Las Estrategias de Biorremediación para El Diesel y El Biodiesel en Oxisol Del Sur de Brasil

201754 Las
Estrategias de biorremediación para el diesel y el biodiesel en oxisol del sur de Brasil
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Internacional biodeterioro y biodegradación
Volumen 95, parte B , 2014 Noviembre de Páginas 356363
las estrategias de biorremediación para diesel y biodiesel en
oxisol del sur de Brasil
Daniel Meyer Derrossi una ,Sabrina Anderson Beker una ,Francielle Bücker una ,Maria do Carmo Ruaro
Peralba b ,Ana Paula Guedes Frazzon c ,Júlio Flávio Osti c ,Robson Andreazza d ,
Mostrar más
https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2014.01.026 Obtener los derechos y
contenidos
Reflejos
• Se investigó la biorremediación de diesel, biodiesel y mezcla de B20 en Brasil.
• Hemos observado biodegradación más del 93% de B0; B20 y B100 después de 60
días.
• B100 presenta degradabilidad menor en comparación con B0 y B20 para la
atenuación natural.
• PCRDGGE mostró que la diversidad microbiana se vio afectada por ensayos de
biorremediación.
Abstracto
Fugas y derrames durante la extracción, transporte y almacenamiento de petróleo y sus
derivados pueden resultar en la contaminación ambiental. El biodiesel es una fuente de
energía alternativa que puede contribuir a una reducción de la contaminación del medio
ambiente. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la biodegradación de diesel,
biodiesel, y una mezcla de biodieseldiesel 20% en oxisoles desde el sur de Brasil, el uso
de dos estrategias de biorremediación: atenuación natural y bioaumentación /
bioestimulación. Biodegradación de combustible se monitorizó durante 60 días por la
actividad deshidrogenasa, CO 2 cromatografía evolución y gas. El inóculo bacteriano
empleado para bioaumentación / bioestimulación consistía en Bacillus megaterium ,
Bacillus pumilus , Pseudomonas aeruginosa , y Stenotrophomonas maltophilia y PCR
DGGE utilizando 16S ARNr cebadores mostraron que algunos miembros de este
consorcio sobrevivieron en el suelo después de 60 días. La biodegradación de biodiesel
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0964830514001292 1/29
201754 Las Estrategias de biorremediación para el diesel y el biodiesel en oxisol del sur de Brasil
puro fue mayor para bioaumentación / bioestimulación que para la atenuación natural, lo
que sugiere que la adición del consorcio microbiano, junto con el ajuste de la relación de
Búsqueda Avanzada
macronutrientes, el aumento de la degradación de biodiesel. Los resultados de la
actividad deshidrogenasa y respiratorio, junto con el análisis GC, sugirieron que la
presencia de biodiesel puede, estimulando el metabolismo de degradación microbiana
en general, aumentar la biodegradación de diesel de petróleo. La comunidad microbiana
fue alterada por ambos tratamientos, con la atenuación natural producir un índice de
diversidad más bajo que el suelo enmendado. La estrategia / bioestimulación
bioaumentación se mostró tener un alto potencial para la limpieza de suelos
contaminados con mezclas de diesel y biodiesel.
Palabras clave
diesel ;El biodiesel ;La atenuación natural ;Bioaumentación / bioestimulación ;PCR
DGGE
1. Introducción
Los procesos de extracción, refinación, transporte, y almacenamiento de petróleo y sus
derivados son propensas a presentar fugas y / o se derrame accidentes, lo que resulta
en la contaminación ambiental ( Tahhan et al., 2011 ). En el Estado de Sao Paulo, Brasil,
se consideran las estaciones de combustible para producir el 78% de la superficie total
contaminados, causadas por edad, fugas en los tanques de almacenamiento
subterráneos ( CETESB, 2011 ). Con el fin de reducir este tipo de problema ambiental,
los países industrializados han aprobado leyes ambientales que indica que las
empresas contaminantes deben pagar por el daño ambiental causado, y esto se está
convirtiendo cada vez más caro. Se están desarrollando estrategias en muchos países
para reducir el impacto ambiental de los derrames de hidrocarburos.
El incentivo y / o obligación de que la adición de porcentajes más altos de combustibles
como el biodiesel, producidos en Brasil principalmente de soja (84%) y sebo de vacuno,
está dirigido a incrementar el uso de fuentes de energía renovables. Los
biocombustibles tienen algunas ventajas en comparación con los combustibles
derivados del petróleo debido a su alto potencial de biodegradabilidad, que es debido a
la presencia de ácidos grasos fácilmente oxidables y la ausencia de hidrocarburos
aromáticos y azufre. Además, el biodiesel es un combustible más respetuoso del medio
ambiente, debido a los niveles más bajos de CO, CO 2 , SO 2 y las partículas de material
liberado a la atmósfera ( Bento et al., 2006 ; Lermontov y Ushakova, 2008 ; . Atadashi et
al, 2010 ; Chao et al., 2010 ; . Bücker et al, 2011 ). El uso de biocombustibles también
puede disminuir los impactos sobre la contaminación de las aguas subterráneas ( Ma et
al., 2013 ).
Niveles relativamente bajos de biodiesel añadido a diesel convencional pueden
aumentar la biodegradabilidad de la mezcla total, debido a cometabolismo ( Zhang et
al., 1998 ; Mudge y Pereira, 1999 ; . Pasqualino et al, 2006 ; Horel y Schiewer, 2011 ).
Las organizaciones ecologistas de todo el mundo han sido alentadores disposición de
residuos de hidrocarburo en los sitios adecuados con niveles de contaminación
aceptables. Al mismo tiempo, varias estrategias de remediación están llevando a cabo
en muchos países en un intento para descontaminar los numerosos sitios ya afectados
por derivados del petróleo. Técnicas biológicas física, química, y se pueden emplear
juntos, con el objetivo de reducir la contaminación orgánica a niveles aceptables de
seguridad, de conformidad con la legislación de cada país ( Reddy et al., 1999 ). Muchas
técnicas están disponibles para el tratamiento de áreas contaminadas; la elección
depende de la naturaleza del contaminante y de su concentración, las características de
cada sitio, los requisitos reglamentarios, los costes de funcionamiento, y el tiempo de
degradación del compuesto orgánico ( RiserRoberts, 1998 ; Reddy et al., 1999 ).
La biorremediación, siendo una técnica relativamente barato, puede emplearse como
una alternativa para la descontaminación de las zonas afectadas, una que ofrece la
posibilidad de degradar contaminantes tóxicos utilizando principalmente
microorganismos con el metabólica y capacidad fisiológica de utilizar compuestos
orgánicos peligrosos como fuente de carbono y energía . En la mayoría de los entornos,
la selección y el enriquecimiento de las comunidades degradantes autóctonas comienza
tan pronto como se produce la contaminación ( Margesin y Schinner, 2001 ) y, de las
estrategias de biorremediación disponibles, la atenuación natural es una técnica de bajo
costo para el suelo y el agua subterránea que emplea estos microorganismos que ya
están presentes en el sitio. Bioaumentación es una estrategia que puede ayudar a
mejorar la capacidad de un área contaminada para eliminar los contaminantes mediante
la adición de una cepa aislada o un consorcio de microorganismos potencialmente
degradantes. El inóculo puede ser seleccionado del sitio contaminado (microorganismos
autóctonos), o de otros sitios afectados (exógeno). Algunos autores favorecen el uso de
consorcios en lugar de un único aislado, ya que muchos microorganismos tienen el
potencial sólo para biotransformar un compuesto tóxico en compuestos intermedios de
la vía de degradación y otras especies son necesarios para completar el proceso (
Sayler et al., 1990 ; Fantroussi y Agathos, 2005 ). La adición de nutrientes junto con
microorganismos puede acelerar el proceso de combustibledegradantes ( Tyagi et al.,
2011 ). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el uso de tales nutrientes además de
un consorcio degradantes aislado del sitio de tratamiento en tierra de una planta
petroquímica en el sur de Brasil, la comparación de la atenuación natural yBúsqueda Avanzada
bioaumentación / bioestimulación para la remediación de un oxisol contaminada por el
diesel puro ( B0), el biodiesel puro (B100), o una mezcla diesel / biodiesel (B20).
2. Materiales y métodos
2.1. Muestras de terreno
Las muestras de superficie de suelo de un área sin historia contaminación se recogieron
a una profundidad de 020 cm (Horizon). El suelo se clasifica como (oxisol Soil Survey
Staff, 1999 ); que se recogió de una zona situada cerca de la carretera federal BR386,
que se encuentra en el pueblo de Fazenda Vilanova, Rio Grande do Sul, Brasil (29 ° 34
'43,6 "S, 51 ° 50'33,8" W). Después del muestreo, el material se tamizó a 2 mm. Las
características del suelo se determinaron por el laboratorio del Departamento de Suelos
de la Facultad de Agronomía de la Universidad Federal de Rio Grande do Sul y por el
Laboratorio de Suelos de la Fundación de Pesquisa Agropecuaria de Porto Alegre, RS,
Brasil, de acuerdo con las metodologías descritas en Tedesco et al. (1995) ( Tabla 1 ).
Tabla 1.
características físicoquímicas del suelo oxisol.
características Profundidad (020 cm) NVD
1
Materia orgánica (g kg ) 25
Clay (%) 45
Arena fina (%) 19
arena gruesa (%) 13
Silt (%) 23
Carbono (g kg orgánicos 1 ) 17
Nitrógeno total (g kg 1 ) 1.6
P disponible (mg dm 3 ) 0.4
K disponible (mg dm 3 ) 165
CTC eficaz (mmol c dm 3 ) una 6.4
CTC pH7 (mmol c dm 3 ) b 10.2
Al (mmol c dm 3 ) 0.1
Ca (mmol c dm 3 ) 4.6
Mg (mmol c dm 3 ) 1.2
H + Al (mmol c dm 3 ) 3.9
pH (H 2 O) 5.5
Índice de SMP 6.1
un Cantidad de cargos a pH del suelo original.
segundo Cantidad de cargos a pH 7.
opciones de la tabla
2.2. Combustible
Las muestras de aceite metropolitana diesel que contiene 500 ppm de azufre, y el
biodiesel de soja metilo, proporcionado por Ipiranga Produtos de Petróleo y BSBIOS
(Rio Grande do Sul, Brasil), se utilizaron como diesel puro (B0), el biodiesel puro (B100)
o una mezcla de B20 ; éstos se añadieron a la tierra sin ninguna esterilización. Los
combustibles se almacenaron en frascos oscuros para protegerlos de fotooxidación.
2.3. experimentos de biorremediación de suelos
Trescientos gramos de cada suelo se colocaron en matraces de respirometría (1 l) y la
humedad se ajustó a 60% de la capacidad de campo. Los suelos fueron entonces
contaminados con los combustibles (B0, B20 y B100) mediante la adición de 30 ml de
combustible por kilogramo de suelo húmedo, la simulación de un derrame de superficie.
Para la prueba de atenuación natural, sólo los microorganismos autóctonos estaban
presentes, y no se añadieron nutrientes. Para bioaumentación / bioestimulación, un
inóculo formado de cuatro aislamientos bacterianos con concentración final de 2 × 10 8
UFC g 1 se introdujo ( Bento et al., 2003 ;) estos fueron Bacillus megaterium , Bacillus
pumilus , Pseudomonas aeruginosa , y Stenotrophomonas maltophilia . Además del
inóculo, NH 4 NO 3, y KH 2 PO 4 se añadieron para ajustar el C: N: P relación a 120: 10: 1,
según lo sugerido por Jiménez et al. (2007) . La actividad microbiana durante la
degradación se evaluó mediante respirometría y ensayo deshidrogenasa. La
cromatografía de gases se usó para estimar el porcentaje de combustible degradado. Se
utilizó reacción desnaturalizante cadena de la polimerasa electroforesis en gel de
gradiente (PCRDGGE) para evaluar el perfil de la comunidad microbiana después de
60 días de incubación. Todos los experimentos, llevados a cabo por triplicado, se
incubaron durante 60 días.
2.4. actividad respiratoria
La actividad respiratoria microbiana en los matraces se evaluó como la liberación
acumulativa de CO 2 ( Stotzky, 1965 ). El sistema de captura en cada matraz constaba
de un vaso de plástico suspendido que contiene 20 ml de / L NaOH 0,75 mol. Frascos sin
suelo se utilizaron como controles. Los matraces se mantienen herméticamente cerrada
y abierta sólo periódicamente para determinar la respiración basal. CO 2 se determinó
como sigue: 3 ml de BaCl 2 · 2H 2 O se añadieron 30% y 3 gotas de fenolftaleína al 1% y
NaOH residual se valoró con HCl 0,5 mol / L. El gas carbónico producido se calculó
Búsqueda Avanzada
utilizando la ecuación. (1) :
( 1 )
Girar en
donde V B es el volumen en ml de HCl 0,5 mol / L utilizado para valorar el control; V A
es el volumen en ml de HCl 0,5 mol / L utilizado para valorar el tratamiento; M C es la
masa molar de carbono en g / mol; M HCl es la concentración en mol / L de la solución
de HCl estandarizado; FC es el factor de corrección para la molaridad ( M HCl / M NaOH
) y m es la masa en kg de suelo seco en el matraz.
2.5. La actividad deshidrogenasa
La actividad de la deshidrogenasa se determinó según Thalmann (1968) y Alef (1995) ,
con modificaciones. De cada matraz respirometría, se recogieron 2 g de suelo húmedo y
se añadió a 2 ml de una solución de 2,3,5trifeniltetrazolio cloruro de (TTC) al 0,9% en
tampón TrisHCl pH 8. La mezcla se colocó en un tubo y se incubó a 30 ° C durante 24 h.
Después de la incubación, se añadieron 16 ml de acetona para detener la reacción
enzimática y, después de la homogeneización, el tubo se dejó en la oscuridad durante 2
h. La suspensión de suelo se filtró y la absorbancia del filtrado se midió a 546 nm. Una
curva estándar fue construida para cuantificar los valores de triphenylformazam (TFP
mL 1 ) en cada muestra.
2.6. la extracción de combustibles a partir de muestras de suelo
Para determinar la biodegradabilidad de los hidrocarburos y ésteres presentes en los
matraces de respirometría, dos análisis cromatográficos se llevaron a cabo en el tiempo
cero y al final del experimento (60 días). Antes de tomar la muestra, el suelo se mezcló
con una espátula para garantizar la homogeneidad. Muestras compuestas se recogieron
entonces en cinco puntos equidistantes dentro de cada matraz; cada colección era de 5
g de suelo, dando un total de 25 g por matraz. Las muestras de suelo se mantuvieron a
18 ° C antes de alimentar la extracción. Esto se llevó a cabo en un aparato Soxhlet
durante 12 h, utilizando una mezcla metanol pesticida grado / diclorometano (1: 3 v / v) (
USEPA, 1996 ). El material extraído se concentró en un evaporador rotatorio (RV 05 ST
IKA WERKE) a 50 rpm. Agua residual se eliminó mediante la adición de sulfato de sodio
anhidro. El extracto se lavó con diclorometano pesticida de grado y se transfiere a un
nuevo matraz, que se dejó en una campana de humos para la evaporación hasta que se
alcanzó una masa constante. Las muestras se almacenaron a continuación a una
temperatura de 18 ° C antes de análisis cromatográfico.
2.7. la degradación del combustible
Degradación de combustible se evaluó por TPH (hidrocarburos totales de petróleo)
mediciones para B0 y B20 y por ésteres totales para B20 y B100, en el comienzo (tiempo
cero) y en el extremo (60 días) del experimento. Para diesel puro y para B20,
hidrocarburos en el rango de C 8 C 28 se evaluaron. Los análisis se comparan con los
lotes de combustible iniciales empleadas en los experimentos de biodegradación. El
porcentaje de degradación se calculó de acuerdo con la ecuación. (2) :
( 2 )
donde DTi y DTF son los valores de TPH en los puntos de tiempo inicial y final,
respectivamente. TPH = hidrocarburos totales de petróleo. Búsqueda Avanzada
Ésteres totales se determinaron utilizando un cromatógrafo de control de presión Dani
GC Digital (DPC) con un detector de ionización de llama (FID). Se utilizó un vaporizador
(LPTV) inyector de temperatura lineal programado con una división de 01:15; la
programación del inyector fue de 118 ° C / 0,75 min, aq 999 ° C / min, 175 ° C / 20 min.
Una columna DBWax (30 m x 0,32 mm x 0,25 m) se utilizó a una temperatura inicial de
la columna de 50 ° C / 6 min y temperatura final de 230 ° C, velocidad de calentamiento
de 5 ° C / min, tiempo de retención 6 min , temperatura de detección 260 ° C, el flujo de
gas (N 2 ) 10 ml / min y el tiempo de funcionamiento 6 min (ASTM D 6584 y EN 14110).
Los hidrocarburos de petróleo totales se determinaron mediante el método descrito en
EPA 8015B. Las muestras de suelo se extrajeron con hexano y diclorometano 1: 1,5 y 2! l
del extracto se inyectó en un cromatógrafo de gases (Dani GC1000) con columna capilar
FID y VF5MS (30 m x 0,53 mm x 1,5 m). El nitrógeno se empleó como gas portador y la
concentración de hidrocarburos se cuantificó utilizando un estándar externo. El límite de
detección del método fue de 0,05 mg / kg.
2.8. la extracción de ADN de suelo y análisis de PCRDGGE
Se extrajo el ADN de 300 mg de suelo utilizando el kit de aislamiento de ADN PowerSoil
(MO BIO Inc., EE.UU.). El V3 región variable del gen 16S rRNA bacteriano se amplificó
por PCR usando el BA338F cebadores universales (5'ACTCCTACGG GAGGCAGCAG)
unida a una abrazadera de GC y UN518R (5'ATTACCGCGGCTGCTGG). La mezcla de
amplificación contenía 15 ng / l de molde de ADN, 1 U de Taq ADN polimerasa Platinum
(Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), 1,5 mM MgCl 2 , 200? M de dNTP y 5 p molar de cada
cebador universal, en un volumen final de 25 l. Las condiciones de amplificación de PCR
fueron: 5 min a 94 ° C, 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min a 55 ° C, y 1 min a 72 ° C,
seguido por una extensión final de 10 min a 72 ° C . La amplificación se llevó a cabo en
un termociclador TX96 Plus (AMPLITHERM). Los productos amplificados se analizaron
en agarosa al 1,5%, teñido con bromuro de etidio (5 g / l) y se visualizaron con luz
ultravioleta. Los amplicones se analizaron por DGGE como se describe por Ovreas et al.
(1997 ). Los geles contenían 8% de acrilamida: bisacrilamida (37.5: 1, w: w) y un
gradiente de desnaturalización de 1555% de formamida y urea. La electroforesis se
realizó a 200 V durante 3,5 h en un Sistema de Dcode TM (BioRad Inc., Hercules,
EE.UU.). El gel se tiñó con Syber Seguro (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil) durante 30 min.
Las imágenes fueron adquiridas con un sistema de documentación fotográfica Kodak
GL2200. Perfiles de bandas se compararon mediante el software de Gel ProAnalizer
3.1. Dendogramas se generaron a partir del análisis del coeficiente DADOS utilizando
los NTSYS programa para Windows. Los perfiles de la banda fueron utilizados para
estimar la diversidad por el índice de ShannonWeaver ( H '). La diversidad ( H ') se
calculó utilizando la fórmula H ' = S p i ln ( p i ), donde p i es la proporción de individuos
que pertenecen a la i ésima especie. Cada banda DGGE fue tratada como una unidad
operativa taxonómica (TOU). El análisis de datos se realizó utilizando el programa
proporcionado por Chang Bioscience, disponible en http://www.changbioscience.com/g
enetics/shannon.html .
2.9. análisis estadístico
Los resultados se analizaron mediante ANOVA con un nivel de confianza del 95%, y, si
eran significativas, se aplicó la prueba de Tukey (comparación entre los valores medios)
utilizando el programa Sisvar, versión 4.6 (Built 60).
3. resultados
3.1. CO 2 evolución
Los resultados de CO 2 evolución de más de 60 días de incubación de suelo
hidrocarburo contaminada y no contaminada se muestran en la Fig. 1 . Hubo niveles más
altos de CO 2 evolución en los tratamientos con el suelo contaminado que en el negativo
(no contaminada) controles. En ausencia de suplementos de suelo, tasas de respiración
en diesel puro y B20 fueron similares, pero biodiesel puro (B100) mostró una actividad
significativamente mayor ( Fig. 1 y Tabla 2 ). Higo. 1 muestra dos grupos diferentes para
CO 2 resultados de evolución; el grupo más eficiente contiene bioaumentado / B20 y
B100 biostimulated, y el segundo grupo (actividad menor) contiene la atenuación natural
y bioaumentado B0 / biostimulated.

Búsqueda Avanzada
Higo. 1.
Acumulativa CO 2 Producción por respirometría en el suelo oxisol contaminada por diesel y / o biodiesel
durante 60 días de incubación. A NC (A: Atenuación Natural; NC: control sin contaminación). B NC (B:
bioaumentación / bioestimulación; NC: control sin contaminación). B0: diésel puro; B20: 20% de biodiesel
añadido al diesel; B100: el biodiesel puro.
opciones figura
Tabla 2.
Comparación de los métodos de biodegradación: actividad deshidrogenasa, acumulativo CO 2 producción
y porcentaje de degradación de Diesel / mezclas de biodiesel (B0, B20 y B100) después de 60 días para
dos estrategias de biorremediación [atenuación natural (A) y Bioaumentación / bioestimulación (B)] en
oxisol suelo.
Tratamiento deshidrogenasa La producción acumulada de CO 2 (mg kg porcentaje de

1
de suelo seco) (60 días) biodegradación (%)
Un Carolina 8,40 e 265,77 correo ND 2
del Norte
Un B0 20.51 d 2.247,53 d 90.42a ± 6,49
b
Un B20 57.83 2.125,03 d 91.10a ± 0,17
Un B100 37.00 c 2982.56 c 50.75b ± 9,60
B Carolina del 5,61 e 264.63 correo DAKOTA DEL
Norte NORTE
B0 B 26.49 C, D 2.268,98 d 99.16a ± 0,41
C, D
B B20 28,58 3.661,26 b 94.05a ± 1,49
B B100 158.24 una 3886,93 una 97.00a ± 4,27
A Atenuación natural; B bioaumentación / bioestimulación.
Letras iguales no son estadísticamente diferentes y diferentes letras son estadísticamente diferentes
entre los tratamientos usando la prueba de Tukey. a, b, c, d, e, p <0,05. A NC: control de la atenuación
natural sin contaminación. Un B0: Atenuación natural con diesel puro. Un B20: B20 con Atenuación
Natural. Un B100: Atenuación natural con biodiesel puro. B NC: Bioaumentación de control /
bioestimulación sin contaminación. B B0: Bioaumentación / bioestimulación con el diesel puro. B B20:
Bioaumentación / bioestimulación con B20. B B100: Bioaumentación / bioestimulación con biodiesel puro.
1 Promedio de 6 puntos de control durante 60 días de incubación.
2 No detectado TPH valores (hidrocarburos totales de petróleo) en el suelo (ND).
La estrategia / bioestimulación bioaumentación produjo diferencias significativas en la
actividad respiratoria microbiana dependiendo de la concentración de biocombustibles
(B100> B20> B0) ( p <0,05) ( Tabla 2 ). Decreciente, la actividad respiratoria acumulada
después de 60 días de incubación para matraces que contenían de biodieselera B /
B100> B / B20> A / B100> A / B20) ( p <0,05), donde B = tratamiento bioaumentación y A
= atenuación natural (sin adiciones) ( Tabla 2 ). La mejor CO 2 evolución fue en los
matraces B100 bioaumentado (3886,93 mg / kg de suelo seco). Estos resultados
demuestran el gran potencial de la estrategia de tratamiento bioaumentación /
bioestimulación para la biorremediación.
3.2. La actividad deshidrogenasa
En la estrategia de atenuación natural, la actividad deshidrogenasa mostró una
tendencia a disminuir, especialmente para B100, durante los 60 días de incubación ( Fig.
2 ). Por otro lado, la bioaumentación / bioestimulación provocó un aumento de la
actividad deshidrogenasa. Bioaumentación / bioestimulación con B100 produce la más
alta actividad de la deshidrogenasa, pero, de forma inesperada, la actividad con B20
mezclas fue mayor con la atenuación natural que con bioaumentación / bioestimulación (
Tabla 2 ).

Búsqueda Avanzada
Higo. 2.
actividad deshidrogenasa en suelo oxisol: (A) Atenuación Natural y (B) bioaumentación / bioestimulación
durante 60 días de incubación. A NC: control de la atenuación natural sin contaminación. Un B0:
Atenuación natural con diesel puro. Un B20: B20 con Atenuación Natural. Un B100: Atenuación natural
con biodiesel puro. B NC: Bioaumentación de control / bioestimulación sin contaminación. B B0:
Bioaumentación / bioestimulación con el diesel puro. B B20: Bioaumentación / bioestimulación con B20.
B B100: Bioaumentación / bioestimulación con biodiesel puro.
opciones figura
Higo. 2 muestra que la actividad más alta hidrogenasa en el tiempo cero fue para la
atenuación natural (grupo A) con A / B100 (76,06 g de formazan de trifenilo (TPF) por
gramo de suelo seco) y A / B20 (74,30 g de TPF por gramo de suelo seco ), seguido de
bioaumentación (grupo B) con B / B100 (56,79 g de TPF por gramo de suelo seco).
Después de 60 días, se obtuvieron los mejores resultados para los tratamientos B / B100
(312,15 g de TPF por gramo de suelo seco), B / B0 (92,31 g de TPF por gramo de suelo
seco), y A / B20 (65,39 g de TPF por gramo de suelo seco). Tratamiento B / B100
presenta la actividad enzimática más alta desde el día 21 hasta el final del experimento (
Fig. 2 ). Los tiempos cero y 7 días mostraron valores más altos para la atenuación
natural, pero desde el día 20 de incubación se observó una disminución en la actividad.
Para el grupo B (bioaumentación / bioestimulación), fue posible ver los altos niveles de
actividad de la enzima a partir del día 21 de la incubación durante B / B0, B / B20, y B /
B100 ( Fig. 2 ). Este grupo mostró un aumento de la actividad con el tiempo de
incubación, alcanzando valores de 368,12 y 312,15 g de TPF por gramo de suelo seco a
los 49 y 60 días de incubación, respectivamente.
No TPH se detectó en oxisol no contaminado ( Tabla 2 ). Los mejores resultados,
mostrados en los tratamientos bioaumentación / bioestimulación para B0, B100 y B20
(99, 97 y 94% de biodegradación, respectivamente), no fueron significativamente
diferentes entre sí. El menor porcentaje de biodegradación se produjo con la atenuación
natural y B100; este fue significativamente diferente de los niveles alcanzados con otros
tratamientos ( p > 0,05).
3.3. Los análisis cromatográficos
Hidrocarburos y la degradación éster después de 60 días de incubación se muestran en
la Tabla 2 . Estos datos se comparan tres variables. Para los tratamientos B0 y B20,
todos los resultados mostraron valores alrededor del 90% de la degradación de los
combustibles analizados. Sin embargo, los porcentajes de degradación B100 fueron
estadísticamente mayor para el grupo bioaumentación / bioestimulación (B) que para la
atenuación natural (A). B / B100 mostró una alta degradación de ésteres (97%). No
había ninguna diferencia entre los porcentajes de degradación en cualquiera de los
matraces de grupo a.
3.4. análisis de DGGE
Análisis del patrón de migración banda en DDGE por UPGMA se muestra en la Fig. 3 .
La adición del consorcio microbiano tendió a aumentar el índice de diversidad, excepto
en el caso de B0 ( Tabla 3 ). Los tratamientos que recibieron el consorcio todos
presentan bandas similares, que se muestran por las flechas en la Fig. 3 y por el análisis
dendograma ( Fig. 4 ). Para B0 y B20, el patrón de banda que representa algunos de los
miembros del consorcio persistió durante 60 días de incubación (flecha blanca superior).
Para B100 tratamiento, dos bandas mostraron el mismo patrón de migración al
consorcio bacteriano ( Fig. 3 ). Ninguna de estas bandas se observaron en el control
Búsqueda Avanzada
negativo (suelo no contaminado). La presencia continua de los miembros del consorcio,
indicado por estos resultados, puede haber contribuido al aumento de la degradación de
combustible, principalmente para B100 ( Fig. 4 ). La adición de diversas concentraciones
de biocombustibles asociados con macronutrientes aparentemente contribuido a
mantener al menos un miembro del consorcio en la comunidad microbiana después de
60 días, pero sólo para el tratamiento B / B100 hubo diferencias significativas en la
biodegradabilidad, en comparación con la atenuación natural ( Tabla 2 ).
Higo. 3.
Bacterial comparación de perfiles de comunidad entre atenuación natural (A) y bioaumentación /
bioestimulación (B) después de 60 días de incubación utilizando electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante (DGGE), basado en la amplificación del gen 16S de ARNr. Las flechas blancas
comparan los patrones de bandas consorcio con los tratamientos de bioaumentación / bioestimulación.
opciones figura
Tabla 3.
Determinación del índice de diversidad de ShannonWeaver para los tratamientos de biorremediación
después de 60 días de incubación.
Tratamiento índice de diversidad de ShannonWeaver
Un Carolina del Norte 2.08
Un B0 2.64
Un B20 2.08
Un B100 2.30
B Carolina del Norte 2.39
B0 B 2.64
B B20 2.08
B B100 2.70
Higo. 4.
UPGMA análisis dendrograma de la comunidad bacteriana patrones DGGE de bandas de las muestras
recogidas analizada durante el proceso de biorremediación. El X eje y representa el porcentaje de
similitud, basado en el coeficiente de Dice.
opciones figura
El índice de diversidad ShannonWiener mostró que la mayor diversidad fue producido
por la estrategia de bioaumentación / bioestimulación con B100 mezcla, y esto también
dio los mejores resultados de degradación ( Tabla 3 ). B0 mezcla (diesel puro) mostró un
índice de ShannonWiener de 2,64 tanto para el bioaumentación / bioestimulación y
tratamientos naturales de atenuación, pero B20 mostró el índice de diversidad más baja,
con valores de 2,08, tanto para el bioaumentación / bioestimulación y tratamientos
naturales de atenuación.
4. Discusión
Búsqueda Avanzada
El consorcio utilizado en estos experimentos fue elegido porque trabajo anterior sobre la
producción de actividad y el tensioactivo enzima había mostrado tener un buen potencial
para degradar B20 ( Meyer et al., 2012 ). Los microorganismos se muestran mediante
16S parciales rRNA secuenciación ser B. megaterium , B. pumilus , P. aeruginosa y S.
maltophilia ( Meyer et al., 2012 ). Estos géneros anteriormente se han citado como
participantes en los procesos de biodegradación de petróleo ( Atlas, 1981 ; Leahy y
Colwell, 1990 ; Donofrio, 1996 ; Chao et al., 2010 ; Thavasi et al., 2011 ; Taccari et al,
2012. ; Vázquez et al., 2013 ).
La medición de CO 2 de producción en el suelo es una forma indirecta de la estimación
de la descarboxilación de los compuestos orgánicos degradados en el sistema (
Margesin et al., 2000 ). La estrategia de bioaumentación / bioestimulación presentó
valores más altos para CO 2 evolución en comparación con la atenuación natural, lo que
sugiere que la adición del consorcio microbiano seleccionado, junto con nutrientes para
ajustar el C: N: P a 120: 10: 1, microbiano favorecida actividad de degradación. El
aumento de la tasa de respiración fue mayor para el biodiesel puro que el de B20 para
las dos estrategias. Lapinskien et al. (2006) y Silva et al. (2012) también detectado tasas
respiratorias superiores para B100 en comparación con otras mezclas de diesel /
biodiesel en los suelos. Esto sugiere que el diesel convencional es más resistente a la
descomposición microbiana y esto es obviamente debido a la presencia de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos, que son conocidos por ser más difíciles de
degradar que los ésteres de cadena larga presentes en el biodiesel. Nuestros resultados
sugieren que la presencia de biodiesel puede, estimulando el metabolismo de
degradación microbiana en general, aumentar la biodegradación de diesel de petróleo, y
esto también ha sido demostrado por Mariano et al. (2008) y Júnior et al. (2009) .
Algunos autores sugieren incluso el uso de biodiesel como un “disolvente” para eliminar
la fracción diesel a partir de ambientes contaminados, en el que actuaría como un
agente estimulante para la biorremediación ( Miller y Mudge, 1997 ; Taylor y Jones, 2001
; . Pasqualino et al, 2006 ).
Si aumenta la actividad de la deshidrogenasa, los aumentos de biodegradación
proporcionalmente, ya que muchas de estas enzimas participan en procesos
relacionados con la asimilación de carbono por el ciclo de Krebs ( Schinner et al., 1996 ;
Margesin et al., 2000 ). Nuestros resultados sugieren que la adición de nutrientes como
nitrógeno y fósforo, al menos para estos tratamientos, fue decisivo para el aumento en el
metabolismo microbiano. El retardo relativo de la actividad enzimática observada en la
estrategia de bioaumentación / bioestimulación probablemente ocurrió debido al tiempo
necesario para la adaptación del consorcio bacteriano. Las diferentes condiciones de
suelo de aquellos de los que el consorcio se obtuvo puede haber frenado el crecimiento
de la población microbiana durante los primeros 21 días de incubación.
Margesin et al. (2000) han informado de resultados similares para la biodegradación de
hidrocarburos, que muestra que la actividad de la deshidrogenasa, a diferencia de la
respiración microbiana, presenta fluctuaciones durante las primeras semanas,
alcanzando valores de las enzimas más altas sólo entre el día 11 y 25 de la incubación
de 90 días. En un estudio similar, se detectaron las mejores respuestas para la actividad
hidrogenasa sólo entre el 4 y el 8 semana de incubación ( Xu y Lu, 2010 ). En el presente
estudio, algunos tratamientos no mantenían la actividad enzimática durante todo el
período de incubación en la atenuación natural; escasez de micronutrientes en el suelo,
probablemente actuó como un factor limitante, a pesar de las altas tasas de degradación
se encontraron durante los primeros días, cuando suficientes nutrientes presentes para
mantener la actividad deshidrogenasa. Otras indicaciones para este provienen del
hecho de que la fracción de combustible más lábil se degradó en el comienzo de la
incubación.
En general, se encontraron los valores más altos de actividad enzimática para B100.
Esto está de acuerdo con Lapinskien et al. (2006) , que indican que el aumento del
porcentaje de biodiesel en el suelo de 1% a 12% aumento de la actividad
deshidrogenasa durante los 6 días de incubación, mientras que las concentraciones de
diesel puro por encima del 3% provocó disminución de la actividad.
Actividad de la deshidrogenasa se puede usar como un indicador de la contaminación,
así como de la actividad de biodegradación, ya que un gran grupo de deshidrogenasas
actuar en procesos de oxidación de compuestos orgánicos para la generación de
energía por la célula ( Xu y Lu, 2010 ). En el presente trabajo, los tratamientos con las
más altas tasas de respiración también eran aquellos con la actividad de la
deshidrogenasa más alta (A / B100, B / B0, B / B20, y B / B100).
Aunque los tratamientos B0 y B20 no mostraron diferencias de biodegradación
significativas entre las dos estrategias de biorremediación, todas las velocidades de
degradación de estos dos combustibles fueron relativamente alta después de 60 días
(por encima de 90,42%). El biodiesel puro (B100) presentó degradación menor en
comparación con diesel puro y la mezcla de B20 para la atenuación natural, pero fue
bien tratado por bioaumentación / bioestimulación, con mayor reducción de ésteres
totales que las concentraciones de biodiesel inferiores ( Tabla 2 ). Hubo un aumento en
la producción deshidrogenasa durante los dos últimos puntos de monitoreo de este
tratamiento (49 y 60 días), y la más alta acumulada de CO 2 evolución después de 60
días. Estos resultados sugieren un alto nivel de biodegradación de B100 para la
estrategia bioaumentación / bioestimulación. También sugiere que la población
Búsqueda Avanzada
microbiana autóctona fue eficiente para los tratamientos de B0 y B20 y puede competir
con el inóculo para las mismas fuentes de carbono del suelo. Algunos autores sugieren
que la bioaumentación más eficaz se logra mediante la repetición de la aplicación del
consorcio microbiano durante el periodo de degradación, debido a esta tendencia de la
población autóctona para superar el inóculo exógeno ( Tahhan et al., 2011 ). Esto podría
haber ocurrido en algunos de nuestros tratamientos, tales como B / B20, ya que el pH del
suelo era relativamente ácido, y podría haber limitado el establecimiento del consorcio,
al tiempo que permite bacterias autóctonas que florezcan ( Fig. 3 ). Debe recordarse, sin
embargo, que muchos hongos presentes en el suelo también pueden promover la
degradación y éstos pueden poseer una mayor tolerancia a pH ácido; el perfil de la
comunidad microbiana obtenida aquí por PCRDDGE considera sólo la comunidad
bacteriana.
La acidez del suelo conduce a la falta de nutrientes para la microbiota ( Atlas, 1988 ). Sin
embargo, una sola adición del consorcio bacteriano a la tierra, al comienzo de la
incubación, produjo el patrón de bandas bioaumentación / bioestimulación se muestra.
Hay discrepancias en la literatura acerca de la eficacia de esta estrategia (véase, por
ejemplo, Gentry et al., 2001 ; Boon et al., 2003 , con Møller et al., 1995 ; McKew et al.,
2007 ; Ueno et al ., 2007 ; Hosokawa et al., 2009 ). La degradación de los hidrocarburos
resulta de las interacciones de la comunidad y el potencial de biorremediación depende
de la capacidad de estos organismos añadidos a adaptarse a nuevas condiciones
ambientales ( Mishra et al., 2001 ). Microorganismos exógenos pueden ser menos
adaptables que los microbios indígenas ( Hosokawa et al., 2009 ), o se pueden competir
con organismos autóctonos ya competentes en la degradación de hidrocarburos, que
enmascaran los resultados de degradación de la estrategia de bioaumentación /
bioestimulación. En el presente estudio, el tratamiento A / B100 presenta bajo
degradantes potencial, pero, al mismo tiempo, algunos de los valores más altos para
deshidrogenasa y acumulativo CO 2 evolución. Estos resultados de alta pueden haber
sido generados no sólo por la degradación del biodiesel, sino también por asimilación de
materia orgánica del suelo por la cometabolismo; la presencia de biodiésel puro puede
haber contribuido a la capacidad de la comunidad microbiana degradantes de utilizar
otras fuentes de carbono en el suelo.
Alternativamente, o además de, los microorganismos pueden han utilizado
componentes de biodiesel distintos de los ésteres que se determinaron como una
medida de la biodegradación. De acuerdo con la norma internacional para la
especificación de biodiesel, la mezcla debe contener un mínimo de éster de 96,5%, un
máximo de glicerol total de 0,25% y 0,02% de glicerol libre, así como de los límites
aceptables de 0,8, 0,2, y 0,2% para los mono , di, y triglicéridos, respectivamente (
ANP, 2009 ; Atadashi et al., 2010 ). Sin embargo, el producto en el mercado puede no
siempre se corresponden con estas especificaciones. Las altas tasas metabólicas para
la actividad respiratoria y deshidrogenasa en tratamientos B100 pueden ser el resultado
del metabolismo de otros constituyentes de biodiesel. Aunque no hay literatura
comparación de las tasas de biodegradación de ésteres, glicéridos, y glicerol presente
en el biodiesel, se cree que los dos últimos componentes pueden ser preferidos por los
microorganismos degradantes, como sus procesos de asimilación en la célula son más
simples.
El uso de PCRDGGE en estudios de biorremediación puede ser una herramienta
importante para evaluar la diversidad microbiana en el suelo y los sedimentos ( Huijie et
al., 2011 ; Andreazza et al, 2012. ), Así como cambios en la comunidad microbiana
después de la adición de diversos compuestos tóxicos y no tóxicos ( Huijie et al., 2011 ; .
Bakar et al, 2013 ; . Cycon et al, 2013 ). La estructura de la comunidad microbiana del
suelo diesel contaminado ha sido investigada después de bioaumentación con una
bacteria de petróleodegradantes, una P. aeruginosa cepa ( Wongsa et al., 2004 ; Ueno
et al, 2006a. ), Mediante el uso de electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente
(DGGE ) y el seguimiento de la degradación del aceite diesel ( Ueno et al, 2006b. ; .
Ueno et al, 2007 ). En el presente estudio el efecto de dos estrategias de
biorremediación (atenuación natural y bioaumentación / bioestimulación) en la
estructura de la comunidad microbiana de diesel / biodiesel impactados y suelos
nonimpacted se analizó por PCRDGGE. Los resultados indicaron que los
microorganismos añadidos permanecieron en el suelo desde la inoculación hasta el final
del experimento para todos los combustibles utilizados. Esta fue una técnica útil para
mostrar la resistencia del consorcio bacteriano.
El índice de diversidad de ShannonWiener mostró valores similares para ambos
tratamientos (atenuación natural y bioaumentación / bioestimulación). Sin embargo, la
PCRDGGE mostró que la comunidad microbiana se vio afectada por los tratamientos al
final del experimento, como se ha demostrado previamente por otros autores. Los
cambios en la comunidad bacteriana durante la biorremediación de suelos
contaminados con diesel en biorreactores a escala de laboratorio se demostró por
Taccari et al. (2012) . Durante la etapa inicial del proceso, la bioestimulación y
bioaumentación aumento de la diversidad de especies (evaluado por análisis de DGGE)
y se observó que, después de una caída transitoria causada por diesel, la diversidad de
la comunidad bacteriana fue restaurado al final del proceso. La diversidad de la
comunidad del suelo puede ser cambiada por la aplicación de compuestos tóxicos, tales
como napropamida ( Cycon et al., 2013 ), PAH ( Huijie et al., 2011 ), los metales pesados
Búsqueda Avanzada
como el cobre ( Andreazza et al., 2012 ) , y otras sustancias tales como rojo congo (
Joshi et al., 2013 ), y el aceite diesel es también un material tóxico.
5. Conclusiones
El seleccionan consorcio bacteriano, junto con macronutrientes añaden al sistema, fue
eficaz en la aceleración de la biodegradación biodiesel puro en una oxisol. Se logró el
objetivo de biorremediación, ya que las altas tasas de biodegradación se encontraron
resultados para diesel puro y para el biodiesel 20:80: mezcla diesel tanto para este y la
atenuación natural (sin adiciones de suelo) estrategia. Más estudios sobre la
biodegradación de las diferentes fracciones de biodiesel (glicéridos, ésteres y glicerol)
deben llevarse a cabo con el fin de revelar cualquier ruta degradación microbiana
preferenciales. Sin embargo, la estrategia de bioaumentación / bioestimulación con el
consorcio actual exhibió un alto potencial para la biorremediación de mezclas de diesel y
biodiesel en el suelo. El análisis de la estructura de la comunidad microbiana por PCR
DGGE mostró que es posible determinar la supervivencia del consorcio, que puede ser
fácilmente controlado por este método.
Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer al Sr. Sérgio Luiz Viscardi y el Dr. Roberta Miranda
Teixeira de Ipiranga Petroleum Company, para proporcionar las muestras de biodiesel y
diesel. Los autores reconocen CNPq para un M.Sc. Beca. Este trabajo fue apoyado con
recursos del LAB BIOLaboratorio de biodeterioro de combustibles y biocombustibles y
de los programas de postgraduación en Ciencias del Suelo de la Agricultural and
Environmental Microbiology y Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil .
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Verificación de la degradación de nalcanos en el aceite diesel por Pseudomonas aeruginosa
cepa WATG en microcosmos del suelo
Curr. Microbiol., 52 (2006), pp. 182185
Ueno et al., 2006b A. Ueno, Y. Ito, Y. Yamamoto, I. Yumoto, H. Okuyama
Cambios comunidad bacteriana en microcosmos del suelo diesel de petróleo contaminado
biostimulated con medio LuriaBertani orbioaugmented con una bacteria de petróleo
degradantes, Pseudomonas aeruginosa cepa Wat G
J. Microbiol básico. (2006), pp. 46,31046,317
Ueno et al., 2007 A. Ueno, Y. Ito, I. Yumoto, H. Okuyama
Aislamiento y caracterización de las bacterias del suelo contaminado con aceite diesel y el
posible uso de estos en la bioaumentación autóctona
Mundial J. Microbiol. Biotechnol., 23 (2007), pp. 17391745
USEPA, 1996 USEPA MÉTODO 8015B Orgânicos Nonhalogenados Usando GC / FID [orgánicos no
halogenados usando GC / FID]
Disponible en: http://www.caslab.com/EPAMethods/PDF/8015b.pdf (, 1996) (consultado el 12.02.11)
Vázquez et al., 2013
S. Vázquez, B. Nogales, L. Ruberto, C. Mestre, J. ChristieOleza, M. Ferrero, R. Bosch, WP Mac
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Caracterización de consorcios bacteriana de suelos antárticos dieselcontaminada: hacia el
diseño de fórmulas adaptadas para bioaumentación
Wongsa et al., 2004 P. Wongsa, M. Tanaka, A. Ueno, M. Hasanuzzaman, I. Yumoto, H. Okuyama
Aislamiento y caracterización de nuevas cepas de Pseudomonas aeruginosa y Serratia
marcescens que poseen una alta eficiencia para degradar gasolina, queroseno, aceite diesel, y
aceite lubricante
Curr. Microbiol., 49 (2004), pp. 415422
Xu y Lu, 2010 Y. Xu, X. Lu
La biorremediación de suelos contaminados con petróleo crudo. Comparación de diferentes
tratamientos de bioestimulación y bioaumentación
J. Hazard. Mater., 183 (2010), pp. 395401
Zhang et al., 1998 X. Zhang, C. Peterson, D. Reece, G. Moller, R. Haws
Biodegradabilidad de biodiesel en el medio ambiente acuático
Trans. ASABE, 41 (1998), pp. 14231430
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