóloga (HRR por sus
siglas en inglés). Se ha encontrado que en células deficientes de estos genes, el sistema
de HRR esta defectuoso, lo que hace que sistemas de reparación del DNA, de menos
fidelidad se activen, lo se considera que promueve en parte la carcinogénesis [6].

Esta es la parte de la secuencia del gen BRCA 1 (incluye el primer exón, son 3077 pb):
ATGGATTTATCTGCTCTTCGCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATGCTATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCCCATCTGGTAAGTCAGCAC
AAGAGTGTATTAATTTGGGATTCCTATGATTATCTCCTATGCAAATGAACAGAATTGACCTTACATACTAGGGAAGAAAAGACATGTCTAGT
AAGATTAGGCTATTGTAATTGCTGATTTTCTTAACTGAAGAACTTTAAAAATATAGAAAATGATTCCTTGTTCTCCATCCACTCTGCCTCTCC
CACTCCTCTCCTTTTCAACACAAATCCTGTGGTCCGGGAAAGACAGGGACTCTGTCTTGATTGGTTCTGCACTGGGGCAGGAATCTAGTTT
AGATTAACTGGCATTTTGGCTTTTCTTCCAGCTCTAAAACAAGCTCCATCACTTGAAATGGCAAAATAAAATCATGGATGAGGCCGAGGGC
GGTGGCTTATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGTAGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCCAACATG
GTGAAACCCCCTCTCCACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCGTAGTGGCATGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGG
AGAATCACTTGAACCAGGAGGCAGATGTTGCTGTGAGCCAATATGGCACCACTGAACTCCAGCGACAGAGCTAAACTCCATCTCAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAACATGGATGATCGGTGTCGTTGAGAGGATAGGTATTTGGAAGAACCTTTGTTTGAAACTGGCTCTGTACATACA
ATGAAATTACATACTTATTTACATACAATGAAATGCAGAGGTTTTTTTTTTATATAGGATCTCTGTCGAGAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTAT
CACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTCGTCAGGCTCAAGCAATCCTCCCACCTCAGCCTCCAGAGTAGCAGGGACGATAGGTGTGCACCAC
CATGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTTTTTCTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAGC
TCACTGCAAACTCTGCCTCCCGGGTTCATGCCATTCTTCTGCCTGAGCCTCCTGAATAGCTGGGACTACAAGCACCCACTACCACGCCCG
GCTAATTTTTTGTATTTTTTTTTCTTTTTTAGTAGAGGCGGGATTTCACCGTGTTAGCCAGGATAGTCTTGATCTCCTGACCTTGTGATCCAC
CCGCCTGGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGGCATAAGCCACTGCGTCCAGCCATTCTTGTATTTTTCTGTTGTAGAGATAGGGTTTTG
CTATGTTGGCCATGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAAGTGATCTACCCTCCCTTGGCCTCTCAAGGTGCTGGGATTACAGGCCTGAGCC
ATTGCACCCAGCCATGGTCTAAAAATCTTGATTGAAATACCACCTTTTCATTTCCAGACACCCCTATTTAAAATTACCACACCCCCAGCACA
CACTTTATCTTCTATTCCTGCTGCTTCTCCATAACACTGATTACTAGCTGACATTCTATGTAATGTATCCATTTTTTATCTCTAGTCCCACAGA
ATGTAAACTCCAGGATGGGATTTTTGTTTTGTTTACATACATCTGTATGTTCAGTAGTTAGAACGGTACTTGGGACCTAGTTGCCACTCAAT
AAACATTTGTCAAATAAATAATAAACTAAACTAAATTAGTTCTTTAATTTTTTTAAATATGGTGATGGTTAGTAGTGAGTAACATTCAAAAAATA
AGTTGAAAAGTTGTACCATTGCCTCTTACCCACAATAAAAAAGGGTAAATTCTTTTCTGCTTTATGAAAGTTGTTTTTCATATTTGAAGTCAA
GTTAATCAGATTAAGGAAAATGTATGTTGTGTTTTCAGAGCGATACAAGATTTATAAATAACCATCCTCTCCCTTGCCCTTCAACATTATAGC
TAAACAAAAATAAGAGGAAAACAGGATTCACAATTTATCAATTTATTGAAAATCAGAGCCAGAGAAGCAGGAAATGACATTGTAGGAAAAAA
CTGCTTTTGAAAAAGCACAAAACTTACTCATGACAATCAGTGATCAGGAAAATCCTCAATAGTGTGGCATTTGGATACATTTATGTTTCATTT
CCATGGGAGAGAGTCATAAAAATAGGATGTTCTTTCTCATTCTGGCAAATTAAACCATCAATTAAAAACTCAGATACATAAAAATTAAAGATG
TAAGAATGAAAATGCTAAATTGTTATTTTCAATCAACTATTATGTTTTCTAGCTTTTCATTGCTTTTTTCTGTTTCCTGTTAAGATTAATTTCTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGACTTTGGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTCGGCTCACTACAACCTCCAC
CTCCCGGGTTCAAGCAATTCTGCTGCCTCAGCCTCCGGAGTACCTGGGATTGCAGGCATGTGCCATCACACCAGCTAATTTTGTATTTTTA
GTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCAGGTTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCTCCTGCCTTGGCCTCCGAAAGTGCTGGG
ATTACAGGCGTGAGCCACCGCTCCCAGACTTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTTGAGACACGGTCTCGCTCTGCTGCCTAGGCTGGAGT
GCAGTGGCACGATCTTGGCTCACTGCCAGCTCCGCCTCCCGGGTTCAGGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACA
GGCGCCCACCACTATGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTAGCCAAGATGGTCTCGATCTCCTGACC
TTGTGATCCACCCGCCTCAGCCTTCCAAAGTGCTGGGATTACAGTCCTGAGCCACTGCGCCCGGCCTGGACCTTTTTTTTTCGGGGTGGG
GGGTTGGAGTCTGGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCCATCT

En esta práctica, utilizaremos 2 pares de primers o cebadores, el primer par flanquea

una región de 176 pb (pares de bases), y el segundo una región de 209 bp, dichos
fragmentos de DNA serán distinguidos después de realizar la electroforesis en gel de
agarosa (en la siguiente practica).
Primers a utilizar:

Nombre el Primer derecho Primer izquierdo Tamaño del

producto producto de PCR
BRCA1-176pb TTGCCATTTCAAGTGATGGA CTCCATCCACTCTGCCTCTC 176 pb

BRCA1-209pb CAGCCTCTCGACAGAGATCC CACTGAACTCCAGCGACAGA 209 pb

La muestra de DNA provendrá de varios de las células polimorfonucleares extraídas

en la práctica 3 cuyo DNA fue extraído en la practica 4 y cuantificado en la practica 5.
Para comparar las dos bandas amplificadas se correrán los productos amplificados en
un gel de agarosa, junto con un control negativo (control no amplificado), en la
siguiente práctica.
El control no amplificado no deberá presentar banda.

Reactivos
 Mezcla de reacción de PCR (kit)
o dDNTp
o DNA pol
o Buffer de reacción
o MgCl2
 Agua para biología molecular

Materiales y Equipo
Micropipeta de 1000 µl
Micropipeta de 200 µl
Micropipeta de 10 µl
Puntas azules, amarillas y blancas
Tubos eppendorf de 1.5 ml
Tubos Falcon de 15 ml
Tubos para PCR
Termociclador

Punto de inicio: Utilizar el DNA cuantificado en la práctica pasada, el cual quedo

guardado a -20°C.

2. Reacción de PCR
1. Identificar los tubos para PCR que se van a utilizar.
2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml, se prepara una mezcla de reacción común para
todas las reacciones que se van a realizar en un momento determinado. Usar la
siguiente tabla como un “checklist” al momento de agregar los reactivos. Usa una
punta nueva para cada reactivo.

Componente Concentración final 1 tubo (µl) 2.5 tubos (µl)

Buffer 10X 1X 5 12.5
MgCl2 25 mM 1.25 mM 2.5 6.25
4 dNTPs 5 mM 250 µM 2.5 6.25
Primer derecho BRCA1-176pb (50 1 ng/µl 2 5
ng/µl)
Primer izquierdo BRCA1-176pb (50 1 ng/µl 2 5
ng/µl)
Primer derecho BRCA1-209pb (50 1 ng/µl 2 5
ng/µl)
Primer izquierdo BRCA1-209pb (50 1 ng/µl 2 5
ng/µl)
Taq polimerasa (5 U/µl) 2.5 U/50 µl 0.5 1.25
DNA genómico proveniente de --- 1µl Solo se
células polimorfonucleares añadirá DNA
a un tubo, el
otro se
considera
control
negativo
Agua --- 34.5 86.25
Volumen total --- 49 343
Nota: los volúmenes dependen de las instrucciones de cada kit de PCR, ajustar de ser
necesario.
3. Cerrar firmemente cada uno de los tubos y colocarlos en el termociclador. Rechecar el
programa de amplificación y entonces presionar “Start”.
Nota: la programación depende de cada termiciclador, preguntar al encargado, cual programa
debe ser utilizado.

Programa del Termociclador

Ciclos Temperatura Tiempo
1 95°C 5 min
30 95°C (desnaturalización) 30 seg
58°C (Temp de alineamiento) 30 seg
72°C (temp. extension) 1 min
1 72°C 5 min
Mantener 4°C Indefinido

4. los productos de PCR se guardaran a -20°C hasta correrlos en un gel de agarosa.

Práctica 9

RESOLUCIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA GEL DE AGAROSA

Introducción

El resultado de una reacción de PCR o de una reacción de digestión de DNA es un número

de fragmentos de DNA, los tamaños de los cuales depende de la reacción de PCR o de la
posición de corte de la enzima de restricción. Una forma de determinar fácilmente el
número y el tamaño de los fragmentos es la electroforesis en un gel de agarosa. El hecho de
que una molécula de DNA fue cortada o no, puede sr determinado como se mencionó por
medio de electroforesis, ésta técnica fue desarrollada en la primera parte de la década de los
70´s [5].
La electroforesis, es una técnica que utiliza diferencias en la carga eléctrica para separar
moléculas en una mezcla. Las moléculas de DNA tienen carga negativa (debido a los
grupos fosfato), así que cuando son colocadas en un campo eléctrico migran hacia el
electrodo positivo llamado cátodo. La velocidad de migración de una molécula depende de
dos factores, su forma y su relación masa/carga. Desafortunadamente, la mayoría de las
moléculas de DNA son de la misma forma y todas tienen relaciones masa/carga similares.
Fragmentos de diferentes tamaños no pueden ser separados por electroforesis estándar.
El tamaño de las moléculas de DNA, si se vuelven un factor si la electroforesis se realiza en
un gel. Un gel que es usualmente hecho de agarosa, poliacrilamida o una mezcla de ambas,
la cual comprende una red compleja de poros, a través de la cual las moléculas de DNA
deben viajar para alcanzar el electrodo positivo. Las moléculas de DNA más pequeñas son
las más rápidas. Por lo tanto, el electroforesis en gel, separa moléculas de DNA de acuerdo
a su tamaño [5].
En la práctica la composición del gel determina los tamaños de las moléculas de DNA que
pueden separarse. Un grosor de 0.5 cm de 0.5% de agarosa, el cual tiene poros
relativamente largos, se usaría para moléculas en un rango de tamaño de 1 a 30 kb,
permitiendo, por ejemplo, moléculas de 10 a 12 kb ser claramente distinguibles. Al otro
extremo de la escala, un bloque muy delgado (0.3 mm) de 40% de un gel de poliacrilamida,
con poros extremadamente pequeños, seria usado para separar moléculas de DNA mucho
más pequeñas, en un rango de 1 a 300 pb, y podría distinguir moléculas que difieran en
largo de un solo nucleótido [5].
La migración del ADN a través del gel de agarosa depende sobre todo del voltaje; a un mayor
voltaje hay una tasa más rápida de migración. Sin embargo, los voltajes altos acentúan las
imperfecciones en el gel, tales como diferencias en la densidad y grosor entre las diferentes
partes del gel. Efectos comunes incluyen bandas inclinadas o en forma de U (“se sonríen”). El
efecto inclinado ocurre más frecuentemente en los bordes del gel, donde el gel líquido se
adhiere al molde para formar un menisco, haciendo los bordes del gel más gruesos que en el
centro. La resistencia está disminuida en los bordes más gruesos de los carriles externos,
permitiendo que las moléculas de ADN de estos carriles migren más rápido que moléculas de
ADN de tamaños similares de carriles internos. También el calor generado por voltajes altos
puede fundir el gel y cambiar sus propiedades de tamizado. Por estas razones se deben evitar
los voltajes superiores a 125 v en un sistema de minigel [4].
Tinción con bromuro de etidio y manejo responsable
El bromuro de etidio es el reactivo más rápido, sensible y reproducible para teñir DNA. Sin
embargo, tiene actividad mutagénica y carcinogénica. Así la tinción debe desarrollarse en un
área controlada y específica. El manejo responsable de la solución diluida de bromuro de
etidio (1 mg/ml) para teñir geles minimiza los riesgos inherentes.

Observación de geles teñidos

Los geles ya teñidos son observados en un transiluminador, el cual consiste de una lámpara de
luz ultravioleta que emite luz en el rango óptimo (260-360 nm) para iluminar a los geles
teñidos con bromuro de etidio. La transiluminación (i.e.; el paso de la luz a través del gel)
permite la mejor observación posible de las bandas de ADN.

Precaución: La luz ultravioleta (UV) puede dañar la retina de los ojos, por ello nunca se debe
mirar directamente a la luz UV sino con la protección adecuada.

Práctica de electroforesis en geles de agarosa

Preparación del gel

1. En un vaso de precipitado de 100 mL, pesar 450 mg de agarosa, posteriormente agregar 30
mL de TBE y permitir que se hidrate por 1 min. Nota: la cantidad de agarosa a preparar
dependerá de la cámara de electroforesis horizontal con la que contemos.
2. Calentar por 1 min en el horno de microondas (microondas usado exclusivamente para el
laboratorio). Se debe cuidar de que no se derrame de tal manera que debemos detener el
proceso antes de que suceda, dejar enfriar un poco, agitar con movimientos circulares y
continuar hasta completar el minuto.
3. Dejar enfriar sobre la mesa hasta que alcance unos 55°C (hasta que se aguante tocar el
matraz con la piel). Mientras tanto, preparar el molde de la cámara (si no se tiene un buen
sistema prefabricado, sellar los extremos del molde con cinta masking-tape). Una vez fría,
vaciar la agarosa fundida sobre el molde y colocar el peine en la posición correcta. Dejar que
la agarosa gelifique, lo cual se evidencia por que toma una tonalidad blanca opaca.
4. Retirar el peine y la cinta masking-tape, colocar el molde y el gel en la cámara de
electroforesis y llenar con TBE (400 mL aprox). Se debe verificar que el nivel alcanzado por el
TBE se encuentre aproximadamente 1 mm por arriba del gel.

Colocación de las muestras

5. Sobre un pedazo de Parafilm depositar 2 µl del buffer de carga-10X por cada una de las
muestras que se vayan a analizar (si no se tiene parafilm, usar un tubo de PCR por muestra).
Posteriormente colocar 5 µl de la muestra.
6. Mediante pipeteo suave mezclar la muestra con el amortiguador de carga. Tomar la
totalidad del volumen y con mucho cuidado depositarlo en el pozo correspondiente. Proceder
de la misma manera con las muestras restantes. Tomar registro del orden en el cual fueron
colocadas las muestra. De ser el caso colocar el marcador de peso molecular para DNA.

Condiciones de Electroforesis
7. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Tomar en cuenta que las muestras corren del
polo negativo (negro) hacia el positivo (rojo), de tal manera que se debe corroborar que el gel
esté bien orientado. Asimismo, cerciorarse de que dichos colores coincidan entre los cables y
las terminales de la fuente de poder al conectarlos. Encender la fuente de poder, seleccionar
90 voltios y presionar el botón para iniciar la corrida. Permitir que corra por el tiempo
adecuado para que el frente de corrida (banda azul) llegue al borde del gel, para una
separación máxima, sin que se nos salgan las muestras.

Visualización del gel

8. Después de que transcurra el tiempo de corrida, sumergir el gel por 20 min en una solución
de Bromuro de Etidio. Nota: Al realizar este paso tomar la precaución de usar guantes de látex
ya que este reactivo tiene propiedades mutagénicas.
9. Con mucho cuidado regresar el bromuro de etidio al frasco. Enjuagar con agua corriente y
llevar al transiluminador. Nota: si no se tiene transiluminador usar una lámpara UV.
10. Si es posible tomar una fotografía para documentar la corrida.
11. Al final, realizar la limpieza del transiluminador con etanol.

SOLUCIONES DE TRABAJO

TBE
Solución stock 5X (en nuestro caso se comprara ya preparado, con una concentración 10X):
Tris base 54.0 g
Ácido bórico 27.5 g
EDTA dihidratada 3.72 g
Agua destilada, cbp. 1000 ml

Punto de Paro: El gel se puede guardar en una bolsa de plástico, sumergido en buffer y a 4° C,
así permanecerá en buenas condiciones por varios días.

Referencias

1. Vega-Castillo LF. Manual de Practicas de Biología Celular: Universidad Autonoma del

Estado de México; 2013. 18 p.
2. Moreno R. LYMPHOPREP: Aislamiento de células mononucleares en sangre periférica por
centrifugación en gradiente de densidad. 2004.
3. MOLINA NB. Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos de
Giardia lamblia. Parasitología Latinoamericana. 2006;61.
4. Soto-Zárate CI. Manual de Practicas de Biología Molecular Universidad Nacional Autonoma
de México; 2016. 41 p.
5. Brown TA. Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction: Wiley-Blackwell; 2010. 320 p.
6. Burgess M, Puhalla S. BRCA 1/2-Mutation Related and Sporadic Breast and Ovarian
Cancers: More Alike than Different. Front Oncol. 2014;4:19. Epub 2014/03/01. doi:
10.3389/fonc.2014.00019. PubMed PMID: 24579064; PubMed Central PMCID: PMCPMC3936197.
 PRACTICA No. 10
CICLO CELULAR: MITOSIS

I. OBJETIVOS: Comprender los cambios que ocurren durante el ciclo celular

y observar las diferentes etapas del proceso de división celular (mitosis) en
células de cebolla y observar los cromosomas humanos en laminillas con
cortes histológicos.

II: FUNDAMENTO
Dentro de los procesos fundamentales que realiza una célula se encuentra el
de la reproducción, función que le permitirá preservar su información genética
en nuevas generaciones. Durante este proceso, la molécula que almacena la
información que define ese organismo, el ADN; debe ser duplicado y
asegurándose que los dos núcleos reciban la información exacta. Esta serie
de eventos, se agrupan en el proceso denominado ciclo celular, y comprende
5 fases: la fase S (duplicación del ADN) y que se reparta exactamente en los
dos núcleos (mitosis) en la fase M (re arreglo estructural del citoplasma y
nuclear), la fase G1 y G2 anteceden a la replicación del DNA y mitosis
respectivamente, y ocurren procesos reguladores del ciclo celular y procesos
metabólicos, y finalmente la citocinesis.

III. INFORMACIÓN PREVIA.

Investigar los cambios moleculares y estructurales que se presentan durante

el ciclo celular. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la colchicina?
Investigar los tipos y numero de cromosomas que tienen las células humanas
IV. MATERIAL
Microscopio
Papel seda
Aceite de inmersión
4 vidrios de reloj
1 mechero
1 pinza de disección
1 aguja de disección
2 pipetas graduadas de 5 ml
3 ml de colchicina al 0.1%
40 ml de acetorceína.
Navaja o bisturí
Cubreobjetos y portaobjetos

Indispensable que el alumno traiga lo siguiente:

2 cebollas con raicillas nuevas y frescas. Para lo cual deberá colocar la
base rugosa de la cebolla en un frasco o vaso de agua hasta sumergirla,
cambiando el agua cada 24hrs. Sin maltratar las raicillas.

V. PROCEDIMIENTO.

1.Sacar la cebolla del agua, cortar aproximadamente 2 mm de la punta de

las raicillas (área más obscura), dividirla en dos partes en vidrios de reloj.
2.En uno de los vidrios de reloj, agregar 3 ml de la solución de colchicina
al 0.1%, y mantenerlas ahí durante 1 hora.
3.En el otro vidrio de reloj adicionar agua destilada por el mismo tiempo.
4.Al finalizar el tiempo poner las raíces en vidrios de reloj limpios,
procurando etiquetar adecuadamente para no confundirlos, adicionar 4ml
de acetorceina, calentar con el mechero a flama suave (se observa color
azul) hasta que comience a salir un poco de vapor, evitar quemar las
raicillas adicionando más colorante, dejar enfriar y repetir dos veces más,
adicionando 4ml de colorante cada vez.
5.Tomar una de las raíces y colocarla en un cubreobjetos limpio, agregar
una gota de acetorceina, colocar el cubreobjetos, presionar con la goma
de un lápiz girando el cubreobjetos sin romperlo.
6.Limpiar el exceso de colorante con un papel absorbente.
7.Observar con el objetivo 40X y determinar el índice mitótico en las
raíces con y sin colchicina*
*El índice mitótico se calcula revisando 100 células, y determinando la
proporción de estas que este en mitosis.
1.Tratar de observar células en las diferentes fases de la mitosis, y contar
cromosomas si es posible.
2.Observar las laminillas de cromosomas humanos (proporcionada por el
profesor) a 10X, identificar metafases, observar con el objetivo 100X con
aceite de inmersión. Tratar de contarlos.

VI. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Responder lo siguiente: ¿Cuál fue el índice mitótico y número de células
en mitosis en las raicillas con y sin colchicina?
Realizar esquemas de las fases de mitosis observadas.
¿Qué es un agente mitógeno y un mitostático? ¿cuál es el mecanismo de
acción de un agente mitógeno y de uno mitostático?
¿Cuál es la diferencia entre la mitosis y meiosis?
¿Cuál es la relevancia del estudio de cariotipo en células humanas?
VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA.

Bilogía Celular y Molecular Conceptos y experimentos. Gerald Karp. 5ta

Ed.2009, McGraw-Hill
Manual de prácticas de laboratorio Biología Celular. Yvonne Ducolomb y
cols. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa.
Biología Celular y Molecular. Luis Felipe Jiménez García y Horacio
Merchant Larios. Pearson Education