Cambios en la estructura cuaternaria de la enzima fructosa-1,6-bifosfatasa muscular regula la

afinidad de la enzima a la mitocondria

Resumen

Zon u

Introducción

Fructosa-1,6-bisfosfatasa que cataliza la hidrólisis de fructosa-1,6-bifosfato a fructosa-6-fosfato y

fosfato inorgánico en presencia de Mg2 +, Mn2 +, Co2 + o Zn2 +, es una enzima reguladora de la
ruta gluconeogénica. En vertebrados, se han encontrado dos isoenzimas de FBPasa. La presencia
de la isoenzima hepática (FBP1) está prácticamente restringida a los órganos gluconeogénicos
como el riñón o el hígado, mientras que la isoenzima muscular (FBP2) se expresa en casi todas las
células de vertebrados. Los últimos estudios sugieren que, aparte de la función reguladora en la
síntesis de glucógeno / glucosa, FBP2 participa en la regulación del ciclo celular y la apoptosis. Sin
embargo, su papel y mecanismo precisos de la acción siguen siendo desconocidos.

En músculos heridos, FBP2 es un objetivo de la vía del glucógeno sintasa quinasa 3(GSK3). La
inhibición de GSK3 da como resultado la translocación de FBP2 a las mitocondrias y la retirada de
la enzima de los núcleos. En cardiomiocitos, un aumento en la concentración de calcio induce al
reclutamiento de FBP2 a las mitocondrias. La interacción FBP2-mitocondria regula la
permeabilidad de la membrana de los orgánulos, reduce la tasa de inflamación mitocondrial
inducida por calcio y protege la síntesis de ATP. Estos hallazgos apuntan a que FBP2 interactúa con
las mitocondrias como un vínculo importante entre la contracción muscular inducida por calcio y
la actividad metabólica (glucolítica) la función mitocondrial y la supervivencia celular. Sin embargo,
el modo en que FBP2 interactúa con la mitocondria permanece desconocido. Tampoco está claro
si FBP2 se asocia con mitocondrias en su conformación activa o inactiva.

La FBPasa de mamíferos es un homotetrámero y existe en al menos dos conformaciones

cuaternarias, R (relacionada con la enzima activa) y T (considerada como la forma inactiva),
dependiendo de las concentraciones relativas del inhibidor alostérico de la enzima, AMP. Un
mecanismo propuesto que gobierna la regulación y la catálisis de la FBPasa implica tres estados
conformacionales de un bucle 52-72 llamado comprometido, desvinculado y desordenado. La
enzima está activa si el ciclo 52-72 puede alternar entre su conformación comprometida y
desordenada. Los cationes divalentes junto con F6P o F1,6P2 estabilizan el estado activado del
ciclo y el estado R del tetrámero. La unión de AMP a FBPasa induce la conversión de la enzima en
el estado T, que tiene la hipótesis de estabilizar la conformación inactiva, inactivada, del bucle 52-
72. A diferencia de otros cationes divalentes, Ca2 + es un potente inhibidor de los músculos, pero
no de la FBPasa hepática. El Ca2 + compite con los cationes activadores por la unión a FBP2 y
estabiliza la forma de bucle inactiva, apareada 52-72. Aquí, demostramos los resultados de
nuestros estudios sobre la estructura base de la unión de FBP2 a las mitocondrias. Mostramos que
la conformación cuaternaria relacionada con la forma activa de FBP2 (estado-R) es absolutamente
necesaria para su asociación con los orgánulos. Estructura terciaria de la enzima, v.g. la
conformación del catalizador el bucle 52-72 no juega ningún papel significativo en la regulación de
la interacción FBP2-mitocondrias. También presentamos evidencia de que truncamiento de los
residuos N-terminales conservados evolutivamente de FBP2 afecta la interacción de la enzima con
las mitocondrias y da como resultado una reducción significativa de su efecto protector sobre la
hinchazón mitocondrial inducido por calcio.

Materiales y métodos

Transfección celular con FBPasa

Las formas de FBP2 y FBP2 mutadas y de tipo salvaje electroforéticamente puro (WT) se marcaron
con isotiocianato de fluoresceína (FITC) según lo descrito por Goding (1976). El procedimiento de
marcaje no modificó significativamente los parámetros cinéticos de las formas de FBPasa ( Datos
suplementarios 1, cuadro suplementario 1). La transfección de las células HL-1 con 1 μg de FBPasa
marcada con FITC se realizó usando el reactivo ProteoJuice de acuerdo con Gizak et al. (2012), en
presencia o en ausencia de SB216763. Después de counterstaining con MitoTracker Deep Red
FMand extensos lavados, las células se sumergieron en el medio de cultivo y se examinaron
inmediatamente con el microscopio confocal FluoView1000 (Olympus) equipado con el Plan
Apo60 × / 1.4 NA Aceite objetivo. Para evitar la interferencia entre canales, se utilizó la opción
Escaneo Secuencial. Como control, las células se transfectaron con albúmina de suero bovino
conjugada con FITC (BSA), como describimos anteriormente (Gizak et al., 2012) (datos no
mostrados).

Los cambios en el grado de co-localización de FBPase formas evaluados con mitocondrias se

estimaron utilizando el software OlympusFV10 ver.1.7.c y se presentaron como el coeficiente de
correlación de Pearson (r). Cuanto mayor es r, mayor es el grado de colocalización de la forma de
FBPasa con mitocondria. El coeficiente medio de Pearson se calculó a partir de al menos 60 células
transfectadas con una forma dada de FITC-FBPasa y las diferencias medidas fueron
estadísticamente significativas (p <0,05).

Medida del hinchamiento mitocondrial

El experimento se realizó como se describió anteriormente (Gizak et al., 2012). La integridad de las
mitocondrias aisladas se probó midiendo la actividad de la adenilato cinasa, un marcador del
compartimiento intermembrana mitocondrial. Su actividad en la fracción control mitocondrial
alcanzó solo aproximadamente el 3% de la actividad en la fracción mitocondrial preincubada con
Triton X-100 durante 15 minutos en hielo, lo que proporciona evidencia de que los orgánulos
aislados estaban intactos. El volumen mitocondrial se midió con el espectrofotómetro HP 8452. El
hinchamiento de los organelos aislados se identificó como una disminución brusca de la
absorbancia de la luz a 540 nm.Se indujo hinchamiento dependiente de calcio añadiendo 0,3 mM
o CaCl2 0,01 mM a la mezcla de reacción. La influencia de la FBPasa en el hinchamiento se probó
añadiendo 0,7 g de la enzima (de tipo silvestre o mutantes) a 450 \ mu l de la mezcla de reacción
(concentración final de monómero de FBPasa - 42 nM) antes de la adición de CaCl2. La
absorbancia se midió en el primer minuto y 5 minutos después de la adición de los agentes
probados al colchón de hinchamiento. Para comprobar el efecto de AMP sobre la interacción de
FBP2 con mitocondrias, WT y el mutante Y57W de FBP2 se preincubaron durante 1 minuto con 0.3
μM o 10? M AMP antes de la adición a las mitocondrias. Alternativamente, los orgánulos se
preincubaron con las formas de FBP2 antes de la incubación con AMP y CaCl2.
Análisis estadístico

Los datos recogidos se analizaron utilizando el software GraFit (Leatherbarrow, 2000). Los
resultados se expresan como media y desviación estándar (S.D.). Para una evaluación de
significación estadística, se utilizó la prueba t de Student. Se consideró que una probabilidad de p
<0.05 representaba una diferencia significativa.

Resultados y discusión

Los cambios inducidos por el calcio de la estructura terciaria de FBP2 no son necesario para la
interacción con las mitocondrias

En los últimos años, la isoenzima muscular de FBPasa-FBP2, ganó atención como una proteína de
pluriempleo, cuya función celular va más allá de la regulación de la síntesis de glucógeno. Se ha
demostrado que la isoenzima está implicada en una adaptación a la señalización de estrés
relacionada con calcio en cardiomiocitos (Gizaket al., 2012). Una concentración creciente de Ca2 +
estimula la asociación de FBP2 con mitocondrias, que protege los orgánulos contra la hinchazón
(Gizak et al., 2012). Además, la asociación de Ca2 + con FBP2 inhibe la actividad enzimática al
desestabilizar la conformación activa y comprometida de su ciclo catalítico 52-72 (Rakuset al.,
2013). Por lo tanto, los medios en los que el calcio afecta la función de FBP2 sugieren que la
enzima interactúa con mitocondrias en su forma inactiva, saturada de Ca2 +. En tal caso, FBP2 no
sería un catalizador, sino solo una proteína estructural (o un "adaptador") en el proceso de
protección contra el estrés de los orgánulos.

Para probar esto, verificamos la capacidad de la forma mutada de FBP2, con una afinidad
disminuida al Ca2 +, para interactuar con las mitocondrias aisladas de los cardiomiocitos HL-1.
Recientemente, hemos encontrado que la mutación del residuo de tirosilo 57 en FBP2 al
triptófano (mutante Y57W) no afecta significativamente las propiedades cinéticas de FBP2,
excepto su susceptibilidad a la inhibición por Ca2 + y AMP (Rakuset al., 2013; Tabla Suplementaria
1). Sin embargo, aunque el valor IC50 para AMP aumentó aproximadamente 5 veces con respecto
al WT FBP2, no hubo cambios significativos en el mecanismo cooperativo de la inhibición por AMP
- la constante Hill fue de aproximadamente 2 tanto para el WT FBP2 como para el mutante Y57W .
Por otro lado, dicha mutación aumenta la estabilidad del complejo de aldolasa basado en la línea Z
de FBPase muscular (Rakus et al., 2013), que es indispensable para que la gluco-neogénesis
continúe (Gizak et al., 2013) y que normalmente está desestabilizado por Ca2 + (Mamczur et al.,
2005).

Si la estabilización inducida por Ca2 + del estado inactivo del asa 52-72 es necesaria para la
interacción FBP2-mitocondrias, una capacidad reducida del mutante Y57W, en comparación con la
FBP2 de tipo silvestre (WT), para proteger las mitocondrias contra una acción elevada de Ca2 +
debería ser observado.De este modo, medimos los cambios espectrofotométricos en el volumen
mitocondrial provocado por 0.3 y 0.01 mM Ca2 + en presencia de la forma WT o Y57W de FBP2.
0.3 mM Ca2 + asegura hinchazón rápida y completa de los orgánulos (Gizak et al., 2012), mientras
que 0.01 mMCa2 + también induce algo de hinchazón pero satura solo el WT, no el FBP2 no
sustituido (Rakus et al., 2013). condiciones de control, mitocondrias cardíacas aisladas
resuspendidas en un tampón de hinchamiento mostraron hinchazón espontánea (línea de base)
medida por una caída lenta en la absorbancia de la luz a 540 nm (figura 1). La adición de Ca2 + dio
como resultado un aumento rápido en el volumen de los orgánulos. La preincubación de las
mitocondrias con las formas FBP2 redujo los cambios inducidos por Ca2 +. Sin embargo, en
presencia de ambas concentraciones de calcio, el potencial protector mitocondrial del mutante
Y57W fue similar al de WT FBP2 (Fig. 1). Esto demuestra claramente que la asociación de FBP2
inducida por Ca2 + con mitocondrias no es resultado de la saturación de la enzima con Ca2 + y que
la conformación del asa 52-72 no juega ningún rol en la interacción. Este hallazgo implica que el
calcio se asocia y afecta a la conformación de algunas de las proteínas mitocondriales que
interactúan con FBP2. La FBP2 puede interactuar con el canal aniónico dependiente de voltaje
(VDAC), la ATP sintasa y la translocasa de nucleótido de adenina (Gizaket al., 2012). Estas proteínas
poseen sitios de unión a Ca2 + (Gincel et al., 2001; Halestrap y Brenner, 2003; Hubbard y McHugh,
1996) que desempeñan un papel en la regulación de membranas mitocondriales por meabilidad o
homeostasis energética. Por lo tanto, probablemente, calcio los hace más "pegajosos" para FBP2.
Sin embargo, aún se desconoce cuál de las proteínas anteriores es la pareja de unión de FBP2 in
vivo y se aclara que son necesarios más estudios.

El estado de fosforilación de la serina 320 no influye en la localización mitocondrial de FBP2

La inhibición de GSK3 da como resultado el reclutamiento de FBP2 a mitocondrias in vivo (Gizak et

al., 2013) y hemos demostrado que in vitro, GSK3? fosforila la serina 320 de FBP2 (Gizak et al.,
2013). Si el estado de fosforilación de este residuo es decisivo en la regulación de la interacción
FBP2-mitocondrias, podría esperarse que la ausencia de residuo de seril 320 en la estructura de la
enzima imite el efecto de la inhibición de GSK3 en la localización subcelular de WT FBP2. En otras
palabras, el mutante S320A debería tener una tendencia creciente a localizarse en las
mitocondrias incluso en condiciones de control. Por lo tanto, transfectamos los cardiomiocitos HL-
1 con WT FBP2 marcados fluorescentemente y el mutante S320A y comparamos su localización
subcelular. Sorprendentemente, encontramos que esta mutación puntual no influye visiblemente
en la localización mitocondrial de FBP2 (Fig. 3C y D). El resultado del estudio inmunofluorescente
fue respaldado por la falta de diferencia medible entre la forma WT y S320A de FBP2 en los
experimentos de hinchazón inducida por Ca2 + (Figura 1). Evidentemente, aunque la GSK3 activa
inhibe la acumulación de FBP2 en las mitocondrias, la fosforilación dependiente de GSK3 del
residuo 320 no está directamente relacionado con la regulación de la enzima mitocondrial de la
enzima. Dado que hemos demostrado que GSK3 no fosforila ningún otro residuo de FBP2 (Gizak et
al., 2013), es concebible que GSK3 regula la interacción FBP2-mitocondrias fosforilando una de las
proteínas mitocondriales (Por ejemplo, VDAC, que se conoce como objetivo de la quinasa) en lugar
de FBP2. Parece que los dos factores conocidos que regulan la unión de FBP2 a los orgánulos -
cambios en la actividad de GSK3 quinasa y la concentración de Ca2 +, actúan probablemente
influenciando la estructura de unión mitocondrial socios de FBP2.

La estructura cuaternaria apropiada de FBP2 es necesaria para unirla a la mitocondria

Las isoenzimas mitocondriales de la FBPasa, hígado y músculo, se caracterizan por un alto grado
de similitud e identidad de sus estructuras primarias. Sin embargo, FBP2 es aproximadamente 100
veces más susceptible a la acción de los inhibidores alteroestéricos - AMP y NAD +, y
aproximadamente 1000 veces más sensible a la inhibición por Ca2 + (Gizak et al., 2004; Rakus et
al., 2003) que FBP1. Además, solo FBP2 puede interactuar específicamente con mitocondrias y
aldolasas (Fig. 3E; Rakus y Dzugaj, 2000). La FBPasa es un homotetrámero cuya disposición activa
de las subunidades del estado R se estabiliza mediante cationes activativos divalentes y
subestratos / producto. La unión de los inhibidores alostéricos de la enzima produce la rotación de
su dímero inferior hacia la superior, estabilizando la conformación activa del estado T de la FBPasa
(Zhang et al., 1994). Sinceneither calcio vinculante a FBP2 ni fosforilación dependiente de GSK3 de
seryl residuo 320 parece ser responsable de la unión de la enzima a las mitocondrias, era racional
suponer que algunos cambios en la estructura cuaternaria de FBP2 podrían regular esta
interacción. Por lo tanto, verificamos el efecto de AMP en la capacidad de FBP2 para proteger las
mitocondrias contra la hinchazón inducida por calcio. Como se muestra en la Fig. 2, la saturación
de WT FBP2 con AMP antes de la incubación de la enzima con mitocondrias perjudicó fuertemente
su acción protectora en el volumen de los orgánulos. Esto indica que se requiere el estado R de la
estructura cuaternaria de FBP2 para la asociación de la proteína con las mitocondrias.

Curiosamente, si las mitocondrias se preincubaron con WT FBP2 en ausencia de AMP, la posterior

adición de este inhibitordide no afecta la función protectora de la enzima (Fig. 2). Evi-dently, AMP
no puede interrumpir la interacción de FBP2 con la mitocondria, sin embargo, AMP-saturada FBP2
no puede interactuar con los orgánulos. Para verificar esto, usamos el mutante Y57W de FBP2. El
mutante es mucho menos sensible a la inhibición de AMP que WT FBP2 (IC50 para AMP para
Y57W es aproximadamente 0,9 μM, mientras que IC50 para WT FBP2 es 0,17 μM) (Tabla 1
complementaria). Si la disposición de estado R del tetrámero es necesaria para la unión de la
enzima a las mitocondrias, podría esperarse que el AMP de 0.3 μM, que solo satura WTFBP2 (en
aproximadamente el 80%), no reduzca la protección del volumen de la mitocondria con estrés de
calcio por la forma Y57W FBP2. Y, sin embargo, el mutante preincubado con 0.3 μM de AMP antes
de añadirlo a las mitocondrias retuvo la mayor parte de su afinidad con la capacidad de los
orgánulos para disminuir los efectos del estrés por calcio (Fig. 2). Además, si preincubamos el
mutante Y57W con 10? M AMP, que se supone que conduce aproximadamente el 90% de las
moléculas mutantes al estado T inactivo del tetrámero, la influencia protectora de la proteína
Y57W sobre el volumen mitocondrial no fue observado (Fig. 2). La influencia de AMP sobre la
unión de WT FBP2 e Y57Wmutant a mitocondrias se confirmó mediante observación microscópica
(Datos complementarios 2, Fig. 1 complementaria). Para excluir que el efecto de AMP sobre la
unión de FBP2 a las mitocondrias es el resultado de cambios inducidos por AMP en la estructura
de proteínas mitocondriales que interactúan con la enzima, verificamos la localización subcelular y
el efecto sobre mitocondrias de mutantes N-terminales de FBP2. La región N-terminal de FBP2 de
vertebrados es significativamente más conservada que la de FBP1 y es responsable de una mayor
sensibilidad de la isozima muscular a los inhibidores (Gizaket al., 2008). La eliminación de los
primeros 7 restos N-terminales afecta la estructura de FBP2, desensibiliza parcialmente la
isoenzima a sus efectores y reduce la especificidad de las interacciones de aldolasa de músculo
FBP2 (Gizak et al., 2008). En otras palabras, dicho truncamiento N-terminal hace que las
propiedades cinéticas de la FBPasa muscular se asemejen a la del hígado.

Por lo tanto, primero verificamos la localización subcelular de la FBPasa hepática conjugada con
FITC introducida en los cardiomiocitos HL-1. FBP1 presentó la localización únicamente citoplásmica
que no cambió después del tratamiento de las células con el inhibidor de GSK3 (Fig. 3E). En el
siguiente paso, probamos la localización de formas truncadas N-terminal de FBPasa muscular. La
eliminación de los primeros 7 aminoácidos N-terminales de FBP2 (7DelN) marcó notablemente la
colocalización de la enzima con mitocondrias en presencia del inhibidor de GSK3 (figura 3F). La
eliminación de los siguientes 3 residuos (10DelN) mejoró aún más este efecto (Fig. 3G). Como un
control adicional, usamos el mutante FBP2 con los primeros 10 aminoácidos delecionados del C-
terminal (10DelC), que no cambió las propiedades cinéticas de FBP2, y no observamos cambios
visibles en la localización de la enzima bajo la inhibición de GSK3 (Fig. 3H) en comparación con WT
FBP2. Como podría esperarse sobre la base de los resultados de la experimentación de
transfección, FBP1 no tenía una protección significativa (p = 0,11) el efecto sobre el volumen
mitocondrial (Fig. 1) y la preincubación de mitocondrias con 10Del C o S320A mutante de FBP2
antes de someterlos a estrés calórico redujo la tasa de hinchazón del organelo casi idéntica a WT
FBP2 (Fig. 1). Por otro lado, el potencial de los mutantes FBP2 N-terminalmente truncados para
proteger las mitocondrias contra el hinchamiento disminuyó notablemente (más de 2 veces), en
comparación con la enzima WT (Fig. 1). Fue especialmente evidente en el caso del mutante 10Del
N, cuyo potencial de protección Ca2 + no fue estadísticamente diferente de FBP1 o BSA.

En conjunto, estos experimentos proporcionaron los primeros datos que dilucidaban la base
estructural de la interacción FBPasa-mitocondrias. Los resultados presentados aquí muestran que
se requiere la estructura cuaternaria similar a la del estado-R de FBP2, estabilizada por su región
N-terminal, para la asociación de FBP2 con mitocondrias. Esto sugiere que los mismos residuos
conservados tienen en cuenta la alta afinidad con AMP y la especificidad de la interacción FBPasa-
mitocondrias musculares, y respalda la hipótesis planteada recientemente de que FBP2 evolucionó
como regulador no solo del almacenamiento de glucógeno, sino también de la integridad
mitocondrial en músculo contraído.

Debido a que la FBPasa hepática no interactúa con las condiciones mitocondriales no

dependientes, nuestros resultados también implican que la estructura cuaternaria activa (estado
R) de la FBPasa muscular debe diferir significativamente de la hepática.

Fig. 1. El efecto de diferentes formas de FBPasa sobre la inflamación mitocondrial inducida por Ca2
+ y baja. El hinchamiento se controló mediante la disminución de la absorbancia de la luz a 540 nm
y se expresó como un porcentaje del hinchamiento de la línea base de las mitocondrias no
tratadas (control). + Ca - mitocondrias tratadas con Ca2 + 0,3 mM (A) o Ca2 + 0,01 mM (B); FBP1,
FBP2, 10DelC, S320A, Y57W, 7DelN, 10DelN - mitocondrias preincubados antes de agregar Ca2 +
con la forma respectiva de FBPasa. Los valores que difieren significativamente (p <0.05) del valor
que representa la hinchazón inducida por Ca2 + están marcados con asteriscos. Los resultados
representan la media y S.D. de al menos tres experimentos independientes.

Fig. 2. El efecto de AMP sobre la capacidad del mutante WT FBP2 y Y57W para proteger la
mitocondria contra la hinchazón inducida por calcio. Control - mitocondrias no tratadas; + AMP -
mitocondrias tratadas con AMP 0,3 \ mu M; + Ca - mitocondrias tratadas con Ca2 + 0,01 mM; + WT
/ + Y57W + (AMP + Ca) - los orgánulos preincubados con una de las formas FBP2 antes del
tratamiento con AMP y Ca2 +; (WT / Y57W + AMP) - Las formas FBP2 se preincubaron con AMP
bajo (0,3? M) o alto (10? M, marcado como h) antes de agregar a la mitocondria y tratamiento con
Ca2 +. Los resultados representan la media y S.D. de al menos tres experimentos independientes.

Fig. 3. Co-localización de FBPasa y mitocondrias. Las células HL-1 se transfectaron con diferentes
formas de FBP conjugada con FITC (verde) y se contratiñeron con MitoTrackerDeep Red FM (rojo).
El grado de superposición de la señal verde y roja se presenta como el coeficiente de correlación
de Pearson (r). (A, C) FBP2 (A) y mutante S320A de tipo silvestre (C) introducidos en células HL-1
en condiciones de control; (B, D - H) células HL - 1 tratadas con el inhibidor de GSK3 y
transfectadas con: FBP2 de tipo salvaje (B); Mutante S320A (D); FBP1 de tipo silvestre (E); Mutante
7Del N mutante (F) 10Del N (G); Mutante 10Del C (H). Bar = 10? M.