NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 5224

2003-11-26

ACEITES Y GRASAS VEGETALES Y ANIMALES

COMESTIBLES.
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE
TRIGLICÉRIDOS POLIMERIZADOS POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE EXCLUSIÓN DE
ALTO RENDIMIENTO

E: ANIMAL AND VEGETABLE FATS AND OILS.

DETERMINATION OF POLYMERIZED TRIGLYCERIDES
CONTENT BY HIGH PERFORMANCE SIZE – EXCLUSION
CHROMATOGRAPHY (HPSEC)

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción idéntica

(IDT) por traducción de la ISO
16931:2001

DESCRIPTORES: determinación de triglicéridos;

cromatografía; grasa; alimentación;
grasa vegetal; grasa animal; aceite
vegetal; aceite animal; grasas y
aceites.

I.C.S.: 67.200.10

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Editada 2003-12-11

 PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 5224 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2003-11-26.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 49 Aceites y Grasas Vegetales y Animales
comestibles.

ACEGRASAS S.A. FÁBRICA DE GRASAS Y PRODUCTOS

CARULLA VIVERO S.A. QUÍMICOS S.A. -GRASCO-
COMERCIALIZADORA INTERNACIONAL FEDEPALMA
SANTANDEREANA DE ACEITES S.A. INDEPENDIENTE - NATALIA GARNICA
C.I.S. ACEITES S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
COMESTIBLES RICOS

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:

ASINAL LTDA. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS NOEL -

ASOCIACIÓN NACIONAL DE ZENU S.A.
INDUSTRIALES INDUSTRIAS DEL MAÍZ S.A.
COLOMBINA S.A. INVIMA
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
S.A. LLOREDA S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE LEVADURAS LUCTA GRANCOLOMBIANA LTDA.
CORP PRODUCTS INTERNATIONAL MANUELITA S.A. DIVISIÓN ACEITES Y
DISA S.A. GRASAS
FABRICA DE ACEITES Y MARGARINAS MAURICIO OTÁLORA INDEPENDIENTE
DEL MAGDALENA MERCADEO DE ALIMENTOS DE
FEDEPALMA (CENIPALMA) COLOMBIA S.A.
FEDERACIÓN NACIONAL DE MINISTERIO DE AGRICULTURA
CULTIVADORES DE PALMA DE ACEITE
FIRMENICH S.A.
MINISTERIO DE COMERCIO INDUSTRIA SOCIEDAD INDUSTRIAL DE GRASAS Y
Y TURISMO (MINISTERIO DE VEGETALES
DESARROLLO) SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y
MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL COMERCIO
(MINISTERIO DE SALUD) UNILEVER ANDINA COLOMBIA S.A. -
NESTLE DE COLOMBIA S.A. UNILEVER BESTFOODS
NULAB LTDA. UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
PRODUCTOS RAMO UNIVERSIDAD DEL VALLE
RENTAFRIO S.A. UNIVERSIDAD INCA
SACEITES S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
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ACEITES Y GRASAS VEGETALES Y ANIMALES COMESTIBLES.

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE TRIGLICÉRIDOS POLIMERIZADOS
POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE EXCLUSIÓN DE ALTO RENDIMIENTO

1. OBJETO

La presente norma especifica un método que usa HPSEC para determinar el contenido de
triglicéridos polimerizados en aceites y grasas que contienen al menos 3 % (del área total de
los picos ) de estos polímeros.

Este método es aplicable a grasas para freír, y a grasas y aceites que han sido tratados
térmicamente. También se puede aplicar a la determinación de polímeros en grasas para
alimentos para animales.

NOTA 1 Los triglicéridos polimerizados (estrictamente hablando, triglicéridos diméricos y oligoméricos) se forman
durante el calentamiento de grasas y aceites, y así el método sirve para evaluar el deterioro térmico de las grasas
para freír, con el uso.

NOTA 2 En el caso de análisis de grasas de alimentos para animales, el método de extracción usado puede influir
en el resultado (véase la norma ISO 6492).

NOTA 3 Los niveles de del contenido de triglicéridos polimerizados, dependen de las condiciones de uso
(temperatura del aceite y naturaleza del producto a freír).

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

El siguiente documento normativo contiene disposiciones que, mediante referencia en este

documento normativo a este texto, constituye disposiciones de la misma. En el momento de su
publicación era vigente la edición indicada. Todas las normas están sujetas a revisión, por lo
tanto, se invita a las partes que realicen acuerdos con base en esta norma, a investigar la
posibilidad de aplicar las ediciones más recientes del siguiente documento. Los miembros de
IEC e ISO llevan registros actualizados de las normas internacionales.

NTC 5033:2002, Grasas y aceites animales y vegetales. Preparación de la muestra para

ensayo. (ISO 661:1989).

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3. TÉRMINOS Y DEFINICIÓNES

Para los propósitos de esta norma, se aplica el siguiente término y definición:

3.1
triglicéridos polimerizados
componentes de grasas y aceites sometidos a calentamiento que se determinan por HPSEC
bajo las condiciones especificadas en esta norma.

NOTA El contenido se expresa como un porcentaje de todos los picos de acilglicéridos eluídos (TAG, PTAG, DAG
y MAG).

4. PRINCIPIO

Se disuelve la muestra en tetrahidrofurano, luego los triglicéridos polimerizados se separan por

cromatografía por permeación en gel, de acuerdo con su tamaño molecular. La detección de
los componentes se lleva a cabo por medio de un detector de índice de refracción.

5. REACTIVOS

Se usan sólo reactivos de grado analítico reconocido.

5.1 Tetrahidrofurano, posiblemente estabilizado con BHT (0,1 %), desgasificado.

Es importante que el tetrahidrofurano usado para disolver la muestra tenga el mismo contenido
de agua que el eluente, de lo contrario puede aparecer un pico negativo.

5.2 Tolueno

5.3 Sulfato de sodio anhidro

6. EQUIPO

El equipo de laboratorio usual, y en particular, el siguiente:

6.1 Depósito para el solvente, con capacidad aproximada de 250 ml, con un filtro en línea
de fase móvil (tamaño de poro 1 µm).

6.2 Bomba para HPLC, con una tasa de flujo volumétrico mínima de 0,5 ml/min.

6.3 Válvula de inyección con un bucle (loop) de 10 µl y una jeringa adecuada con un
volumen de 50 µl a 100 µl o un automuestreador con un loop de 10 µl.

6.4 Columna de acero inoxidable de 300 mm de longitud, y 7,5 mm a 7,8 mm de diámetro

interno, empaquetada con una gel esférica de alto rendimiento, hecha de copolímero de
estireno-divinilbenceno; diámetro de partículas: 5 µm; tamaño de poro 10 nm o su equivalente
en términos de potencia de exclusión y resolución (véase el numeral 10.1).

Se recomienda un dispositivo de control de temperatura, para mantener la temperatura de la

columna entre 30 °C y 35 °C.

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Si es necesario, la columna se debería almacenar en tolueno (véase el numeral 5.2).

6.5 Detector de índice de refracción a temperatura controlada, con una sensibilidad a escala
total, de al menos 1 x 10-4 del índice de refracción.

La temperatura ideal del detector debe ser estable y estar entre 5 °C y 10 °C por encima de la
temperatura ambiente.

6.6 Registrador y/o integrador, o sistema de datos de cromatografía computarizados (CDS),

para permitir la visualización y cuantificación exacta de las áreas de pico.

7. MUESTREO

El muestreo no es parte del método especificado en esta norma. En la norma ISO 5555
(NTC 217) se presenta un método de muestreo recomendado.

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sufrido daño o cambios durante su transporte o almacenamiento.

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con la norma ISO 661 (NTC 5033).

9. PROCEDIMIENTO

NOTA Si se requiere verificar si se cumple el límite de repetibilidad (véase el numeral 11.2), se llevan a cabo dos
determinaciones sencillas, de acuerdo con los numerales 9.1 y 9.2.

9.1 ACONDICIONAMIENTO DEL EQUIPO DE HPLC

Se recomienda seguir cuidadosamente las recomendaciones del fabricante. Encienda el

sistema y bombee tetrahidrofurano a una tasa de flujo de volumen entre 0,5 ml/min y 1 ml/min,
para purgar el sistema completo hasta la válvula de inyección. Conecte la columna a la válvula
de inyección y lave con 30 ml de tetrahidrofurano aproximadamente. Conecte la columna a la
celda de muestra del detector, y llene la celda de referencia con tetrahidrofurano. Ajuste el flujo
de fase móvil entre 0,5 ml/min y 1,0 ml/min. Espere hasta que se obtenga la adecuada
estabilización del sistema (no hay una desviación apreciable de la línea de referencia).

Si la composición de la columna es como se indica, se debería obtener un sistema de

estabilización aceptable en aproximadamente 15 min. Con otras columnas empaquetadas, la
estabilización del sistema puede ser más difícil. Por ejemplo, el cambio de la fase móvil debería
hacerse progresivamente del tolueno al tetrahidrofurano, con mezclas diferentes, cada una con
25 % más de tetrahidrofurano. Normalmente se obtiene una estabilización aceptable en 12 h
aproximadamente.

9.2 PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Pese aproximadamente 50 mg de grasa o aceite y adicione de 1 ml a 3 ml de tetrahidrofurano y

homogenizar. Agregue 50 mg de sulfato de sodio anhidro y deje reposar de 2 min a 5 min, y
pase esto por un filtro de 1 µm. Usando la jeringa, tome de 50 µl a 100 µl de esta solución.
Llene el bucle (loop) de inyección, inyecte y encienda el integrador.

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Si se usa un automuestreador, llene los tubos de muestra, accione el automuestreador y

encienda el integrador o sistema de tratamiento de datos .

Con una tasa de flujo de fase móvil de 1 ml/min, el tiempo de análisis es de 10 min
aproximadamente.

La eficiencia de la columna, determinada como el número de platos teóricos (N) para los
triglicéridos monoméricos, debería ser al menos 6 000.

10. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

10.1 ANÁLISIS CUANTITATIVO

El patrón cromatográfico de la determinación muestra un pico principal representativo de los

triglicéridos monoméricos (masa molecular aproximada 900) y uno o varios picos con tiempos
de retención más cortos representativos de triglicéridos polimerizados (dímeros y oligómeros
superiores).

En condiciones adecuadas, los triglicéridos (TAG) y triglicéridos polimerizados (PTAG) se

pueden separar con una buena resolución [véase la Figura 1a) y b)] incluso a niveles bajos de
triglicéridos polimerizados.

Sin embargo, en algunos casos (que parecen estar relacionados con fenómenos de
degradación complejos), el patrón pico que antecede los picos de triglicéridos puede ser menos
claro, con las consiguientes dificultades para los cálculos [Figura 1 c)].

TAG
TAG
TAG

PTAG
PTAG

D
W PTAG
d

a) Contenido de PTAG 1 % b) Contenido de PTAG 10 % c) Contenido de PTAG 10 %

Figura 1. HPSEC de triglicéridos (TAG) y triglicéridos polimerizados (PTAG)

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10.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO

Los cálculos se realizan utilizando el método de estándar interno, suponiendo que todos los
componentes de la muestra que han eluido tienen el mismo coeficiente de respuesta.

El contenido de triglicéridos polimerizados se calcula de la fórmula:

PPTAG =
∑A PTAG

∑A
x 100 %
tot

en donde

PPTAG = es el porcentaje de triglicéridos polimerizados, con base en las áreas pico.

APTAG = es la suma de áreas de los picos de triglicéridos polimerizados.

Atot = es la suma de las áreas de todos los picos representativos de acilglicéridos (TAG, PTAG,
DAG y MAG).

Para calcular APTAG son posibles los dos casos siguientes:

a) Una buena resolución entre picos (R ≥ 1)

Los métodos generales de integración (manual y electrónica) se pueden usar para

calcular áreas individuales y totales.

b) Una deficiente resolución entre picos (R < 1)

Se supone que todos los componentes eluídos antes (dr – 0,5 w) (véase más
adelante) son triglicéridos polimerizados.

La resolución se calcula de:

D
R =
W

en donde:

D = distancia, en milímetros, entre los picos máximos de los triglicéridos no

polimerizados (TAG) y los triglicéridos polimerizados adyacentes (PTAG).

w = ancho, en milímetros, del pico de los triglicéridos en la línea base, medido entre los
puntos de intersección entre las tangentes y la línea base .

dr = es la distancia de retención, en milímetros, desde el comienzo del cromatograma al

pico máximo para los triglicéridos.

El integrador de datos se debe ajustar cuidadosamente usando integración electrónica

(integración horizontal inversa), para integrar todas las superficies entre la curva y la línea de
referencia. Si se usa una técnica manual, es necesario determinar el área pico de los glicéridos
mediante triangulación.

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Los resultados se expresan con un lugar decimal.

11. PRECISIÓN

11.1 ENSAYOS INTERLABORATORIO

En el Anexo A se resumen los detalles de los ensayos interlaboratorio acerca de la precisión

del método. Es posible que los valores obtenidos de estos ensayos interlaboratorio no sean
aplicables a rangos de concentración y matrices diferentes de los dados.

11.2 REPETIBILIDAD

Cuando los valores de dos resultados de ensayos sencillos e independientes, obtenidos

usando el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio, por el
mismo operador, usando el mismo equipo, en un intervalo de tiempo corto, están dentro del
mismo rango de los valores medios de la Tabla A.1, la diferencia absoluta entre los dos
resultados de ensayo obtenidos será, en máximo el 5 % de los casos, mayor que el límite de
repetibilidad (r), que generalmente se puede obtener mediante interpolación lineal de los
valores de la Tabla A.1.

11.3 REPRODUCIBILIDAD

Cuando los valores de dos resultados de ensayos sencillos obtenidos usando el mismo método
sobre material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios, con diferentes operadores y
diferentes equipos, están dentro del rango de los valores dados en la Tabla A.1, la diferencia
absoluta entre los dos resultados de ensayo obtenidos será, en máximo el 5 % de los casos,
mayor que el límite de reproducibilidad (R), que generalmente se puede obtener mediante
interpolación lineal de los valores de la Tabla A.1.

12. REPORTE DE ENSAYO

El reporte de ensayo debe especificar:

- Toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.

- El método de muestreo usado, si se conoce.

- El método de ensayo usado, con referencia a esta norma.

- Todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados

como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber
influenciado los resultados de los ensayos.

- Los resultados de ensayo obtenidos, o si la repetibilidad se ha verificado, el

resultado final obtenido.

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ANEXO A
(Informativo)

RESULTADOS DE ENSAYOS INTERLABORATORIO

Dos ensayos interlaboratorio realizados a nivel internacional en 1986 y 1987 por la Comisión
IUPAC sobre aceites, Grasas y Derivados, en el cual participaron 10 y 17 laboratorios
respectivamente, con dos resultados de ensayo para cada muestra, dieron los resultados
estadísticos (evaluados de acuerdo con la ISO 57251) resumidos en la Tabla A.1.

Tabla A.1

Muestra
A B C D F G H
Número de laboratorios 17 10 10 17 16 16 10
Número de laboratorios conservados después
15 9 10 16 16 15 10
de eliminar los atípicos
Número de resultados aceptados 30 18 20 32 32 30 20
Contenido medio de triglicéridos
polimerizados (porcentaje de triglicéridos 1,8 2,4 3,6 5,2 9,7 10,0 22,0
totales), %
a
Desviación estándar de repetibilidad, sr 0,1 0,07 0,12 0,1 0,3 0,2 0,18
Coeficiente de variación de la repetibilidad 5,5 2,8 3,3 2,9 3,2 2,2 0,8
a
Límite de repetibilidad, r (2,8 sr) 0,3 0,19 0,34 0,3 0,9 0,6 0,51
a
Desviación estándar de reproducibilidad, sR 0,4 0,61 0,45 0,3 0,4 1,2 1,48
Coeficiente de variación de reproducibilidad 23,7 25,9 12,5 6,7 4,6 12,2 6,8
a
Límite de reproducibilidad, R (2,8 sR) 1,2 1,7 1,25 1,0 1,3 3,5 4,2
a
Expresado como porcentaje de glicéridos totales

1
La ISO 5725:1986 (ahora anulada) se usó para obtener datos de precisión.
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BIBLIOGRAFÍA

[1] ISO 5555:1991, Animal and Vegetable Fats and Oils.

[2] ISO 5725:1986, Precision of Test Methods – Determination of Repeatability and

Reproducibility for a Standard Method by Inter-Laboratory Tests.

[3] ISO 5725-1:1994, Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and
Results – Part 1: General Principles and Definitions.

[4] ISO 5725-2: 1994, Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and
Results – Part 2: Basic Method for the Determination of Repeatability and Reproducibility
of a Standard Measurement Method.

[5] ISO 6492:1999, Animal Feeding Stuffs – Determination of Fat Content.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5224

DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Animal and Vegetable Fats and

Oils – Determination of Polymerized Triglycerides Content by High-Performance Size-Exclusion
Chromatography (HPSEC). ISO, 2001, 8 p. (ISO 16931).