Microbios e infecciones emergentes (2013) 2, e20; doi: 10.1038 / emi.2013.

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2013 SSCC. Todos los derechos reservados 2222-1751 / 13

www.nature.com/emi

ARTÍCULO ORIGINAL

Prevalencia y caracterización de virus de influenza en

diversas especies en Los Llanos, Colombia
Erik A Karlsson 1, *, Karl Ciuoderis 2, *, Pamela J. Freiden 1, Bradley Seufzer 1, Jeremy C Jones 1, Jordan Johnson 1,
Rocio Parra 3, Agustín Góngora 3, Darío Cárdenas 4, Diana Barajas 4, Jorge E Osorio 2 y Stacey Schultz-Cherry 1

Si bien se sabe mucho sobre la prevalencia de los virus de la influenza en América del Norte y Eurasia, se desconoce en gran medida su prevalencia en aves
y mamíferos en América del Sur. Para llenar esta brecha de conocimiento y proporcionar una línea de base para futuros estudios de ecología y
epidemiología, llevamos a cabo 2 años de vigilancia de influenza en la región de los llanos orientales (Los Llanos) de Colombia. La reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR) identificó los virus de la influenza en aves silvestres, aves de corral domésticas, cerdos y
caballos. La prevalencia osciló entre el 2,6% y el 13,4% entre las especies. Los cerdos mostraron la prevalencia más alta y se infectaron principalmente con
virus pandémicos H1N1 (pH1N1) de 2009 relacionados genéticamente con los de los seres humanos. Además, aislamos virus H5N2 de dos especies
residentes de patos silbadores (género Dendrocygna) que difería completamente de los aislados anteriores de América del Sur, y en cambio se asemejó
genéticamente a los virus de aves silvestres de América del Norte. Ambas cepas causaron baja patogenicidad en pollos y mamíferos. La prevalencia y
diversidad de subtipos de virus de influenza aislados de diversas especies dentro de una pequeña área de Colombia resalta la necesidad de una mejor
vigilancia en toda Sudamérica, incluido el monitoreo de la potencial transmisibilidad de los virus H5N2 de baja patogenicidad de aves silvestres a aves
domésticas y la aparición de virus reagrupados en cerdos domésticos.
Microbios e infecciones emergentes ( 2013) 2, e20; doi: 10.1038 / emi.2013.20; publicado en Internet el 24 de abril de 2013

Palabras clave: Colombia; H1N1; H5N2; influenza; pandemia; Evaluación de riesgos; reordenamiento; vigilancia

INTRODUCCIÓN No se han realizado estudios de la prevalencia de virus de influenza en animales

Los brotes de virus de influenza A causan morbilidad y mortalidad en mamíferos
y aves en todo el mundo. Aunque sigue siendo difícil prevenir o incluso predecir
nuevos brotes de influenza, la vigilancia en animales y aves puede facilitar el
reconocimiento temprano de nuevas amenazas. 1 Dado el número de virus únicos
que emergen de animales y aves, los esfuerzos de vigilancia deben incluir una
gama diversa de animales salvajes y domésticos. 2
Si bien existen amplios esfuerzos de vigilancia de la influenza en muchas partes del mundo,
la prevalencia y diversidad de los virus de la influenza en América del Sur sigue siendo en gran
parte desconocida, especialmente en Colombia. 2
domésticos o aves silvestres en Colombia. Por lo tanto, llevamos a cabo un
estudio de vigilancia de 2 años en la región de los Llanos de Colombia, una
sabana neotropical en la cuenca del río Orinoco. Esta sabana es considerada una
de las praderas tropicales más ricas del mundo; cuenta con numerosos
ecosistemas que brindan hábitat a una gran cantidad de aves residentes y
migratorias y diversas especies agrícolas. 9 La prevalencia de los virus de la
influenza en diversas especies dentro de una pequeña área de Colombia destaca
la necesidad de una mejor vigilancia en toda Sudamérica, incluido el monitoreo
de la posible transmisión de virus H5N2 de baja patogenicidad de aves silvestres

el segundo país con mayor diversidad biológica y hogar de aproximadamente el a aves de corral domésticas.

10% de las especies del mundo. 3,4 La biodiversidad de Colombia refleja sus
variados ecosistemas, que incluyen selvas tropicales, bosques nubosos costeros y
sabanas abiertas. Colombia también tiene avifauna diversa, que incluye más de
1800 especies residentes; Además, su ubicación en tres rutas migratorias
principales lo convierte en un sitio de escala para aproximadamente 180 especies
de aves migratorias. 5,6 Los humedales colombianos proporcionan hábitat para al
menos el 98,3% de las aves acuáticas migratorias y el 57% de las aves acuáticas
residentes en el país. 7 Además, Colombia tiene industrias activas de cerdos y aves
de corral que incluyen la cría doméstica y los mercados de animales vivos, lo que
proporciona el escenario óptimo para la mezcla de aves silvestres y animales
domésticos.
Con la excepción de un informe de infección por influenza aviar H9N2 en parvadas
asintomáticas de pollos de engorde en Tolima a mediados de la década de 2000, 8 allí tienen
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de vigilancia y recolección de muestras
Todas las actividades de muestreo fueron realizadas o supervisadas por
veterinarios capacitados y aprobadas por el Comité Institucional de Uso y
Cuidado de Animales del St Jude Children's Research Hospital. El estudio se
realizó entre 2010 y 2012 en la región de Los Llanos de Colombia, en un radio de
90 km alrededor de Villavicencio (coordenadas N04 6 04'23.3 '' y W73 6 34'54.8 '') en
la provincia de Meta (Figura 1). Las muestras se recolectaron con hisopos
estériles de poliéster de un solo uso y se almacenaron por separado en crioviales
de plástico individuales que contenían 1 ml de solución salina tamponada con
fosfato con 50% de glicerol, penicilina 10000 UI / ml, estreptomicina 5 mg / ml,
gentamicina sulfato 1 mg / ml, sulfato de kanamicina 700 metro g / mL y

1 Departamento de Enfermedades Infecciosas, Hospital de Investigación Infantil St Jude, Memphis, TN38105, EE. UU.; 2 Departamento de Ciencias Patobiológicas, Facultad de Medicina Veterinaria de
la Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706, EE. UU.; 3 Grupo GIRGA, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de los Llanos, Villavicencio 500001, Colombia y 4 Universidad
Cooperativa de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria, Villavicencio 500001, Colombia
* Estos autores contribuyeron igualmente a este
trabajo. Correspondencia: S Schultz-Cherry,
Correo electrónico: Stacey.Schultz-cherry@stjude.org
Recibido el 4 de febrero de 2013; revisado el 5 de marzo de 2013; aceptado el 11 de marzo de 2013
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2
Villavicencio
Figura 1 Ubicación geográfica de los sitios de muestreo en Colombia. Los puntos de color corresponden a los sitios de muestreo en cada ubicación en la provincia de Meta. El recuadro más pequeño
muestra la región de los Llanos. rojo 5 Puerto Lopez, verde 5 Pachaquiaro, amarillo 5 Villavicencio y naranja 5 Ariari.
anfotericina B 10 metro g / ml (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EE. UU.). Las muestras
se almacenaron en hielo a 4 6 C durante un máximo de 2 días antes del almacenamiento
a largo plazo en 2 70 6 C.
Pájaros salvajes. Se recolectaron dos mil trece muestras fecales de aves silvestres
en nueve sitios dentro de 4 áreas que representan diferentes ecosistemas,
hábitats y paisajes: (i) piedemonte o sabana de ladera del pie; (ii) llanuras; (iii)
humedales; y (iv) arrozales. Se seleccionaron puntos de muestreo específicos
dentro de cada uno de los nueve sitios de acuerdo con los siguientes criterios: (i)
registros de presencia de aves acuáticas residentes y migratorias; (ii) la presencia
de áreas de descanso o alimentación para grupos o bandadas de aves silvestres;
e (iii) interacciones entre humanos, aves silvestres y animales domésticos. Se
tomaron muestras de cada sitio al menos dos veces al año.
Aves de corral domésticas. Se recolectaron mil ciento ochenta y ocho
hisopos cloacales y muestras fecales como se describió anteriormente. 10,11
de aves de corral domésticas en 11 sitios de muestreo que incluyeron operaciones de
aves de corral de traspatio, pequeñas granjas y mataderos. Cada sitio fue muestreado al
menos una vez al año.
Caballos. Se recolectaron 220 hisopos nasofaríngeos de caballos en siete sitios de
muestreo, incluidas granjas y establos, como se describió anteriormente. 12 Se tomaron
muestras de cada sitio al menos una vez al año.
Cerdo. Se recolectaron seiscientos setenta y ocho hisopos nasofaríngeos de
cerdos en cinco sitios, incluidas granjas y mataderos, como se describió
anteriormente. 11,13 Se tomaron muestras de cada sitio al menos una vez al año.
Detección y aislamiento de virus
Se extrajo ARN viral de 50 metro L muestras en un procesador de partículas
magnéticas Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE. UU.)
Utilizando el kit de aislamiento de ARN viral Ambion MagMAX-96 AI / ND
(Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EE. UU.). ARN
Microbios e infecciones emergentes
Medellin
Bogota
Villavicencio
Colombia
se evaluó mediante el uso de un sistema de detección de PCR en tiempo real
Bio-Rad CFX96 en un termociclador C1000 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.), con
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.
) y cebadores / sonda específicos para el gen de la influenza M (CDC, Atlanta, GA,
EE. UU.). 14 Las muestras con un valor umbral de ciclo de fluorescencia de 40 se
consideraron positivas. Se hicieron esfuerzos para aislar el virus de todas las
muestras positivas para la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
inversa (RT-PCR) en tiempo real en huevos de gallina embrionados o en cultivo
celular, como se describió anteriormente. 15,16 Los títulos de virus se determinaron
mediante el método de Reed y Munch. 17 sobre la base del 50%
dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID 50) en células de riñón canino
Madin-Darby (MDCK) o en la dosis infecciosa de huevo al 50% (EID) 50).
Secuenciación y análisis filogenético
La transcripción inversa del ARN viral de la muestra original, seguida de
PCR con cebadores específicos (secuencias de cebadores disponibles a
pedido) para cada segmento de gen, se realizó como se describió
anteriormente. 18 La secuenciación de Sanger fue realizada por el St Jude
Hartwell Center y las secuencias se alinearon utilizando los programas
ClustalW y Bioedit. 19,20 Los ocho segmentos de genes se analizaron
filogenéticamente sobre la base de sus secuencias de nucleótidos. El
análisis filogenético utilizó el software MEGA versión 5.05 con el método de
unión de vecinos, modelo de dos parámetros de Kimura. 21 Las cepas de
virus se agruparon sobre la base de nucleótidos, y solo se utilizaron grupos
dominantes para inferir relaciones filogenéticas. Las secuencias de
nucleótidos obtenidas en este estudio están disponibles en Genbank con
los números de acceso KC703309 a KC703350.
Células
Las células MDCK se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (GibcoInvitrogen, Carlsbad,
CA, EE. UU.) Suplementado con glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10% (Gemini
BioProducts, West Sacramento, CA, EE. UU.)
EE. UU.) Y se cultivó a los 37 6 C en 5% CO 2. Epitelio bronquial humano
primario normal (NHBE) bien diferenciado (resistencia transepitelial .1000)
 Prevalencia de virus de influenza en Colombia
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Las células se adquirieron de MatTek Corp. (Ashland, MA, EE. UU.), se mantuvieron mediante
lavado diario con cloruro de sodio al 0,9% y se incubaron a temperatura ambiente.
interfaz aire-líquido a 37 6 C y 5% CO 2. Las superficies basales permanecieron en
contacto con el medio de crecimiento AIR 100 (MatTek Corp.), que fue
reemplazado cada 24 h.
1 5 enfermo, 2 5 gravemente enfermo, 3 5 muertos) de acuerdo con el Manual de la
Organización Mundial de la Salud sobre Diagnóstico y Vigilancia de la Influenza. 23 El
IVPI se calculó a partir de la puntuación media y se utilizó para asignar uno de los
tres índices de patogenicidad: altamente patógeno, no patógeno o intermedio. 24 Para
determinar la diseminación del virus y la patogenicidad después de la inoculación
por vías naturales, pollos libres de patógenos específicos de 8 semanas ( norte 5 5

In vitro replicación de virus por grupo) fueron infectados por vía intraocular, intranasal

Las células MDCK se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 durante 1 hora e inoculación intratraqueal con 10 6 EID 50 de virus en un volumen de
a 37ºC. 6 C.Las células se lavaron tres veces para eliminar el virus no unido y se cultivaron en un 0,5 ml y se controlan diariamente para detectar signos clínicos de infección. Para evaluar

medio apropiado que contenía albúmina de suero bovino al 0,075% y 1 metro g / ml de tripsina Se recolectaron muestras de excreción de virus, cloaca y tráquea de todas las aves cada

tratada con L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona. Se recogieron alícuotas de sobrenadantes 48 h durante 12 días. Los hisopos se almacenaron en medio de transporte viral de 1 ml

de cultivo a las 24 y 48 h después de la infección (pi) y se almacenaron inmediatamente a (cloacal) o 0,5 ml (traqueal) a –70 6 C para titulación de virus en huevos.

- 70 6 C. Para la infección de células NHBE, se eliminó el medio basal y se análisis estadístico

reemplazó con medio águila modificado de Dulbecco. La superficie apical Los datos experimentales se analizaron utilizando el software estadístico JMP (SAS Institute,
se lavó dos veces y se incubó con medio de águila modificado de Dulbecco Cary, NC, EE. UU.) Y el paquete de software estadístico en Prism (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.).
sin suero fresco que contenía virus durante 2 ha 37ºC. 6 C, después de lo cual
Los datos no paramétricos se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los datos
se extrajo tanto el medio apical como el basal y se añadió medio de
distribuidos normalmente se analizaron mediante ANOVA bidireccional con el virus y el día
crecimiento fresco a la cámara basal. A las 6, 24, 48, 72 y 96 hpi, se añadió
posterior a la infección como efectos principales. Estudiantes t- se utilizó la prueba para post hoc comparación
medio águila modificado de Dulbecco a la superficie apical y el cultivo se
incubó durante 30 min a 37ºC. 6 C. El medio se recogió y se almacenó a –80 6 C de grupos. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en
para titulación de virus.
PAG, 0,05 ( a 5 0.05 fue seleccionado prospectivamente).
Para determinar si la ubicación o las condiciones estacionales / climáticas
Experimentos con animales afectaron la prevalencia viral dentro de cada especie, agrupamos los sitios
Todos los experimentos y procedimientos fueron aprobados por el Comité de de vigilancia en cuatro ubicaciones generales (Villavicencio, Ariari, Puerto
Uso y Cuidado de Animales del St Jude Children's Research Hospital. López y Pachaquiaro) y establecimos dos períodos, estación seca
(diciembre-marzo) y estación lluviosa. (Abril-noviembre), sobre la base de
registros climáticos históricos (temperatura media, precipitaciones y
Ratones. Ratones hembra BALB / c de seis a ocho semanas de edad ( norte 5 10; Jackson
humedad relativa de los últimos 20 años, publicados por el Instituto de
Laboratory, Bar Harbor, ME, EE. UU.) Fueron anestesiados ligeramente con iso-
Estudios Meteorológicos y Ambientales de Colombia). La prevalencia viral
flurano e inoculado intranasalmente con 10 5 TCID 50 de virus en 25 metro Solución salina tamponada con
se comparó entre especies mediante el uso de Pearson X 2 prueba o prueba
fosfato L. Los ratones fueron monitoreados diariamente para detectar signos clínicos.
de comparación múltiple de Tukey en Excel 2007 (Microsoft Corporation,
de infección 22 y se pesó cada 48 h. En diferentes momentos, se sacrificaron tres
Redmond, WA, EE. UU.). Las diferencias se consideraron estadísticamente
ratones y se recolectaron tejidos. El lóbulo pulmonar grande se lavó y se
significativas en PAG, 0,05.
almacenó inmediatamente en formalina tamponada al 10% para análisis
histológico. El lóbulo restante y los tejidos extrapulmonares se homogeneizaron
en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato para la titulación del virus. RESULTADOS

Prevalencia de virus de influenza en la región de los Llanos de Colombia

Pollos. Crías de leghorn blanco de un día ( norte 5 10; Charles Rivers, Wilmington, Durante 2010-2012, recolectamos más de 4000 muestras de hisopos de caballos, cerdos,
MA, EE. UU.) Recibieron alimentos y agua ad libitum y criado en condiciones aves domésticas y aves silvestres en varios sitios dentro de la región de los Llanos
específicas libres de patógenos durante 8 semanas antes de su uso. Para (Figura 1) y analizamos el ARN en las muestras mediante RT-PCR en tiempo real. Como
determinar el índice de patogenicidad intravenosa (IVPI), pollos de 8 semanas ( norte se muestra en la Tabla 1, el 13,4% de los cerdos, el 4,1% de los caballos,
5 5 por grupo) se inocularon por vía intravenosa con una dilución 1:10 de virus El 3,6% de las aves silvestres y el 2,6% de las aves de corral analizadas resultaron positivas para la

cultivado en huevo en un volumen de 100 metro L.Los animales fueron influenza. La proporción de muestras positivas difirió significativamente por especie, ubicación e incluso

monitoreados por signos de enfermedad durante 10 días y puntuados (0 5 sano, temporada de recolección ( PAG, 0,05). El Villavicencio

Tabla 1 Prevalencia de influenza por especie

Anfitrión (nombre científico) Número examinado Número positivo Porcentaje positivo Número subtipado

Aves de corral

Pollo ( Gallus gallus domesticus) 1003 28 2,79

Pato real Cairina moschata) 12 0 0
Codorniz japonesa Coturnix japonica) 84 1 1,19
Ganso doméstico Anser anser domesticus) 2 0 0
Pato doméstico Anas platyrhynchos domestica) 87 2 2.30
Total 1188 31 2,61
Caballo
Caballo ( Equus ferus caballus) 220 9 4.09
Cerdo
Porcino Sus scrofa domesticus) 678 91 13.42 33
Ave silvestre

Varias especies 2013 73 3,63 2

Microbios e infecciones emergentes

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EA Karlsson et al
4

A / Ankara / 21/2009 (GU369665.1)

A / Distrito de Columbia / INS47 / 2009 (CY083862.1) A /
A DECIR AH
Nueva York / 2598/2010 (CY062114.1)
A / Wisconsin / 629-D02448 / 2009 (CY057902.1)
A / swine / Colombia / 1/2011
A / swine / Colombia / 2/2011
A / Singapore / GP4007 / 2009 (CY123213.1)
A / Kenya / 139/2011 (JQ396236.1)
A / swine / Colombia / 3/2011
A / swine / Colombia / 4/2011
A / San Diego / INS14 / 2009 (CY083838.1)
A / Chile / 19/2010 (CY092960)
A / Bogotá / WRAIR0435N / 2009 (CY083064)
A / Bogotá / WRAIR0442T / 2009 (CY083088)
A / La Paz / WR0096T / 2009 (CY049851)
A / porcino / lowa / 00935/2005 (CY082037.1)
A / porcino / Costa Rica / 000125-14 / 2010 (JF279888)
A / California / 04/2009 (JF915184.1)
A / swine / 4 / Mexico / 2009 (CY053645)
A / swine / 4 / Mexico / 2009 (CY053645.1)
A / Chile / 1598/2009 (CY075179)
A / Singapore / ON202 / 2009 (CY123717.1)
A / Argentina / 19618/2009 (HM569683)
A / Lima / WRAIR9202F / 2009 (CY083615)
A / Argentina / 19527/2009 (HM569675)
A / Bogotá / 0466N / 2009 (CY044147)
A / cerdo / Carolina del Norte / 00839/2005 (CY099151)
A / Bogotá / WRAIR0088N / 2009 (CY069309)
A / Perú / WRAIR1377P / 2007 (CY070120)
A / Brisbane / 59/2007 (CY058487.1)
A / swine / Minnesota / 01146/2006 (CY099035.1)
A / Perth / 10/2010 (CY121496.1)

A / swine / Colombia / 4/2011

A / Singapore / GP3667 / 2010 (JX309668.1)

B N/A
A / Guangdong / 427/2010 (CY120943.1)
A / swine / Colombia / 3/2011

A / swine / Colombia / 1/2011

A / Missouri / NHRC0001 / 2011 (CY092419.1)

A / Bogotá / WR0090N / 2009 (CY050088.1)

A / Bogotá / WRAIR0435T / 2009 (CY083074.1)

A / California / 04/2009 (JF915186.1)

A / swine / 4Mexico / 2009 (CY053647.1)

A / swine / Colombia / 2/2011

A / Colombia / 08/2009 (GQ200277.1) (Parcial)

A / Bogota / 176/2009 (GQ200274.1) (Parcial)

A / swine / North Carolina.18161 / 2002 (CY098518)

A / Bogotá / WRAIR0088N / 2009 (CY069311.1)

A / Medellín / WRAIR1297P / 2008 (CY100878.1)

A / Brisbane / 59/2007 (CY058489.1)

A / swine / Minnesota / 00709/2005 (CY099063.1)

A / Perth / 10/2010 (CY121498.1)

A / Bogotá / WRAIR03457T / 2010 (CY093417.1)

0,1

Figura 2 Árboles filogenéticos de la HA ( A) y NA ( B) genes de virus de influenza aislados de cerdos en la región de los Llanos de Colombia. Los árboles se generaron utilizando el método de unión de
vecinos en el software MEGA. Los árboles se basan en secuencias genéticas completas de los virus H1N1 pandémicos representativos (rojo), H1N1 porcino clásico (amarillo), H1N1 humano
estacional (verde) y H3N2 (azul) humano y porcino estacional. Los aislados de cerdos se muestran en cursiva negra. Una cepa arquetípica de H1N1 pandémica de 2009 (A / California / 04/2009) se
muestra en rojo. Las barras de escala representan el número de sustituciones por sitio.

Microbios e infecciones emergentes

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5

región tuvo la tasa más alta de muestras positivas (6.3%, norte 5 2389), seguido de
diseminando virus pH1N1 y H3N2 reagrupados como los que se encuentran
Puerto López (5,0%, norte 5 378), Ariari (2,9%, norte 5 382) y Pachaquiaro (2,53%, norte
5 949). Las muestras recolectadas durante la temporada de lluvias (abril a
octubre, 6,9%) tenían una probabilidad significativamente mayor de ser positivas
que las recolectadas durante la estación seca (noviembre a marzo, 2,9%) ( PAG, 0,05). Aislamiento del virus de la influenza H5N2 de patos silbadores
La mayoría de los hisopos positivos para caballos se recolectaron en una granja
en la región de Ariari, mientras que la mayoría de los hisopos positivos para
cerdos y aves de corral se recolectaron en un matadero en la región de
Villavicencio. Este matadero compra regularmente animales de granjas en toda la
provincia, lo que limita nuestra capacidad para identificar el origen de los
animales positivos. La mayoría de las muestras de aves de corral positivas
procedían de pollos domésticos ( Gallus gallus domesticus, n 5 1003), que también
tuvo la mayor prevalencia de infección por influenza entre las aves de corral
negro / Colombia / 1/2011 (A / BBWD / Colombia / 1/2011) y A / pato
(2.8%). También se recolectaron muestras positivas de una codorniz japonesa ( Coturix
silbante cariblanco / Colombia / 1/2011 (A / WFWD / Colombia / 1/2011).
japonica) y de patos domésticos Anas platyrhynchos domestica). Desafortunadamente,
los intentos de aislar virus de hisopos positivos de caballos y aves de corral e
identificar sus subtipos no tuvieron éxito, un resultado no inesperado dada la
sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real. La mayoría de sam-
los ples tenían umbral de ciclo ( C t) valores alrededor de 37-39, mientras que el
aislamiento se logra idealmente en o por debajo de un valor umbral de ciclo de 33. 25-27
Detección del virus de la influenza pandémica H1N1 (pH1N1) en porcinos
De las 91 muestras positivas de cerdos (Cuadro 1), la mayoría (91,2%) se
obtuvieron en dos fechas distintas en un matadero y el 2,5% se recogió en
granjas. Ninguno de los animales presentó signos clínicos de infección. Pudimos
subtipificar 33 muestras positivas mediante RT-PCR convencional y secuenciación
de Sanger y descubrimos que todas eran virus pH1N1.
Para determinar si alguno de los virus porcinos pH1N1 era reordenado, realizamos una secuenciación
completa del ARN de los hisopos positivos. El análisis filogenético de cuatro muestras diferentes confirmó
que los cerdos estaban infectados con el virus pH1N1 inalterado; la identidad genética con otros virus
pH1N1 osciló entre el 97% y el 100%. Los virus porcinos colombianos se agruparon con otros aislados
pH1N1 humanos y porcinos (Figura 2 y Figura complementaria S1). Las secuencias de hemaglutinina (HA)
de los virus de la primera y segunda fechas de muestreo diferían entre sí y diferían significativamente de
las HA de las cepas pandémicas pH1N1 conocidas (valores de arranque de 85 y 75, respectivamente)
(Figura 2A). De manera similar, las secuencias NS, NP y PA mostraron agrupamiento temporal (Figuras
complementarias S1B-S1D). Las secuencias de NA de pH1N1 no mostraron un patrón filogenético
específico (Figura 2B), tampoco las secuencias M, PB1 o PB2 (Figuras complementarias S1A, S1E y S1F). Los
genes M de tres de los cuatro aislamientos parecían formar un subclade diferente de los de otros virus
pH1N1 (Figura complementaria S1D), aunque se deben analizar virus adicionales para confirmar este
hallazgo. Hasta donde sabemos, este es el primer informe del virus pH1N1 en cerdos colombianos.
Además, estos hallazgos difieren de nuestro estudio de seroepidemiología de principios de 2010 que
muestra anticuerpos contra los virus H3N2 del cerdo clásico en el cerdo de Los Llanos (datos no
publicados). Estos hallazgos demuestran la necesidad de aunque se deben analizar virus adicionales para
vigilancia, lo más importante para asegurar que los cerdos colombianos no estén
actualmente en las piaras de cerdos de América del Norte. 28,29
Hasta la fecha, no ha habido reportes de virus de influenza en poblaciones de
aves silvestres colombianas. De las muestras de 2013 recolectadas de diversas
especies de aves silvestres en toda la región de los Llanos (Tabla complementaria
S1), 58 (, 3.0%) fueron positivas. Aunque la mayoría de las muestras positivas se
obtuvieron de especies mixtas o desconocidas, las muestras positivas se
identificaron en el Anseriformes, Charadriiformes, Passeriformes y
Pelicaniformes pedidos. Se aislaron dos virus de la influenza de patos
silbadores residentes (género Dendrocygna): A / pato silbante de vientre
Para comparar los virus de las aves silvestres colombianas con otros virus de
la influenza aviar, realizamos una secuenciación completa de los aislados virales
seguida de un análisis filogenético (Figura 3 y Figura complementaria S2). En los
análisis de todos los segmentos de genes, los dos virus H5N2 colombianos
estaban más estrechamente relacionados entre sí que con cualquier otro virus de
la influenza, y formaron grupos significativamente distintos de los de las otras
cepas analizadas. Los segmentos de genes de ambos virus se agruparon con los
virus de la influenza aviar de América del Norte en lugar de con los virus de la
influenza aviar de América Central o del Sur (Figura 3); comparación de su
relación con el norteamericano vs.
Los linajes H5 no norteamericanos produjeron un robusto valor de arranque de
100. Este hallazgo puede reflejar la escasez de datos sobre la influenza de aves
silvestres en América Central y del Sur.
En el análisis del gen HA, el pariente más cercano fue un virus H5N2
aislado de un pato salvaje en Ohio en 2004 (96% de similitud de
nucleótidos) (Figura 3A y Tabla complementaria S2). Al igual que otros
virus del linaje norteamericano, los virus H5 colombianos tenían una
secuencia de aminoácidos deducida de PQRETR * GLF en el sitio de
escisión multibásico, un dominio de unión al receptor que sugiere
especificidad aviar e incapacidad para replicarse en ausencia de
tripsina (lo que significa baja patogenicidad ) (Tabla 2). Al igual que el
segmento HA, los genes NA de los virus colombianos eran más
similares entre sí que a cualquier otra cepa o grupo en el clado
norteamericano de virus N2 que contienen tallos NA largos (Figura 3B
y Tabla 2). El relativo más cercano a ambas cepas se identificó
mediante la secuencia N2 de A / mallard / MN / 1/2000 (similitud de
nucleótidos del 96%).

confirmar este hallazgo. Hasta donde sabemos, este es el primer informe del virus pH1N1 en cerdos Patogenicidad y replicación de los aislamientos colombianos de H5N2 en aves
colombianos. Además, estos hallazgos difieren de nuestro estudio de seroepidemiología de principios de de corral
2010 que muestra anticuerpos contra los virus H3N2 del cerdo clásico en el cerdo de Los Llanos (datos no Evaluar la patogenicidad de los virus H5N2 colombianos en pollos,
publicados). Estos hallazgos demuestran la necesidad de aunque se deben analizar virus adicionales para grupos de pollos de 6 semanas ( norte 5 5 / virus) fueron inoculados por
víaAdemás,
confirmar este hallazgo. Hasta donde sabemos, este es el primer informe del virus pH1N1 en cerdos colombianos. natural con
estos los virus
hallazgos difierencolombianos
de nuestro estudio y
demonitoreados
seroepidemiología de principios de 2010 que muestra anticuerpos

Tabla 2 Características de los virus aviares H5N2 colombianos aislados

Tallo NA

Virus Subtipo Patogenicidad Sitio de escisión multibásico a Crecimiento sin tripsina longitud Referencia

A / Pollo / Querétaro / 14588-19 / 1995 H5N2 HP PQRKRKTR * GLF sí Corto 54

A / tern / Sudáfrica / 1961 H5N3 HP PQRETRRQKR * GLF sí Largo 50
A / Pollo / Pensilvania / 1/1983 H5N2 HP PQKKKR * GLF sí Corto 55
A / Pollo / México / 26654-1374 / 1994 H5N2 LP PQRETR * GLF No Corto 54
A / ánade real / Bavaria / 1/2005 H5N2 LP PQRETR * GLF No Largo 50
A / WFWD / Colombia / 1/2011 H5N2 LP PQRETR * GLF No Largo
A / BBWD / Colombia / 1/2011 H5N2 LP PQRETR * GLF No Largo

a Secuencia de aminoácidos deducida.

Microbios e infecciones emergentes

 Prevalencia de virus de influenza en Colombia
EA Karlsson et al
6

A / pollo / México / 37821-771 / 1996 (GU052588)

A DECIR AH
A / pollo / México / 22184/1998 (GU052612)
A / pollo / México / 31381-991 / 1994 (GU052659)
A / pollo / México / 28159-541 / 1995 (GU052690)
A / parrot / CA / 6032/04 (DQ256383)
A / pollo / México / 435/2005 (FJ864690)
A / pollo / Guatemala / 45511-1 / 2000 (GU052628)
A / pollo / EI Salvador / 102711-2 / 2001 (GU052636) A /
pollo / Texas / 298313/04 (AY849793)
A / pollo / Nueva Jersey / 17169/1993 (EU743019)
A / wigeon / Ohio / 379/1998 (CY011248)
A / pato silbante vientre negro / Colombia / 1/2011
A / pato silbador cara blanca / Colombia / 1/2011
A / ruddy tumstone / Delaware / 85/2005 (GU186446)
A / pato salvaje / Ohio / 623/2004 (GU186785)
A / ánade real / Maryland / 897/2004 (FJ686738)
A / ánade real / lllinois / 3974/2009 (CY097176)
A / pato / Nueva York / 484057/2007 (GQ117225)
A / pato / Pensilvania / 10218/1984 (AB295603)
A / pollo / Pensilvania / 1/83 (J04325)
A / tern / Sudáfrica / 1961 (GU052822)
A / pato / Postsdam / 1402-6 / 1986 (CY014642)
A / cisne / Bavaria / 15/2007 (GU046782)
0. 02 A / pollo / ltalia / 312/1997 (EF597263)

B N/A A / pollo / Queretero / 7653-20 / 1995 (FJ610077)

A / pollo / México / 31381-3 / 1994 (U186567)
A / pollo / Chiapas / 15408/1997 (GU052606)
A / pollo / México / 22184/1998 (GU052614)
A / loro / California / 6032/04 (DQ256385)
A / pollo / Guatemala / 45511-5 / 2000 (GU052797)
A / pollo / E1 Salvador / 102711-2 / 2001 (GU052638)
A / pato negro / Nueva York / 184/1988 (CY014874) A
/ wigeon / Ohio / 379/1998 (CY011250)
A / ánade real / Maryland / 302/2001 (GU053469)
A / ánade real / lllinois / 3974/2009 (CY097178)
A / ruddy Turntone / Delaware / 313/2003 (EU980525)
A / ánade real / Ohio / 468158/2006 (GQ923271)
A / pollo / Pensilvania / 1/1983 (CY015075)
A / pato real / Alberta / 57/1976 (CY004319)
A / ánade real / MN / 113/2000 (EU871901)
A / ánade real / Kentucky / 472048-2 / 2006 (GQ923311)
A / ave silvestre / Wisconsin / 433163-1 / 2006 (GU050260)
A / pollo / Texas / 298313-2 / 2004 (GU052646)
A / pato silbante vientre negro / Colombia / 1/2011
A / pato silbador cara blanca / Colombia / 1/2011
A / pollo / ltalia / 330/1997 (GU052405)
A / ánade real / Países Bajos / 3/1999 (GU052558)
A / pato / Corea / A14 / 2008 (GU086248)
A / ánade real / República Checa / 14602-37K / 2011 (JQ737223)
A / pato / Victoria / 26/1981 (CY077687)
A / turquía / Inglaterra / N28 / 1973 (GU052550)
A / pato / Potsdam / 1402-6 / 1986 (GU052542)
A / porrón pico rosado / Argentina / CIP051-1977 / 2010 (CY096055)
A / Porrón pico rosado / Argentina / CIP051-925 / 2008 (CY067712) A /
Porrón pico rosado / Argentina / CIP051-557 / 2007 (CY067696)

0. 02

figura 3 Árboles filogenéticos de la HA ( A) y NA ( B) genes de los virus de la influenza H5N2 aislados de patos silbadores en la región de los Llanos de Colombia. Los árboles se
generaron utilizando el método de unión de vecinos en el software MEGA. El árbol HA se basa en secuencias genéticas completas de virus H5N2 representativos de América Central
y del Sur (azul oscuro), América del Norte (azul claro) y Eurasia / Oceanía (amarillo). El árbol NA se basa en secuencias genéticas completas de virus HxN2 representativos de América
Central (azul oscuro), América del Norte (azul claro / naranja claro), América del Sur (naranja oscuro) y Eurasia / Oceanía (amarillo claro) y se divide en cortos (azul) y largos
(amarillos) del tallo. Las cepas caracterizadas en este estudio se muestran en cursiva negra. Las barras de escala representan el número de sustituciones por sitio.

Microbios e infecciones emergentes

 Prevalencia de virus de influenza en Colombia
EA Karlsson et al
7

Cuadro 3 Crecimiento y patogenicidad de los virus H5N2 colombianos en pollos

Título de hisopo 1

Tráquea Cloaca

Virus 2 dpi 4 ppp 6 ppp 8 ppp 2 dpi 4 ppp 6 ppp 8 ppp IVPI

A / WFWD / Colombia / 1/2011 0 (0/5) 2 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 5,5 (1/5) 4,5 (1/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0
A / BBWD / Colombia / 1/2011 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 4 (2/5) 5,25 (1/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0

Abreviaturas: IVPI; índice de patogenicidad intravenosa; dpi; días después de la infección.

1 Tronco 10 EID 50 / mL. Los datos son el promedio de 5 animales / grupo. Los valores entre paréntesis son el número perdido / número probado.
2 Los valores de 0 estaban por debajo del límite de detección (, 1 log 10 EID 50 / 100 metro L).

signos de infección. Se recolectaron hisopos cloacales y traqueales durante 8 días Replicación de los aislamientos colombianos de H5N2 in vitro y en ratones
pi (Tabla 3). Aunque ninguno de los pollos presentó signos clínicos de Para evaluar la replicación en células de mamíferos, se infectaron células MDCK y NHBE
enfermedad, el 20% de los inoculados con A / WFWD / Colombia / 1/2011 cultivadas en una interfaz aire-líquido con los virus colombianos en anMOI. 5 0,01 y se
excretaron el virus de la cloaca hasta el día 4 pi, con un título de virus máximo. controlaron los títulos virales. Ambos virus tenían títulos comparables a las 24 y 48 hpi
de 10 5.5 EID 50 / mL en el día 2 pi (Tabla 3). De manera similar, el 40% de las aves inoculadas en células MDCK, alcanzando
con A / BBWD / Colombia / 1/2011 diseminaron el virus por vía cloacal en el día 2 pi aproximadamente 10 7 TCID 50 / mL por 24 hpi (Figura 4A). Sorprendentemente, los
(título máximo de 10 4 EID 50 / mL); solo un pájaro se mudaba el día 4 pi. No hubo virus también se replicaron en las células NHBE, aunque su cinética fue
diseminación cloacal después del día 4, y ningún pájaro diseminó el virus de más lentos que los del virus A / California / 04/2009 (CA / 09) H1N1 (Figura
la tráquea. Ambos virus H5N2 colombianos fueron no patógenos en 4B). Los títulos de los virus colombianos fueron 4 logaritmos más bajos que
pollos, con un índice de patogenicidad intravenosa de 0 (Cuadro 3). los de CA / 09 a las 24 hpi, pero fueron comparables a las 48 hpi. Estas

10
Título del virus MDCK (log 10 TCID 50 / mL)

A / WFWD / Colombia / 1/2011

A / BBWD / Colombia / 1/2011

8

0
0 20 40 60
Horas después de la infección

10
Título del virus NHBE (log 10 TCID 50 / mL)

A / WFWD / Colombia / 1/2011

*
8 A / BBWD / Colombia / 1/2011

A / California / 04/2009
6

0
0 20 40 60 80 100
Horas después de la infección

Figura 4 Replicación de los virus colombianos H5N2 in vitro. MDCK ( A) las células se infectaron a un MOI de 0,01, los sobrenadantes de cultivo se recogieron a las 0, 24 y 48 hpi, y
el virus se tituló como TCID 50. ( B) Las células NHBE se mantuvieron en cultivo en una interfaz aire / líquido y se infectaron con un MOI de 0,1. A las 6, 24, 48 72 y 96 hpi, el medio fue
añadido a la superficie apical. El medio se recogió después de 30 min y el virus se tituló por triplicado como TCID. 50. Las barras de error representan el error estándar de la media.
* PAG, 0,05.

Microbios e infecciones emergentes

 Prevalencia de virus de influenza en Colombia
EA Karlsson et al
8

Los hallazgos sugieren que los virus aviares colombianos pueden replicarse en células zona, creando un entorno único en el que diversas especies de aves acuáticas
de mamíferos. migratorias están en contacto con caballos, cerdos y aves de corral, especialmente a
Para evaluar la patogenicidad en mamíferos, grupos de diez través de la cría de traspatio. Por esta razón, no fue sorprendente encontrar pruebas de
hembras Balb / cmice fueron inoculadas intranasalmente con 10 5 TCID 50 de RT-PCR en tiempo real de la infección por el virus de la influenza en una amplia gama de
los virus colombianos o del virus A / PuertoRico / 8/1934 (PR8) H1N1, y especies.
La pérdida de peso y los títulos virales se controlaron durante 10 días. A Los cerdos mostraron la mayor prevalencia de infección (13,4%), una tasa
diferencia del virus PR8, ninguno de los virus H5 de Colombia causó una pérdida mucho más alta que la prevalencia estimada del 4% en las piaras de cerdos de
de peso significativa (Figura 5A); Se observaron títulos virales bajos el día 3 pi, y el América del Norte (comunicación personal, RJ Webby, St Jude Children's Research
virus se eliminó por completo el día 6 pi (Figura 5B). No se observaron lesiones Hospital). Se han identificado previamente anticuerpos anti-influenza en cerdos
histológicas significativas en los pulmones de los ratones inoculados con en Brasil, Argentina, Venezuela, Chile y Colombia. 30,31 Sin embargo, solo otro
cualquiera de las cepas (datos no mostrados). Estos hallazgos no justificaron las estudio ha identificado la infección por influenza (con un virus H3N2 humano) en
pruebas de patogenicidad y transmisión de estos virus en un modelo de hurón. cerdos colombianos. 31 Al principio de nuestra vigilancia (febrero de 2010),
En resumen, aunque los virus H5 colombianos se replicaron en cultivos de células encontramos anticuerpos contra los virus porcinos clásicos H3N2 en cerdos de la
de mamíferos, se replicaron solo en menor medida en ratones inoculados y no región de los Llanos. Sin embargo, en diciembre de 2010, el virus pH1N1 fue la
causaron morbilidad. única cepa detectada. Dado que los virus porcinos eran idénticos a las cepas
humanas pH1N1 circulantes, es posible que se hayan introducido en los cerdos
DISCUSIÓN por zoonosis inversa. Las diferentes fechas de muestreo y la formación de dos
Pocos otros estudios han investigado la prevalencia de los virus de la influenza en grupos distintos dentro de la rama pH1N1 sugieren dos eventos de este tipo.
diversas especies en Colombia. La región de los Llanos, una de las praderas Como la mayor parte de nuestra vigilancia se realizó en mataderos, no podemos
tropicales más ricas del mundo, proporciona hábitat a una gran cantidad de aves comentar sobre la enfermedad clínica en las piaras, aunque es interesante que la
residentes y migratorias. 9 También hay una agricultura extensiva en el mayoría

110
A / WFWD / Colombia / 1/2011

A / BBWD / Colombia / 1/2011

Porcentaje de peso del día 0 (%)

100
A / Puerto Rico / 8/1934

90

80

70
0 2 4 6 8 10
Días después de la infección

B
5
A / WFWD / Colombia / 1/2011
Título del virus pulmonar (log 10 TCID 50 / mL)

A / BBWD / Colombia / 1/2011

4

0
0 3 6
Días después de la infección

Figura 5 Patogenicidad de los virus H5N2 colombianos en vivo. Ratones BALB / c hembra de 6 a 8 semanas ( norte 5 10) se infectaron intranasalmente con 10 5 TCID 50 de los virus indicados, y pérdida
de peso ( A) fue monitoreado por 14 dpi. ( B) 0, 3 y 6 días después de la infección, se recolectaron pulmones de tres ratones por grupo y el virus en homogeneizados se
titulado como TCID 50. Los datos representan la media de al menos dos experimentos separados. Las barras de error representan el error estándar de la media.

Microbios e infecciones emergentes


de las muestras positivas identificadas procedían de dos rebaños separados de
lechones, en los que más del 80% fueron positivos mediante RT-PCR en tiempo real.
Es motivo de preocupación que hayamos encontrado evidencia de una
infección más reciente de piaras porcinas en Colombia tanto con el virus pH1N1
como con el virus porcino clásico H3N2. En muchas partes del mundo, existe
evidencia de un reordenamiento continuo entre los virus pH1N1 y los virus H3N2
y H1N1 porcinos clásicos. Varios de estos reordenamientos se han cruzado en
humanos, 28,29,32–36 el más reciente es el de los nuevos virus H3N2 reagrupados que
actualmente infectan a los seres humanos en los Estados Unidos. 28,29,37–39
De manera similar, se ha encontrado que los cerdos en Argentina están
infectados con pH1N1 y reordenamientos humanos estacionales. 40 Estos
hallazgos resaltan la necesidad de vigilancia en toda América Latina para
dilucidar el alcance de la prevalencia de la influenza y la prevalencia específica de
la cepa en los cerdos y la potencial transmisibilidad de las reordenaciones de los
cerdos a los humanos.
También encontramos que el 2,6% de las aves de corral y el 3,6% de las aves
silvestres analizadas dieron positivo al virus de la influenza. Tanto virus como
anticuerpos se han aislado previamente de aves silvestres y aves de corral en
América del Sur, incluidos los subtipos H7 y H9 en Argentina, Chile, Bolivia,
Colombia, Perú y Brasil. 8,41–46 Sin embargo, nuestro estudio es el primero en aislar
virus H5 en América del Sur. Los sueros H5 positivos previamente reportados en
granjas avícolas chilenas fueron luego vinculados a un lote de vacuna
contaminado. 45 Nuestros virus H5N2 de baja patogenicidad se aislaron de dos
especies de patos silbadores residentes, que son bastante comunes en Colombia
tanto al este como al oeste de los Andes y generalmente se encuentran en
estanques de agua dulce, marismas y campos inundados. 47 En Nigeria, se
descubrió que los patos silbadores de cara blanca eran portadores sanos de virus
H5N2 altamente patógenos. 48–50 Tanto los patos silbadores de cara blanca como
los de vientre negro generalmente se consideran especies residentes no
migratorias; por lo tanto, estos virus pueden haber sido introducidos por aves
migratorias que invernan en Colombia. Además, todos los genes del virus de los
patos silbadores de cara blanca y de vientre negro se agruparon con secuencias
de aves migratorias silvestres del linaje norteamericano (similitud de nucleótidos,
90% -98%), a diferencia de los virus H6 argentinos que claramente evolucionaron
de Virus de linaje sudamericano. 44,51 Alternativamente, los virus colombianos
pueden ser parte de un linaje 'sudamericano' más grande que aún no se ha
identificado mediante vigilancia en aves silvestres sudamericanas.
Aunque los virus H5N2 fueron poco patógenos (puntuaciones de IVPI de
0) en pollos, 52 se replicaron y se mudaron cloacalmente por el 20% de los
pollos inoculados hasta el día 4 pi. Si bien la proporción de pollos que
excretan el virus y la cinética de replicación coincidieron con las de otras
cepas de H5N2 de baja patogenicidad, 53 la replicación eficiente de estos
virus indicó que tienen el potencial de propagarse si se introducen en las
poblaciones de aves de corral domésticas; por lo tanto, justifican una
vigilancia continua.
Los virus colombianos H5 se replicaron eficientemente en células MDCK
y NHBE; sin embargo, la infección por el virus H5N2 se asoció con poca o
ninguna morbilidad y con una replicación viral limitada en ratones Balb / c.
Estos hallazgos sugieren que los virus H5N2 colombianos aislados de aves
silvestres no requieren una intervención inmediata, porque (i) no contienen
el sitio de escisión multibásico o la deleción del tallo asociado con virus
altamente patógenos; (ii) no fueron altamente patógenos en pollos
inoculados; y (iii) no se replican eficazmente en un modelo de mamífero. Sin
embargo, estos estudios destacan la necesidad de una vigilancia continua
del virus de la influenza en Colombia y en toda América del Sur.
Se puede encontrar información adicional para este artículo sobre
microbios e infecciones emergentes sitio web (http://www.nature.com/ emi
/).
Prevalencia de virus de influenza en Colombia
EA Karlsson et al
9
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Scott Krauss, la Dra. Mariette Ducatez, la Dra. Pam McKenzie, el
Dr. Paul Thomas, el Dr. Pradyot Dash, Jerry Parker, Rich Elia y Bridgett Sharp (St
Jude Children's Research Hospital, EE. UU.) Por los reactivos y la asistencia
técnica. También agradecemos al Dr. Robert Webster y al Dr. Richard Webby (St
Jude Children's Research Hospital, EE. UU.) Por sus perspicaces discusiones y
sugerencias experimentales y a la Dra. Paula Cancino, DVM (Asociación
Colombiana de Porcicultores, Colombia) y al Dr. Julian Morales, DVM
(Universidad de Los Llanos, Colombia) para asistencia logística. Finalmente,
agradecemos a las personas que participaron en el trabajo de campo: los
estudiantes de veterinaria de la Universidad de Los Llanos y la Universidad
Cooperativa de Colombia en Colombia, Johanna Murillo (la Corporación Llanera
de Ornitologia y de la Naturaleza — KOTSALA, Colombia), Adolfo Vasquez (la
Corporación Corpotropica, Colombia), y los ganaderos, dueños y cuidadores de
los animales domésticos. Este trabajo fue apoyado en parte por el número de
contrato del NIH NIAID HHSN266200700005C y las organizaciones benéficas
asociadas sirias libanesas estadounidenses.
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Microbios e infecciones emergentes