See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/235990787

Era Biotecnológica: Usos y Aplicaciones de la Biología Molecular en la Tecnología

de Alimentos

Article · July 2012

CITATIONS READS

0 10,629

5 authors, including:

Indira Perez Maria S. Tapia

University of Havana Central University of Venezuela
3 PUBLICATIONS   4 CITATIONS    81 PUBLICATIONS   2,216 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Marinela Barrero Guillermina Alonso

Central University of Venezuela Central University of Venezuela
23 PUBLICATIONS   64 CITATIONS    76 PUBLICATIONS   443 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Involvement of DNA methylation on bacterial biofilm formation View project

All content following this page was uploaded by Guillermina Alonso on 28 May 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

Memorias del Instituto de Biología Experimental vol.6:53-56 (2012)  Ediciones IBE

Era Biotecnológica: Usos y Aplicaciones de la Biología

Molecular en la Tecnología de Alimentos
INDIRA PEREZ1,2, AMARYS AGUILAR1,2, MARIA SOLEDAD TAPIA2, MARINELA BARRERO2 Y
GUILLERMINA ALONSO1
1
Laboratorio de Biología de Plásmidos, Instituto de Biología Experimental
2
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos
Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
Calle Suapure, Colinas de Bello Monte. Caracas - Venezuela
Email: guillermina.alonso@ciens.ucv.ve
La Biotecnología alimentaria aprovecha el desarrollo de la microbiología y la biología molecular para innovar en la
producción de alimentos de calidad más sanos y seguros, así como en el desarrollo de procesos industriales de producción
y control. En Venezuela son escasas las empresas del sector alimentario que emplean la biotecnología y las herramientas
moleculares para el desarrollo de este campo. Como un aporte a la industria nacional, en el laboratorio se han
estandarizado y aplicado herramientas para cubrir esta deficiencia en el ámbito de la Tecnología de Alimentos. Se
realizaron estudios dirigido a la caracterización e identificación molecular de bifidobacterias probióticas en productos
lácteos, con el fin de cuantificar y corroborar su presencia en el alimento comercializado en Venezuela. Asimismo se
estandarizaron metodologías para aislar el material genético y posterior aplicación de una PCR para la identificación de
muestras de atún fresco y enlatado, comercializados en el país, creando una herramienta confiable que permita distinguir
las especies que puedan ser enmascaradas bajo etiquetas falsas. Estas técnicas rápidas y confiables garantizan el control y
la calidad de estos alimentos, por lo que su uso puede ser una clave potencial para los sectores empresarial y
gubernamental.

Introducción variaciones fenotípicas que las células pueden exhibir

La biotecnología se ha valido de numerosas técnicas
moleculares que pueden ser utilizadas en distintos
campos de investigación relacionados con diversidad
de sectores productivos como la agricultura, el sector
farmacéutico, el biomédico, el químico y por
supuesto el sector alimentario. La aplicación de estas
tecnologías modernas permite la producción de
alimentos sanos y seguros. Sin embargo, los procesos
de industrialización así como la globalización de los
mercados, han hecho difícil mantener un control en el
procesamiento de los mismos. Las empresas del área
de alimentos deben mantener la trazabilidad o la
documentación de las etapas especificas de
producción, transformación y distribución de un
alimento para certificar la calidad, su origen y su
seguridad en relación a unos estándares conocidos.
Esto se dificulta y se hace necesario investigaciones
que permitan ratificar la transparencia en la cadena
alimentaria en cuanto al tipo o pureza de la materia
prima utilizada, como la presencia y calidad de los
ingredientes que lo conforman y que la industria
refleja en su etiquetado.
La identificación de especies de plantas o animales
con fines alimentarios solo con la observación de
características exteriores, tales como la forma, tamaño
o apariencia, es una tarea difícil y poco fiable (3). La
misma situación se presenta para la identificación de
cepas bacterianas probióticas en base a sus
características fenotípicas, ya que no siempre estas
pruebas proporcionan resultados confiables, debido a
dependiendo de las condiciones y los medios de
cultivo utilizados (4).
La genética molecular permite la identificación de los
organismos y sus productos gracias a su propio ADN
y no a una etiqueta asociada, utilizándose
fundamentalmente los métodos genotípicos de
tipificación basados en la amplificación de ácidos
nucleícos mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), pudiendo detectarse variaciones
intra-especies acoplando la reacción con el uso de
enzimas de restricción (PCR-RFLP). Esta técnica es
relativamente rápida, reproducible y sólida, que no
requiere de equipos costosos, y podría ser usada por
las agencias de inspección de alimentos para hacer
cumplir las regulaciones de etiquetado (6).
Alternativamente, las reacciones de PCR para
detectar secuencias repetitivas de los genomas
bacterianos (ERIC-PCR y REP-PCR), permite la
discriminación a nivel de género, especie e incluso de
cepas, basándose en el patrón electroforético de los
productos de amplificación (13).
En Venezuela, la Biotecnología está comenzando a
ser utilizada como una herramienta útil para la
Ciencia de la Tecnología de los Alimentos,
motivando la cooperación entre laboratorios que ha
permitido el desarrollo de la línea de Biotecnología de
Alimentos, implementando las prácticas moleculares
en productos alimenticios con la finalidad de crear
métodos factibles que puedan ser aplicados en los
ámbitos industrial y gubernamental, que sirvan de

53
instrumentos de apoyo para técnicas de control de la
calidad de los alimentos comercializados en el País.
Estudio microbiológico de cepas de Bifidobacterium
spp. presentes en productos lácteos tipo yogurt
El concepto de alimento funcional es empleado para
describir aquellos alimentos modificados, que poseen
en su composición ingredientes que proporcionan un
efecto positivo de forma dirigida, en la salud de un
individuo, más allá del valor nutricional tradicional
(10). Los probióticos son un ejemplo de ingrediente
funcional, ya que son suplementos alimenticios
conformados por microorganismos vivos capaces de
modular la inmunidad sistémica del intestino (5).
Los cultivos de bacterias probióticas, como
las Bifidobacterias, son cada vez más frecuentes en
productos fermentados, ya que su presencia no solo
favorece el equilibrio de la microflora intestinal, sino
que además están involucradas en la prevención y
tratamiento de trastornos como la intolerancia a la
lactosa, diarreas por rotavirus, la modulación de la
respuesta inmunitaria, la reducción de los niveles de
colesterol y la reducción de ciertos tipos de cáncer
(11). A pesar de todos estos beneficios son pocos los
estudios realizados en Venezuela dirigidos a la
caracterización de estos microorganismos en este tipo
de producto y no existen métodos oficiales para su
estudio en alimentos, por lo cual se propuso
estandarizar las técnicas microbiológicas
convencionales y automatizadas, que permitan
evidenciar la presencia de estas bacterias en dicho
tipo de productos y obtener información de interés
sobre los microorganismos de este género.
En el Laboratorio se realizó el estudio de dos
productos tipo yogurt de la misma casa comercial, y
de los cuales el yogurt I era el único producto
declarado probiótico que se comercializaba en el País
(8,9). Se realizó el aislamiento de 30 colonias de
cada tipo de yogurt analizado para un total de 60
colonias, de las cuales sólo 27 colonias del yogurt I y
11 colonias del yogurt II concuerdan con la
identificación, según las pruebas microbiológicas
aplicadas, y las características del género
Bifidobacterium. Los resultados fueron comparados
con los obtenidos con la galería Rapid ID 32 A para
anaerobios, señalando al género Bifidobacterium spp
como la primera opción de identificación. Estos
resultados fueron obtenidos igualmente para la cepa
pura Bifidobacterium lactis Bb12, utilizada en el
estudio como un control positivo (7).
Se comparó el crecimiento bacteriano de estos
aislados bacterianos en dos medios de cultivo (MRS-
m, RCA), sembrando por profundidad en placas y en
tubos Miller-Pricket, obteniéndose mejores resultados
con el medio MRS-m y las siembras por profundidad
54
en tubos. El medio de cultivo MRS con adición de
HCL-cisteína y una solución de antibióticos,
constituye un medio selectivo apropiado para el
crecimiento de las bifidobacterias proveniente de los
productos lácteos tipo yogurt analizados. Se creó una
atmósfera anaerobia usando una solución de Alka-
seltzer®, que proporcionó buenos resultados para el
desarrollo de las bifidobacterias, comparable al
obtenido con los sobres comerciales, demostrando
que este sistema puede constituir una alternativa
económica y de fácil adquisición.
Los valores de los títulos bacterianos de cada
producto permiten reportar que el yogur I cumple
con los requisitos necesarios de la cantidad de
microorganismos que debe poseer en su composición
para ser considerado un alimento funcional según los
estándares a nivel mundial (7).
Estudio molecular de las cepas de Bifidobacterium
spp presentes en productos lácteos tipo yogurt
Para complementar los estudios microbiológicos, se
implementaron métodos moleculares para la
identificación y la tipificación de las colonias
aisladas. Utilizando el método de lisis alcalina se
realizaron extracciones de ADN de cada una de las
cepas aisladas, cuya calidad fue corroborada
mediante la amplificación del gen rRNA16S.
Comprobada la eficiencia del aislamiento, se realizó
la caracterización e identificación molecular por
ERIC-PCR y REP- PCR de los aislados mediante la
comparación de los patrones obtenidos para los
aislados y para la cepa control B. lactis. Los patrones
obtenidos permitieron determinar que 34 de los 60
aislados poseían una estrecha relación clonal entre si,
que a su vez correspondían con los patrones
generados por la cepa de B. lactis utilizada como
control positivo (7). Estos resultados concuerdan
con los reportados en la bibliografía, demostrando la
correcta identificación de la especie utilizada como
probiótico (12).
Este estudio representa el primer trabajo que
demuestra que las técnicas moleculares basadas en
secuencias repetidas ERIC y REP son una clave para
la detección y caracterización microbiológica de
especies de bifidobacterias de una forma rápida, sin
descartar los métodos tradicionales de identificación,
y que las mismas pueden ser utilizadas por la
industria y los entes encargados del control de la
calidad en este tipo de productos para garantizar la
presencia de este grupo probiótico. Se recomienda
continuar con las investigaciones y el mejoramiento
de las técnicas de identificación de los
microorganismos probióticos, para incrementar su uso
por parte de la industria alimentaria y farmacéutica,
siempre manteniendo los controles para corroborar la
existencia de estos productos probióticos y la calidad
de las cepas utilizadas en Venezuela
Estandarización del método de extracción de ácidos
nucleicos en muestras comerciales enlatadas de atún
(Thunnus spp).
El Atún (Thunnus spp) es una especie de gran valor
para el sector pesquero que puede ser localizado en
aguas templadas, como el atún aleta azul (T. thynnus)
y la albacora o atún blanco (T. alalunga), así como en
aguas cálidas el atún aleta amarilla o rabil (T.
albacares) y el barrilete (K. pelamis).
Tanto el atún como el salmón, son especies de gran
valor comercial cuya composición química lo hace
ideal para ciertos procesos, como el ahumado o
enlatado. Sin embargo, existen al menos 17 tipos de
pescado de menor costo que poseen una carne de
textura, sabor y color similar, por lo que la
adulteración de estas especies en productos enlatados,
puede generar cambios en el producto final, que no
son esperados ni detectados por el consumidor si la
etiqueta no declara lo que en realidad contiene el
producto, pudiéndose establecer así un fraude en la
venta de dicho rubro. Hasta la fecha en nuestro país
no se había realizado ningún estudio basado en la
genética molecular para evitar fraude con los
productos pesqueros.
En Venezuela, se conoce muy poco acerca de las
especies de túnidos que están siendo empleadas en el
proceso de enlatado de este rubro alimenticio, por lo
cual se desarrolló un protocolo que permitiera
distinguir las especies de atún, y diferenciarlas de
otros pescados que puedan ser enmascarados bajo
etiquetados falsos. Uno de los problemas principales
para ejecutar exitosamente estos métodos de
identificación en la industria del atún, es la cantidad y
la calidad del ADN extraído a partir de las muestras
que han sido procesadas para el enlatado, ya que los
ácidos nucleicos pueden sufrir algún proceso de
degradación debido a los tratamientos térmicos a los
que está sometido el músculo durante el proceso de
enlatado (cocción y esterilización), y también puede
influir la composición de los aditivos que se agregan
para la presentación final del producto.
Se inició la estandarización del método de extracción
de ADN, utilizando diferentes técnicas, basadas en el
uso de detergentes iónicos y fenol/cloroformo, a
partir de muestras tanto de atún fresco como
enlatados de distintas presentaciones, tales como atún
al limón, en aceite de oliva, al natural y ahumado,
utilizando como control positivo carne de músculo
provenientes de atún fresco y como control negativo
bagre rayado ((Pseudoplatystoma tigrinum). Las
muestras fueron de lotes diferentes, obtenidos en
supermercados y mercados populares de la ciudad
55
capital (1). Este trabajo permitió estandarizar el
método más adecuado para la purificación del
material genético de muestras de atún, para su
posterior utilización para fines de identificación. El
análisis de los resultados permite proponer que el
método modificado experimentalmente en el
Laboratorio produce resultados satisfactorios para
cualquier material biológico fresco, el cual podrá ser
utilizado en pruebas moleculares posteriores para la
identificación taxonómica del producto. Para los
productos procesados, aun cuando el ADN puede
haber sido alterado por los diversos procesamientos a
los cuales es sometido el producto (calentamiento,
añadido de sustancias, enlatado), es todavía factible
amplificar fragmentos utilizando PCR, los cuales
aportarán la información suficiente para su correcta
identificación.
Evaluación de la técnica de PCR para la
identificación molecular de especies de atún
(Thunnus spp) comercializadas en Venezuela
En el laboratorio se propuso como objetivo evaluar,
mediante técnicas de PCR, la identificación molecular
de algunas muestras de atún, tanto fresco como
enlatado, que son comercializados en Venezuela. Se
realizó la reacción de PCR asociada a Polimorfismo
de la Longitud de Fragmentos de Restricción (PCR-
RFLP), utilizando dos juegos de cebadores, para
amplificar un fragmento del gen mitocondrial que
codifica para el citocromo b y diferentes enzimas de
restricción, empleando una modificación del método
descrito por Pardo y Pérez-Villareal (6). La técnica
de PCR-RFLP empleada fue lo suficientemente
específica como para identificar molecularmente las
especies de túnidos, utilizando el material genético
obtenido de muestras de atún fresco y enlatado. Este
trabajo representa uno de los primeros estudios de
trazabilidad molecular en Venezuela, como método
para la autentificación de especies como forma de
inspección de la calidad de los alimentos. Se
identificó que una de las especies empleadas para el
proceso de enlatado es el atún blanco o T. alalunga
(2)
El ADN purificado a partir de muestras tomadas en
cualquier punto a lo largo de la cadena de producción
puede ser confrontado con la historia del organismo,
estableciendo, de este modo, las bases para un sistema
individualizado de control. Así, el trazado mediante el
análisis del ADN puede ligar el producto final (atún
enlatado, fileteado, ahumado, entre otros) hasta su
origen, a través de todos los pasos del proceso. Este
trabajo representa un avance científico importante
para Venezuela, ya que métodos como estos no han
sido aplicados con el fin de la autentificación como
forma de inspección de la calidad de los alimentos.
 Consideraciones Finales
Las técnicas moleculares ofrecen en esta nueva era
biotecnológica un desarrollo acelerado e innovador de
gran utilidad para la producción y control de diversos
productos alimenticios que se comercializan en el
País, en comparación a otras técnicas convencionales
que si bien son útiles deben ser complementadas. La
autenticidad del alimento es un término que se refiere
simplemente a si el alimento adquirido por el
consumidor corresponde con su descripción. Las
metodologías implementadas en el laboratorio
proporcionan las herramientas para comprobar la
autenticidad de estos productos. Este conocimiento
puede ser transferido tanto a las empresas como a los
organismos encargados de monitorear el control de
calidad de la industria de alimentos en el País.
Agradecimientos
Estos trabajos fueron financiados por el Consejo de
Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) a GA
(PG-03-7327-2008), y MB (PG 03.6506.2006/2) y
por el proyecto del Fondo Nacional de Ciencia,
Tecnología e Innovación (FONACIT) MT (G-
200001538)
Referencias
1. Aguilar, A., Alonso, G. y Barrero, M. (2011).
Estandarización del método de extracción de
ácidos nucleicos en muestras comerciales
enlatadas de atún (Thunnus sp.). Rev. Venez.
Cienc. Tecnol. Aliment. 2(1): 061-072.
2. Aguilar, A., Alonso, G. y Barrero, M. (2012).
Identificación de especies de atún (Thunnus spp)
en Venezuela utilizando la técnica de PCR. En
revisión, Rev. Científ. FCV-LUZ.
3. López. M., Mallorquín. P. y Vega M. (2003).
Tecnologías Moleculares de Trazabilidad
Alimentaria. Informe de Vigilancia Tecnológica.
Genoma España. Sector Agroalimentario.
GEN-ES03001: 07-34.
4. Mitsuoka, T. y Kaneuchi, CH. (1977). Ecology
of the Bifidobacteria. Am. J. Clin. Nutr. 30:
1799-1810.
56
View publication stats
5. Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación. (2001)
Probióticos en los alimentos. Propiedades
saludables y nutricionales. [Online]:
http://whqlibdoc.who.int/publications/2006/9253
055138_spa.pdf (Consulta Febrero 2007).
6. Pardo, M. y Pérez-Villareal, B. (2004).
Identification of Commercial canned tuna species
by restriction site analysis of mitochondrial DNA
products obtained by nested primer PCR. Food
Chem. 86: 143-150.
7. Pérez, I. del C., Falco, A., Tapia, M.S., y
Alonso, G. (2012). Estudio de cepas de
Bifidobacterium spp. presentes en productos
lácteos tipo yogur. En Prensa, Rev. Soc. Ven.
Microbiol. 32(1).
8. Pérez, I. del C., Tapia, M. y Alonso, G. (2010).
Importancia del estudio de las bifidobacterias
presentes en alimentos probióticos tipo yogurt.
Jornadas de Investigación y Extensión de la
Facultad de Ciencias UCV.
9. Pérez, I. del C., Peñuela, A., Rodríguez, C.,
Tapia, M.S., Chalbaud, A. y Alonso G. (2008).
Estudio Microbiológico de cepas de
Bifidobacterias aisladas de productos lácteos tipo
yogurt. XIX Congreso Latino Americano y VI
Ecuatoriano de Microbiología.
10. Roberfroid, M.B. (2000). Concepts and strategy
of functional foods science: the European
perspective. Am. J. Clin. Nutr. 71(Suppl 6):
S1660-1664.
11. Russell, D., Ross, R., Fitzgerald, G. y Stanton,
C. (2011). Metabolic activities and probiotic
potential of Bifidobacteria. Int. J. Food
Microbiol. 149(1): 88-105.
12. Ventura, M., Meylan, V. y Zink, R. (2003).
Identification and tracing of Bifidobacterium
species by use of Enterobacterial Repetitive
Consensus Sequences. Appl. Environ.
Microbiol. 69(7): 4296-4301.
13. Vilchez, G. y Alonso, G. (2009). Alcances y
limitaciones de los métodos de epidemiología
molecular basados en el análisis de ácidos
nucleicos. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 29: 6-12.