Comparación y alineamiento estructural con VMD

Introducción

El objetivo del siguiente práctico es realizar comparaciones y alineamientos estructurales

utilizando el programa VMD, cuyas funciones básicas usted ya aprendió a manejar en las
prácticas anteriores. El TP tiene como objetivo realizar una comparación estructural de las
Mitogen activated protein kinasas (MAPK) humanas.
En humanos hay unos 13 genes que codifican para MAPKs (MAPK1 a 15, ya que el 2 y el 5
faltan misteriosamente). Tradicionalmente se las divide en 5 subgrupos. El grupo ERK (ERK1, 2
y 5), el grupo ERK3s (ERK3 y 4), el grupo de ERK8, el grupo de las Jun Kinasas (JNK1, 2 y 3) y
el grupo de las p38s (p38, p38, p38 y p38). En la presentación introductoria al TP hay una
tabla que relaciona los nombres tradicionales de las MAPKs con la nomenclatura numérica que
refiere a los genes.
Además de ser una gran familia las MAPK son proteínas que presentan múltiples
conformaciones dependiendo si se encuentran en la forma inactiva, o activa (cuando esta
fosforilada). Además varios trabajos sugieren que también cambian de conformación al
interactuar con otras kinasas, con sustratos, o con inhibidores.

El Protein data Bank (PDB)

La información estructural de proteínas, ácidos nucleicos, y complejos macromoleculares

obtenidos experimentalmente (Rayos-X o NMR) es almacenada hoy en día en la wwPDB (World
Wide Protein data Bank) que fija los estándares y formatos de la información estructural. El
wwPDB está integrado por el Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) el
PDBe (UK), PDBj (Japón) y BMRB (USA) que aseguran la uniformidad y calidad de los datos. El
PDB es por lo tanto una base de datos anotada y curada. La búsqueda de una estructura se
puede hacer desde la página del RCSB www.rcsb.org/pdb como desde el NCBI, u otros
portales.
Cada archivo de PDB es una colección de secciones que contienen la información dividida en
registros subdivididas en campos. Las secciones más importantes son:
Sección Título:
Contiene la información que describe a que experimento y que molécula corresponde el archivo
Posee los siguientes registros: HEADER, OBSLTE, TITLE, CAVEAT, COMPND, SOURCE,
KEYWDS, EXPDTA, AUTHOR, REVDAT, SPRSDE, JRNL, y REMARK

El registro HEADER identifica unívocamente al pdb: 3 campos: frase identificatoria, fecha de

ingreso de depósito y código pdb (#XYZ). EL CODIGO PDB ES EL DATO MÄS IMPORTANTE
YA QUE IDENTIFICA INQUIVOCAMENTE UNA ESTRUCTURA DADA.
Ejemplo:
HEADER HYDROLASE (CARBOXYLIC ESTER) 08-APR-93 2PHI

El registro TITLE describe el registro como lo hace el título de un paper

El registro COMPND describe la macromolécula con mayor detalle. (nombre de la proteína,
cadena, etc.)
COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN;
COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D;
COMPND 4 ENGINEERED: YES;
COMPND 5 MUTATION: YES

Luego hay una sección con información sobre la estructura secundaria de la estructura. Otra con
las transformaciones geométricas relacionadas con el análisis del cristal. Otra con las
modificaciones post-traduccionales relevantes y finalmente la sección que contiene la estructura:

El registro ATOM contiene las coordenadas anotadas por átomo, cada línea corresponde a un
átomo. Los átomos de un residuo no estándar poseen registro HETATM con el mismo formato.
Ejemplo:

ATOM 149 CB AVAL A 25 30.385 17.437 57.230 0.28 13.88 C

ATOM 150 CB BVAL A 25 30.166 17.399 57.373 0.72 15.41 C

Campos: Número del átomo, Nombre del átomo, (Conformación alternativa), Nombre del
aminoácido, cadena, Número del aminoácido, coordenadas: X-Y-Z, ocupancia, Factor-B, símbolo

El registro SIGATM presenta la desviación estándar de la posición del átomo

El registro ANISOU presenta los valores de Temperatura anisotrópicos (símil Factor-B)
Los registros MODEL-ENDMDL marcan el inicio y fin de un modelo resuelto por RMN
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A los programas de visualización y análisis de estructura con el VMD, solo les importa la
información de los REGISTROS ATOM y HETATM.

Obtención de las estructuras de las MAPKs

Para realizar una comparación estructural exhaustiva de las MAPK, usted deberá tener las
secuencias y alguna estructura representativa de cada MAPK. Por suerte para usted el docente
ya se ocupó de obtener los siguientes datos:
Secuencia y estructura de p38A, p38B, p38D, p38G, Jnk1 Jnk2, Jnk3, ERK2, ERK3, ERK5
Secuencias de ERK1, ERK4 y ERK8.

Falta la estructura de ERK1 humana que deberá encontrar usted mismo y también las
estructuras de ERK4 y ERK8 humanas que todavía no han sido resueltas.

Tarea 1: Vaya a la página del rcsb. Utilice el buscador para buscar la estructura de ERK1
humana fosforilada. Vaya a la página que le muestra la información estructural del archivo
correspondiente. ¿Qué información del archivo le muestra?
Baje el archivo de estructura de esta proteína a su máquina clickeando “Download files/pdb
format” Abra el archivo con un procesador de texto cualquiera (Word, Vi, Kate, etc). Identifique
en el mismo a) La sección Titulo. ¿En qué fecha se depositó la estructura? ¿Quién es el autor?
b) Identifique los elementos de estructura secundaria. c) ¿la proteína cristalizada es la proteína
tal cual se expresa en el organismo o esta modificada? d) Analice los registros ATOM de una
Leucina o Fenilalanina, dibuje un esquema del residuo poniendo los nombres correctos de los
átomos e) Identifique en la estructura átomos que no pertenecen a aminoácidos, que son? f)
Visualice en el VMD la estructura, identifique ahora a que corresponden los átomos que no son
de la proteína.

Tarea 2.
Uno de los problemas más frecuentes con las estructuras es saber realmente si las estructuras
que obtuvimos son lo que queríamos Se le ocurre como verificarlo?
Una de los mejores maneras de verificar si una estructura corresponde con la proteína deseada
(y también quizás la mejor estrategia de búsqueda en el PDB) es realizar un BLAST contra pdb
de la secuencia de la proteína de interés
a) Utilizando la secuencia ERK1 realice un BLAST contra PDB, a partir de los resultados obtenga
y guarde las estructuras correspondientes.
b) Ahora realice lo mismo con ERK4 y ERK8 humanas. Pudo obtener estructura de ellas? Hay
estructura de proteínas homologas? Cuáles son las de mayor similitud?

Análisis estructural de una MAPK: ERK2.

La estructura de una MAPK tiene diferentes elementos característicos:

Dos dominios mayores: el N-terminal, mayoritariamente hojas Beta mas las hélices αC y αL16, y
el dominio C-terminal mayoritariamente formado por hélices y cuatro hojas Beta cortas. El sitio
de unión a ATP se encuentra entre los dos dominios. Lo que caracteriza a las MAPKs es el
inserto MAPK, de unos 30-50 residuos en el dominio C-terminal (Residuos 230-280). El loop de
fosforilación cercano al aminoácido 175. Finalmente el sitio de unión de las MAPKKs , o docking-
site conformado por un hueco hidrofóbico entre las hélices αD, αE y el turn reverso β7-β8.

Tarea 3.
a) Cargue en el VMD la estructura de ERK2 inactiva. (erk2_inactiva.pdb) y trate de reconocer los
elementos mencionados en el párrafo anterior. Determine que residuos (o sea que número)
componen cada uno. Ayúdese para esta tarea con el esquema de la secuencia y estructura
secundaria de ERK2 que se encuentra en la presentación del TP.

Puede ser que identificar ciertos elementos sea difícil, si no identifica todos siga adelante.
Para comparar estructuras utilizaremos el módulo de VMD Multiseq. Este módulo permite
realizar entre otras cosas alineamientos y comparaciones estructurales entre proteínas
diferentes. Para lanzar el plugin Multiseq vaya a MAIN-EXTENSIONS-ANALYSIS-MULTISEQ.
Esto abrirá una nueva ventana con el Multiseq (puede tardar un rato). Lo primero que debe hacer
en Multiseq es elegir el directorio de trabajo donde se guardaran los archivos temporarios: FILE-
Choose Work Directory.
La ventana de Multiseq muestra en cada fila el nombre de la proteína (nombre del archivo) y
cadena que hemos cargado junto con su secuencia. A la izquierda hay un casillero que permite
seleccionar la proteína correspondiente a esa fila (ver más adelante). Además encontramos 3
letras que abren un Menú R,V,I. V permite mostrar/ocultar o cambiar la representación de la
proteína correspondiente. I abre una ventana dónde se puede agregar información relacionada
con la estructura y R permite cambiar la representación de la secuencia, como SECUENCIA o
ESTRUCTURA SECUNDARIA, así como generar un duplicado de la misma. Pruebe las distintas
representaciones.
Los MENUS de Multiseq que utilizaremos son TOOLS y VIEW (los otros son auto-explicativos).
El menú TOOLS permite realizar diferentes operaciones sobre las proteínas cargadas:
 Alineamiento estructural: realiza una superposición óptima de las proteínas y establece por
cercanía espacial cuales son los residuos equivalentes en cada secuencia (alineamiento
luego de superposición estructural).
 Alineamiento de Secuencia múltiple usando ClustalW o MAFFT.
 Creación de un árbol filogenético en base al alineamiento estructural o de secuencia.
 Plot-Data: grafica parámetros de comparación estructural o de secuencia para cada posición
a los largo de la secuencia.de las proteínas.
Las variables utilizadas en la comparación de secuencia son el % de identidad de secuencia o el
SCORING de ClustalW, mientras que en el alineamiento estructural los parámetros calculados
son el RMSD, o el Qres. (Q es un parámetro que evalúa las diferencias entre las distancias
internas de todos los pares de residuos equivalentes en dos estructuras y varía 0 y 1, siendo 1 el
valor de máxima similitud). Este parámetro fue desarrollado dentro del marco teórico de paisajes
de energía de plegamiento de proteínas. El Menú VIEW permite hacer ZOOM en la secuencia y
colorear la secuencia y estructura de acuerdo a parámetros de comparaciones estructural u otros
parámetros.

b) Cargue ahora en el VMD también la estructura de ERK2-Activa fosforilada (erk2_fosfo.pdb).

Inicie Multiseq, elija como directorio de trabajo alguno que usted desee. Vaya a TOOLS/Stamp
Structural Alignment, analice los parámetros y ponga OK. Compare ahora ambos estados de
ERK. ¿Dónde se encuentran las diferencias? (sugerencia represente ambas proteínas como
New-Cartoon y un color diferente para cada una). Vaya a VIEW-COLORING y coloréelas por
RMSD y Qres. Puede detectar ahora las diferencias entre ambos estados.
c) Siendo dos estructuras de la misma proteína ¿Cómo esperaría que sea el alineamiento?
Analice el alineamiento de la secuencia obtenido en base a la estructura, ¿Que deduce del
mismo? Alinee ahora ambas secuencias (TOOLS/Sequence Alignment/ClustalW.) ¿Cuál es el
resultado ahora?
d) Vuelva a alinear ambos estados estructuralmente, vaya a TOOLS PLOT DATA y grafique el
RMSD por residuo. Analice el resultado.
e) Ahora utilizando sus conocimientos del VMD encuentre las principales interacciones (o
perdida de ellas) que determinan el cambio estructural. (Ayuda recuerde que al activarse la
proteína se fosforila en Tyr185 y Thr183)

Comparación estructural de la familia de MAPK

De modo similar que el Multiseq nos permite alinear estructuralmente (o con ClustalW) dos
conformaciones de la misma proteína, podemos comparar proteínas diferentes.

Tarea 4: Cargue en el VMD p38 A, B, G y D. a) Alinéelas estructuralmente y analice el resultado

desde el punto de vista estructural. (sugerencia coloree de acuerdo a los distintos parámetros de
comparación estructural y analice los elementos estructurales definidos anteriormente, utilice
también la opción PLOT DATA). c) Ahora alinéelas con ClustalW compare los alineamientos.

Tarea 5: Cargue ahora en el VMD una MAPK de cada tipo (tipo ERK1/2, tipo p38, tipo Jnk y tipo
ERK3/4) a) Alinéelas estructuralmente y analice el resultado desde el punto de vista estructural.
Compare el resultado obtenido con lo que observo previamente para el grupo de p38.

Tarea 6: Cargue en el VMD todas las estructuras de MAPK (p38A,B,G,D; ERK1,2,3, 5, JNK1,2,3)
a) Alinéelas estructuralmente y obtenga el árbol filogenético para Qres b) Abra los archivos de
secuencia de todas las proteínas incluyendo también ERK4 y ERK8, alinéelas con clustalW y
obtenga el árbol filogenético. Compare ambos resultados.

Tarea 7: De acuerdo a los resultados obtenidos en las Tareas 3-6 responda:

a) ¿Cómo se relacionan evolutivamente las MAPK? b) ¿Qué puede decir de la definición de los
grupos tradicionales? c) ¿Cuán conservada se encuentra la estructura en las MAPK? Escriba
algo que le haya llamado la atención o que haya aprendido de las estructuras de las MAPKs.