Catálisis molecular 486 (2020) 110871

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Catálisis molecular

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Portadores de microesferas porosas poco profundas con estructura núcleo-capa a base de perlas de vidrio que
reticulan el quitosano para inmovilizar la inulinasa

Yang Yang un , Hongmei Yu un , Xiaohua Zhou un , Zhen Zhou segundo , *

un Escuela de Química e Ingeniería Química, Universidad de Chongqing, Chongqing, 401331, China
segundo Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Chongqing, Chongqing, 401331, China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Desarrollamos un nuevo tipo de portadores de microesferas porosas poco profundas con estructura núcleo-capa utilizando perlas de vidrio como núcleos,
Portadores de microesferas porosas poco profundas Perlas de quitosano como capa de recubrimiento, glutaraldehído como agente reticulante y ácido esteárico en polvo como porógeno. La caracterización de FT-IR, SEM,
vidrio
XRD, TGA-DSC y XPS demuestra que el modi fi El catión en cada paso es factible y el quitosano forma una capa de injerto recubierta uniformemente en la
Quitosano
superficie, que representa el 40% del peso total. Luego, este estudio se centra en la inmovilización de inulinasa en los portadores de microesferas porosas poco
Inulinasa
profundas. Las condiciones óptimas para la inmovilización son: el valor de pH es 5,0; el tiempo de reticulación es de 2,5 h; la relación molar de enzima libre,
Inmovilización
glutaraldehído y grupo amino portador es 5.0 × 10 - 3: 0,3: 1. Entre ellos, el valor de pH tiene el más signi fi no puedo en fl influencia sobre el proceso de reacción. La
inulinasa inmovilizada preparada conserva el 73% de la actividad de la inulinasa libre y se amplían los intervalos adecuados de pH y temperatura. Los
experimentos de estabilidad térmica se operan a 70 ° C durante 3 h, cuando la inulinasa inmovilizada aún mantiene el 69,20% de las actividades iniciales
mientras que la inulinasa libre solo mantiene el 33,79%. La inulinasa inmovilizada aún mantiene el 77,93% de las actividades iniciales después de 10
reutilizaciones, y su vida media calculada es 22 veces, lo que demuestra el potencial de desarrollo en aplicaciones industriales.

1. Introducción
La tecnología de enzimas inmovilizadas tiene como objetivo romper algunos cuellos de botella
causados por la separación di ffi cultivo, metaestabilidad de almacenamiento, sensibilidad condicional
e intermittencia operativa de enzimas libres. En el proceso, la selección de portadores de enzimas
inmovilizados es un paso crucial porque se benefician portadores excelentes y adecuados. fi cial para
estabilizar la conformación de enzimas e incluso acelerar la reacción biocatalítica. Desde JM Nelson
y EG Gri ffi n [ 1 ] fi En 1916, cuando se preparó con éxito la invertasa de levadura inmovilizada sobre
carbón activado, se han puesto de moda los portadores de enzimas inmovilizadas naturales. Los
portadores naturales populares se componían de dos tipos: sustancias inorgánicas, como arena [ 2 ],
alúmina [ 3 ] e hidroxiapatita [ 4 ]; macromoléculas biológicas, como el quitosano [ 5 ], celulosa [ 6 ] y
colágeno [ 7 ]. Sin embargo, las sustancias inorgánicas a menudo carecen de sitios inmovilizados, y
las enzimas inmovilizadas en sus superficies con frecuencia caen o ff debido a fricción o agitación; las
macromoléculas biológicas son di ffi culto para satisfacer la demanda del mercado en términos de
temperatura, pH y resistencia microbiana y resistencia mecánica. Así, en la década de 1960,
BECKMAN INSTRUMENTS INC. fi informó por primera vez de un método para inmovilizar enzimas en
una patente británica [ 8 ], en el que el portador estaba acoplado por proteína y poliuretano con una
especie de compuestos diazo, lo que representa el surgimiento del polímero sintético.
portadores. Desde entonces, han aparecido sucesivamente transportadores sintéticos de enzimas
inmovilizados con diversas morfologías y propiedades, incluidas las resinas de intercambio iónico [ 9 ],
geles poliméricos [ 10 ] y polímero fi lms [ 11 ]. Qué ' s más innovadores, los investigadores comenzaron a
fabricar intencionalmente portadores de microesferas porosas con alta especificación fi c área de
superficie y carga de enzimas [ 12 - 14 ]. Sin embargo, todavía existen dos defectos clave en los
portadores de polímeros sintéticos: fuerte hidrofobicidad de la superficie y pobre
fl obilidad de los microporos internos. El primero perturbará la conformación de los residuos de
aminoácidos hidrófilos en la superficie adyacente, mientras que el segundo se refiere a una pequeña
apertura y múltiples particiones que impiden la entrada de la proteína enzimática. Incluso si la enzima
estuviera inmovilizada en los microporos internos, la reacción catalítica sería ineficaz. ffi cient debido
al fuerte aumento de di ff resistencia al uso.
Según la descripción anterior, aunque los portadores de microesferas porosas pueden ocultar
proteínas enzimáticas para resolver los problemas de fácil exfoliación en la superficie, también aporta
capas de resistencia a la transferencia y reduce la e catalítica. ffi eficiencia [ 15 ]. Dado que la baja
resistencia a la transferencia es solo la ventaja de los portadores no porosos, es necesario combinar
las superioridades de los portadores porosos y no porosos. Suponiendo que speci parcial fi c se
intercambió el área de superficie, solo se harían poros poco profundos con un diámetro adecuado en la
superficie de los portadores, que no solo pueden ocultar las proteínas enzimáticas e ff ectivamente, pero
también signi fi disminuir suavemente el

• Autor para correspondencia en: Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Chongqing, No. 55 Daxuecheng South Rd., 401331, Chongqing, China.

Dirección de correo electrónico: dominizhou@126.com (Z. Zhou).

https://doi.org/10.1016/j.mcat.2020.110871
Recibido el 29 de octubre de 2019; Recibido en forma revisada el 15 de febrero de 2020; Aceptado el 27 de febrero de 2020

Disponible online el 05 de marzo de 2020

2468-8231 / © 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

Y. Yang y col.
Resistencia de las enzimas para catalizar la reacción. Más especi fi Básicamente, el procedimiento
para preparar portadores de microesferas porosas poco profundas es reticular el polímero funcional
de capa fina sobre la superficie de las microesferas inertes y luego hacer poros con el fin de
inmovilizar enzimas. En general, a pesar de las innumerables contribuciones de la investigación con
respecto a los portadores de enzimas inmovilizados, no ha habido informes relevantes sobre los
poros poco profundos.
La perla de vidrio es un tipo de material funcional que consta de dióxido de silicio, con grandes
especi fi c gravedad, excelente estabilidad química y resistencia mecánica adecuada, principalmente
utilizado en el fi campos de fabricación y procesamiento de equipos. Particularmente, la superficie de
las perlas de vidrio se puede modificar fi ed por agente de acoplamiento de silano para poseer grupos
reactivos [ dieciséis ], seguido de polímero de capa fina de reticulación, constructivo para preparar
portadores de microesferas porosas poco profundas. El quitosano, el único polisacárido alcalino
natural, está cargado con grandes cantidades de grupos amino y posee una biocompatibilidad,
propiedades antimicrobianas y fi formación de película, que se vuelve ventajosa en el fi campos de la
ingeniería bioquímica y biomédica [ 17 ]. El objetivo de este estudio es desarrollar portadores de
microesferas porosas poco profundas con estructura núcleo-capa a base de perlas de vidrio que
reticulan el quitosano. Se pueden descubrir varias ventajas de los portadores a continuación. En
primer lugar, los portadores son fáciles de separar del sistema de reacción y tienen la resistencia
mecánica adecuada. Además, se introducen numerosos sitios activos utilizados para inmovilizar
debido al recubrimiento de quitosano en capa fina. Más signi fi En consecuencia, debido a la
protección de los poros poco profundos, las proteínas enzimáticas inmovilizadas en ellos pueden
evitar la pérdida por fricción, reduciendo en consecuencia la resistencia a la transferencia y
mejorando la estabilidad y la vida útil.
Finalmente, planeamos utilizar los portadores de microesferas porosas poco profundas para la
inmovilización de inulinasa (EC 3.2.1.7). Hay dos estrategias principales para inmovilizar enzimas en
vehículos porosos: adsorción y unión covalente. La adsorción se logra poniendo en contacto enzimas
con vehículos durante un período de tiempo para formar una interacción relativamente débil,
mostrando las ventajas de reversibilidad, simplicidad y posible alta retención de actividad [ 18 ]. Sin
embargo, la estrategia de adsorción puede no preparar un biocatalizador estabilizado debido al
riesgo de disociación en el entorno de aplicación [ 19 ]. Enlace covalente, como el más popular ye ff enfoquetransformada de Fourier (FT-IR; TENSOR 27, Bruker, Alemania). La morfología de la superficie de
efectivo, permite que las enzimas creen unión covalente multipunto en los grupos funcionales de los
portadores, logrando así la importante estabilidad de las enzimas inmovilizadas y volviéndose aptas
para la implementación industrial [ 20 ]. En la estrategia de unión covalente, el glutaraldehído se usa
ampliamente como reticulante, que puede formar brazos espaciadores cortos, activar los portadores
y proporcionar una buena reactividad [ 21 - 23 ]. Por lo tanto, este estudio está diseñado para preparar
inulinasa inmovilizada por glutaraldehído y analizar las propiedades enzimáticas de la enzima
inmovilizada para verificar la e ff efectividad de los portadores de microesferas porosas poco
profundas.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
Las perlas de vidrio se adquirieron en Zibo Keemo Industry Co., Ltd (Zibo, Shandong, China). El
agente de acoplamiento de 3-aminopropil-trietoxisilano silano (KH550) se obtuvo de Nanjing
Xuanhao Material Co., Ltd (Nanjing, Jiangsu, China). Endoinulinasa (EC 3.2.1.7, especi fi c actividad
de aproximadamente 40 U / mg) de Aspergillus niger se obtuvo de Hunan Shitian Biotechnology Co.,
Ltd (Changsha, Hunan, China). El ácido clorhídrico (HCl), el hidróxido de sodio (NaOH), el ácido 3,
5-dinitrosalicílico (DNS), el quitosano (CS), el glutaraldehído, el polvo de ácido esteárico y todos los
demás productos químicos se adquirieron en ChengDu Chron Chemicals Co,. Sichuan, China).
2.2. Hidroxilación superficial de perlas de vidrio
Se prepararon 300 ml de NaOH (40%) y se transfirieron a un molino de perlas.
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homogeneizador, y luego se añadieron 15 g de perlas de vidrio con agitación. Después de que la
reacción duró a 80 ° C durante 8 h, la mezcla se fi Se filtró con un embudo Brinell y el residuo se lavó
a neutro con ácido acético (0,1%) y agua ultrapura sucesivamente. El residuo se secó a 60ºC durante
2 h para obtener perlas de vidrio hidroxiladas en la superficie.
2.3. Aminación superficial de perlas de vidrio
Se añadieron 0,2 g de KH550 a 50 ml de etanol (90%) en un tubo de tres bocas.
fl pida ser hidrolizado. El sistema de reacción, conectado a un re fl ux instalación, se agitó a 100 ° C
durante 20 min, con el pH ajustado a 2,0. Posteriormente, se agregaron 1.2 g de perlas de vidrio
hidroxiladas para reaccionar más durante 8 h y luego fi filtrado con embudo Brinell. El residuo se lavó
y se secó a 60ºC durante 2 h para obtener perlas de vidrio aminado en la superficie.
2.4. Preparación de portadores de microesferas porosas poco profundas
Se disolvió quitosano en HCl (0,5%) mediante ayuda ultrasónica para preparar una solución de
quitosano (1%), 20 ml de la cual se transfirieron a un homogeneizador de molino de bolas, luego se
añadieron 60 ml de aceite de ensalada y 2 gotas de Tween 80. Se introdujeron 0,6 g de perlas de
vidrio aminado y 0,12 g de ácido esteárico en polvo con agitación a alta velocidad. Después de una
dispersión uniforme, el pH se ajustó a 9,5. - 10,5 para añadir 1,8 g de glutaraldehído. El sistema de
reacción se centrifugó, se lavó y se recogió después de 2 h de reacción isotérmica a 40 ° C, con el
objetivo de derivar un precipitado. los
fi El precipitado final se colocó en el embudo Brinell, se lavó con etanol tibio a 55ºC. - 60 ° C tres
veces, y luego se lava con agua destilada hasta que fi El filtrado era neutro, con el objetivo de derivar
portadores de microesferas porosas poco profundas.
2.5. Mediciones
Las estructuras de grupo de perlas de vidrio hidroxilado, perlas de vidrio aminado y portadores
de microesferas porosas poco profundas se caracterizaron mediante espectroscopía infrarroja por
portadores de microesferas porosas poco profundas se observó mediante microscopio electrónico de
barrido (SEM; JSM7800 F, JEOL, Japón). Analizador termogravimétrico y Di ff calorimetría de barrido
diferencial (TGA-DSC; TGA / DSC1 / 1600 LF, METTLER TOLEDO, Suiza) se utilizaron para fl Efectuar
las propiedades termodinámicas de perlas de vidrio hidroxilado, perlas de vidrio aminado y
portadores de microesferas porosas poco profundas, bajo una velocidad de calentamiento de 10 ° C /
min en una atmósfera de aire de 25 ° C a 800 ° C. Radiografía di ff racción (XRD; PANalytical X '
Pert Powder, Spectris, Países Bajos) y espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS;
ESCALAB250Xi, Thermo Fisher, EE. UU.) Se aplicaron respectivamente para analizar las
propiedades de cristalización y la composición elemental de perlas de vidrio hidroxilado, perlas de
vidrio aminado y portadores de microesferas porosas poco profundas.
2.6. Inmovilización de inulinasa
La solución de inulinasa se obtuvo disolviendo inulinasa en hidrogenofosfato de sodio / ácido
cítrico bu ff er (0,2 mol / L, pH 2,2 - 8.0), luego
Se suspendieron 0,2 g de portadores de microesferas porosas poco profundas en 7 ml de solución
de inulinasa. Después de 0,5 h de adsorción dinámica, se añadió glutaraldehído y se llevó a cabo la
reacción de reticulación con agitación. Finalmente se preparó inulinasa inmovilizada por fi filtrado,
lavado y recogida fi ltro de residuos. Las condiciones óptimas para la inmovilización se discutieron
ajustando el valor de pH, el tiempo de reticulación, la dosis de enzima y la dosis de glutaraldehído en
el proceso de reacción.
2.7. Ensayo de actividad enzimática
El método DNS utilizado para determinar la actividad de la inulinasa se remitió a la literatura
publicada por GL Miller [ 24 ]. La cantidad de enzima utilizada para catalizar la inulina para producir 1 μ mol
de azúcar reductor por minuto en
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un bu ff er (pH 5,0) a 55 ° C es de fi ned una unidad de actividad enzimática (U). La solución de inulina
(2%) se precalentó en baño de agua a 55 ° C, y luego se agregaron las muestras de los grupos
experimentales (inulinasa libre o inmovilizada) y de los grupos control (nada o portadores sin
inulinasa, correspondientes a inulinasa libre o inmovilizada respectivamente). conservar el calor
durante 10min. El producto se analizó mediante espectrofotómetro UV (Agilent Cary60, Agilent, EE.
UU.) Para determinar la producción de azúcar reductor. Con glucosa como reactivo estándar, la
curva estándar también se obtuvo por el método DNS y la ecuación de regresión lineal fue fi calculado
como y = 1.8804x-0.0431 (R 2 = 0,9990) estableciendo la concentración de glucosa como abscisas y la
absorbancia como ordenadas. La absorbancia de todas las muestras en los grupos experimentales
debe restar la de los grupos de control correspondientes, y luego se calcularon las actividades
enzimáticas mediante la curva estándar anterior.
2.8. Análisis de propiedades enzimáticas
Se evaluaron las propiedades enzimáticas de la inulinasa inmovilizada preparada en
condiciones optimizadas, incluyendo seis puntos:
(1) La adaptación del pH de la inulinasa libre e inmovilizada se consideró
canalizado en di ff valores de pH actuales (3 - 8) formulado con hidrogenofosfato de sodio / ácido
cítrico bu ff er.
(2) La adaptación a la temperatura de la inulinasa libre e inmovilizada fue
realizado en di ff temperaturas actuales (40 - 70 ° C).
(3) La inulinasa libre e inmovilizada se mantuvo en un baño de agua a 70 ° C
respectivamente, y las actividades enzimáticas se ensayaron cada media hora para dibujar
curvas de estabilidad térmica. Cada actividad inicial fue speci fi ed como la actividad del 100%, y
las otras actividades ensayadas se presentaron como porcentajes relativos.
(4) La inulinasa libre e inmovilizada se almacenó en la nevera (4 ° C)
durante 6 semanas, y las actividades enzimáticas se ensayaron cada semana para dibujar curvas de estabilidad
en almacenamiento. De manera similar, todas las actividades ensayadas se presentaron como actividades
relativas.
(5) Se utilizó inulinasa inmovilizada reciente para hidrolizar la solución de inulina,
y su actividad inicial fue especi fi ed como el 100% de actividad. Luego, se añadió la misma
inulinasa inmovilizada a una solución de inulina reciente después de lavarla y secarla, con el
objetivo de volver a ensayar la actividad enzimática. Después de 10 reutilizaciones, se obtuvo la
curva de reutilización de la inulinasa inmovilizada.
(6) La trama Lineweaver-Burk se trazó para calcular el Michaelis-
Constante de Menten (K metro) y la velocidad máxima de reacción (V máx.) de la inulinasa libre e
inmovilizada. Las concentraciones de sustrato
inulina en este experimento fueron 20 - 100 g / L.
2.9. análisis estadístico
Todos los datos de condiciones de inmovilización y propiedades enzimáticas se determinaron
por triplicado, y los relacionados fi Las cifras se presentaron como media ± error estándar con el
software Origin 8.5. Los resultados de las condiciones de inmovilización se compararon mediante un
análisis de varianza unidireccional y se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a
0,05. fi hipocresía.
3. Resultados y discusión
3.1. Veri fi catión de hidroxilación superficial y aminación
FT-IR puede volver fl ect las características estructurales de modi fi perlas de vidrio ed encomiable.
Como se muestra en Figura 1 a, la curva de modi fi Las perlas de vidrio ed muestran algunos nuevos picos
de absorción característica en comparación
con las perlas de vidrio originales. Para perlas de vidrio originales, registradas como SiO 2,
el pico a 1035 cm - 1 está relacionado con el estiramiento, vibración y flexión
vibración de Si-O-Si. Para perlas de vidrio hidroxilado, registradas como
SiO 2 - OH, el pico a 966 cm - 1 corresponde a la vibración de flexión del Si-O, que demuestra el
desplazamiento de los enlaces Si-O causado por la superficie
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hidrólisis. Más importante aún, los picos a 1411 cm - 1 y 3688 cm- 1
pertenecen a la vibración de flexión y la vibración de estiramiento de O mi H respectivamente, lo que
indica que Si - Los grupos OH se exponen con éxito en el
superficie de perlas de vidrio. Para perlas de vidrio aminado, registradas como SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2,
los picos a 1624 cm- 1 y 3427 cm- 1 se atribuyen a la vibración de flexión
y estirando la vibración de N mi H respectivamente mientras que los picos característicos de O mi H
desaparecen, que veri fi es que el injerto de KH550 consume grupos hidroxilo libres en la superficie de
las perlas de vidrio. Mientras tanto, los enlaces Si-O-Si se forman de nuevo, provocando el cambio
de número de onda de
966 cm 1 hasta 1048 cm 1, y el pico a 914 cm - 1 representa Si - CH 2
se originó en KH550. Los resultados indican que los grupos amino libres son
preparado en la superficie de perlas de vidrio.
Los experimentos de teñido se utilizan para verificar los cambios de las propiedades cargadas de las
perlas de vidrio antes y después de la modificación de la superficie. fi catión macroscópicamente. Como se vio
en Figura 1 c, las perlas de vidrio originales son blancas, mientras que las perlas de vidrio aminado están
teñidas de azul, porque la interacción entre los grupos de ácido sulfónico cargados negativamente en la
estructura molecular del azul de anilina soluble en agua y los grupos amino protonados forman una atracción
electrostática estable y fi color rm.
3.2. Caracterización FT-IR
Figura 1 b corresponde a los espectros FTIR de perlas de vidrio aminado,
portadores de microesferas porosas poco profundas y osan. Para SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2, Se han analizado
los picos característicos. Para el quitosano, registrado como CS,
el pico a 3454 cm - 1 representa la vibración de estiramiento de O mi H y N mi H, debido a los grupos
hidroxilo y amino libres en las cadenas laterales del quitosano. Los picos a 2879 cm- 1, 1658 cm 1, 1380
cm 1, 1080 cm - 1 están relacionados con el estiramiento de la vibración de C - H, vibración de flexión de
N mi H, vibración de flexión de C - H, vibración de estiramiento de C mi N, respectivamente, atribuido a la
absorción de vibraciones característica entre átomos en la cadena de quitosano. Además, la
absorción de área amplia a 1250 - 1500 cm 1 y 1060 - 1150 cm 1 también se atribuyen a la vibración de
flexión de O mi H y vibración de estiramiento de C mi O mi C. Para poco profundo
portadores de microesferas porosas, registrados como SiO 2- CS, la característica
los picos de absorción se distinguen notablemente del SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y los picos adicionales son
similares a CS, revelando e ff entrecruzamiento efectivo de quitosano en
la superficie de las perlas de vidrio en la capa central. Es de destacar que la intensidad del pico a
1030 cm- 1 es más alto que el de 3400 cm- 1,
en comparación con los dos picos correspondientes de quitosano, lo que demuestra además la
contribución de numerosos enlaces Si-O-Si ubicados en la capa central.
3.3. Caracterización SEM
Sobre la base de la hidroxilación superficial y modi de aminación fi catión, se prepara la estructura
de la capa central de microesferas porosas poco profundas y luego el quitosano de capa delgada se
reticulará con glutaraldehído para producir la capa de la cubierta. SEM se utiliza para observar la
morfología de la superficie de los portadores. Figura 2 corresponde a imágenes SEM a 7000 × magni fi catión
de perlas de vidrio originales (a) y portadores de microesferas porosas poco profundas (b).
Figura 2 a muestra los defectos e impurezas en la superficie lisa de las perlas de vidrio originales, que
contrasta obviamente con la capa de cáscara holonómica con una distribución uniforme de quitosano en
Figura 2 segundo. La ausencia de los defectos demuestra un grosor adecuado de la cáscara, y la
estructura porosa formada por la reticulación gradual del quitosano y la eliminación del porógeno
también cumple con los requisitos para ocultar las proteínas enzimáticas.
3.4. Caracterización XRD
Para ilustrar la cristalinidad de las muestras, patrones XRD de SiO 2 - OH,
SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS se obtuvieron con di ff ángulos de acción (2 θ) que van de 5 ° a 70
°, como se muestra en Fig. 3 . Los picos anchos y débiles en
SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 con la ausencia de picos agudos indican que el dióxido de silicio
comprendido en las perlas de vidrio está casi en forma amorfa
estado, y el grado de 2 θ es aproximadamente consistente con el polvo
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Figura 1. ( a) Espectros FTIR de perlas de vidrio antes y después de la modificación de la superficie fi catión. (b) Espectros FTIR de perlas de vidrio antes y después del injerto de la capa de revestimiento. (c) Experimentos de teñido de perlas de vidrio antes y

después de la aminación.

Di ff Tarjeta de normas de acción (No. 29-0085). Con la introducción de quitosano en la capa de la
cáscara, las propiedades de los cristales de los portadores de microesferas porosas poco profundas
cambiaron, especialmente el pico relativamente agudo que aparece alrededor de 2 θ = 20 °, los picos
cristalinos característicos del quitosano, que indican la viabilidad de las perlas de vidrio recubiertas de
quitosano [ 25 ].
programa de temperatura lineal, que puede volver a fl Efectuar las propiedades termodinámicas de las perlas
de vidrio antes y después del injerto con quitosano. Figura 4 un
muestra las curvas DSC de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS. Todos los puntos de las
curvas son negativos, lo que significa que las tres muestras han
características dotérmicas con el proceso de calentamiento programado. por
SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2, el componente principal de las perlas de vidrio es el dióxido de silicio

3.5. Análisis térmico con una excelente estabilidad térmica, que no es fácil de oxidar

y se descomponen con exotermia e ff ect, exhibiendo un aumento continuo en la absorción de calor [ 26 ].

DSC se utiliza para estudiar el cambio de calor fl uy bajo el control de El fenómeno, que SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 yace arriba

Figura 2. Micrografías SEM de perlas de vidrio antes (a) y después (b) capa de recubrimiento de injerto.

4
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Fig. 3. Espectros XRD de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS.
Fig. 4. ( a) Curvas DSC de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS. (b) Curvas TGA de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA
HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS. (c) Magni fi ed curvas TGA de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 en el intervalo de
porcentaje en peso de 98% a 100%.
SiO 2 - OH, podría asignarse a una inestabilidad adicional de los grupos alifáticos
y grupos alquil amino introducidos por KH550. Para SiO 2- CS, los portadores de microesferas porosas
poco profundas exhiben un evidente aumento exotérmico
tendencia debido a la gran cantidad de elementos C, N y H oxidables en el quitosano. Esta tendencia
creciente es suave gradualmente hasta que la temperatura alcanza alrededor de 550 ° C, donde el
quitosano casi se oxida y se descompone por completo. El notable di ff erencia en celo fl uy aún más
fl Efectúa la reticulación estable entre el quitosano en la capa de la cáscara y las perlas de vidrio en la
capa central.
TGA se utiliza para describir la estabilidad térmica de materiales midiendo
5
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la relación entre la masa de sustancia y la temperatura bajo
el control del programa lineal. Las parcelas TGA de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2
y SiO 2- CS se muestran en Figura 4 segundo. Para SiO 2- CS, el fi La primera pérdida de peso ocurrió dentro
de los 100 ° C, atribuida a la pérdida de agua. sin embargo, el
curvas de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 no muestres tal signi fi no puede perder peso dentro
de los 100 ° C, lo que podría atribuirse a una gran cantidad de
grupos hidrófilos, como grupos hidroxilo y amino en el quitosano recubierto. Pérdida de peso observada
desde aproximadamente 210 ° C - 540 ° C podría estar relacionado con la descomposición térmica del
quitosano y la fi La pérdida de masa final mantiene el 40,37%. Comparado con mu ffl La prueba del horno,
en la que la masa antes y después de la calcinación es 0,1681 y 0,2797, la tasa de pérdida de masa
calculada es 39,90%. Por lo tanto, la tasa de injerto de quitosano en los portadores de microesferas
porosas poco profundas es aproximadamente del 40%. En vista de la
signi fi no puedo di ff erencia de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2, Figura 4 c es la ampli-
fi catión en el intervalo de porcentaje en peso de 98% a 100%. Dos curvas
también mostró el proceso de pérdida de agua dentro de los 100 ° C y la corta
a partir de entonces. Por encima de 300 ° C, la masa de SiO 2 - OH declina
lentamente, mientras que la masa de SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 atraviesa una disminución relativamente
sustancial, correspondiente a la descomposición térmica del metileno
grupos [ 27 ]. los fi pérdida de masa final de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 mantiene respectivamente
el 1,05% y el 1,98%. Por lo tanto, la tasa de injerto de KH550 es
aproximadamente 0,93%.
3.6. Caracterización XPS
XPS se utiliza ampliamente en el análisis cualitativo y cuantitativo de elementos. Como se
muestra en tabla 1 , aunque todas las muestras se secaron al vacío antes de la detección, las
proporciones de átomos de C en cada sustancia siguen siendo altas, debido a las condiciones
instrumentales y la adsorción superficial. Con la introducción de alquilo y quitosano, la proporción de
C
átomos en SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS aumenta gradualmente. SiO 2 - OH contienen solo Si, O y H, como se ve
en Figura 5 a, mientras que SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 son modi fi ed con
KH550 para introducir grupos amino y SiO 2- Los CS están cubiertos por macromoléculas de quitosano
ricas en grupos amino libres. Por eso la proporción
de átomos de N en SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS son 0%, 3,66% y
3,81% respectivamente. Además, TGA muestra que el KH550 injertado
solo representa el 1% de la masa total, lo que significa que la estructura principal
de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 sigue siendo SiO 2, por lo que las relaciones de sílice-oxígeno de SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA
HAMPSHIRE 2 debe ser aproximadamente 0,5, que puede ser
deducido de la tabla. Sin embargo, SiO 2- Se introducen CS de quitosano con una gran cantidad de C,
N, O, rompiendo así la sílice-oxígeno original
proporción.
Los espectros XPS de Si 2p en SiO 2 - OH y SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 se dan en
Figura 5 segundo. La energía de enlace de C 1 s ( 284,8 eV) se utiliza como referencia. En espectro de
SiO 2 - OH, el pico de Si 2p está en 103.03 eV, que es similar a Si 2p en SiO 2 [ 28 ]. Para SiO 2- NUEVA
HAMPSHIRE 2, el pico de Si 2p es 102,79 eV, be-
porque el NH 2 ( CH 2) 3- en KH550 hay un grupo donante de electrones fuerte, que se mueve hacia una
energía de enlace más baja. Además, la capa de caparazón de
portadores contiene abundante quitosano, donde no faltan fuertes
estructura del grupo de donantes. Por lo tanto, la energía de enlace de Si 2p en SiO 2- CS se puede mover
a 102.20 eV, una posición más baja. Según los resultados de
XPS, podemos promover un ffi rm que el quitosano se injerta en la superficie de las perlas de vidrio.
tabla 1
Porcentajes de elementos derivados del análisis XPS.
Muestra
Elemento SiO 2- OH SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 SiO 2- CS
C 32,68 36,84 68.15
norte 0,00 3,66 3,81
O 43,14 39,16 24.09
Si 24.18 20,34 3,95
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se propaga a las proximidades de las enzimas inmovilizadas y se produce una reacción de

autoreticulación entre las moléculas de la enzima. Auto-reticulación significa sobre reacción, lo que
reducirá la fl flexibilidad de las enzimas inmovilizadas y tener un impacto adverso en la formación de
intermedios de transición al combinarse con el sustrato [ 31 ]. En consecuencia, la actividad de la
enzima inmovilizada se correlaciona negativamente con el tiempo de reticulación después de 2,5 h.

Figura 6 cyd respectivamente revelan la e ff Los efectos de la dosificación de enzima y

glutaraldehído sobre la reacción de reticulación y la representación en forma de campana de los
resultados se muestran en los dos fi figuras. En cuanto a la enzima, la baja concentración de inulinasa
se acompaña de relativamente su ffi sitios cientes en los portadores, por lo que el aumento de la
concentración de enzima es beneficioso fi cial a la e ffi eficiencia de la reacción de reticulación. Sin
embargo, la tendencia a la inmovilización normal se debilita mucho y el impedimento estérico e ff El
efecto de restringir la reacción enzimática aumentó en consecuencia después de que los portadores se
combinan con una gran cantidad de moléculas enzimáticas [ 32 ]. En cuanto al agente de reticulación, la
regularidad en el rango de concentración más bajo es consistente con la de las enzimas. La reacción de
reticulación a ff ects el

fl flexibilidad de la enzima, es decir, la capacidad de inducir la conjugación con el sustrato. La

reticulación excesiva a menudo significa una interacción multipunto innecesaria entre las enzimas y
los soportes, adversa para la preservación de la conformación de la enzima [ 33 ], y luego aumente la

resistencia de la enzima al sustrato, así como la K metro. Por lo tanto, solo controlando la proporción
apropiada de enzima, reticulante
y portador, se puede optimizar la actividad de la enzima inmovilizada.
Sobre la base de los experimentos de un solo factor anteriores, se llevó a cabo el análisis de
varianza unidireccional. Cuando el valor p se selecciona como 0.05, el orden de en fl Los factores de
influencia de la reacción de reticulación son los siguientes: pH, relación molar de glutaraldehído y
grupos amino portadores, tiempo de reticulación, relación molar de enzima libre y grupos amino
portadores. Entre ellos, el pH tiene un signi fi no puedo en fl uencia sobre la actividad de las enzimas
inmovilizadas, atribuida principalmente a la e ff ect sobre la formación de Schi ff base y la rigidez de las
enzimas inmovilizadas [ 32 ]. Por lo tanto, el valor de pH del sistema de reacción debe controlarse
estrictamente en vista de la notable diferencia ff diferencias en la actividad enzimática.

Fig. 5. ( a) Espectros de estudio de barrido amplio XPS de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS. (b) Espectros XPS de Si 2p

de SiO 2 - OH, SiO 2- NUEVA HAMPSHIRE 2 y SiO 2- CS.

En conclusión, las condiciones óptimas para la preparación de inulinasa inmovilizada son: (1) el
valor del pH se controla a 5,0; (2) la reacción de reticulación se realiza durante 2,5 h; y (3) la relación
3.7. Inmovilización de inulinasa
molar de enzima libre, glutaraldehído y grupo amino portador es

En este artículo, los siguientes factores principales fl Se discuten los factores que influyen en la
5,0 × 10 - 3: 0,3: 1. En estas condiciones óptimas, la actividad de la inulinasa inmovilizada es de 24,67
inmovilización: valor de pH, tiempo de reticulación, dosis de enzima y dosis de glutaraldehído. Las
U / mg, conservando el 73% de la actividad de la inulinasa libre.
actividades enzimáticas bajo di ff Las diferentes condiciones de inmovilización se muestran como Figura 6 .
Los datos re fl efectuando actividades enzimáticas en di ff Los valores de pH actuales se trazaron en Figura
6 a. La actividad enzimática alcanza su punto máximo a pH 5,0, lo que indica que el glutaraldehído puede
3.8. Propiedades enzimáticas de la inulinasa inmovilizada
formar Schi ff estructura de base con grupos amino en acidez débil. Sin embargo, el valor del pH puede ff ect
microambiente enzimático y reticulación e ffi eficiencia. El valor de pH óptimo de la inulinasa libre para
La reacción de inmovilización plantea determinante e ff afecta la naturaleza de la enzima debido al
catalizar la hidrólisis de la inulina es aproximadamente 7,0, en el que los residuos de aminoácidos del
hecho de que su conformación espacial y modo catalítico cambian en consecuencia [ 34 ], que se
centro catalítico están completamente expuestos en los estados más activos, con la intención de unirse
manifiesta principalmente como las transformaciones de las condiciones óptimas de funcionamiento, la
al sustrato. Si la inmovilización se opera a pH
estabilidad y la cinética de la reacción enzimática.

Figura 7 ayb despliegan comparaciones claras sobre la adaptabilidad del pH y la temperatura de

7.0, la reacción de reticulación puede tener lugar en los residuos de aminoácidos del centro activo, lo
la inulinasa libre e inmovilizada, respectivamente. Por un lado, las actividades de las enzimas
que lleva a la alteración de la estructura de la proteína o incluso a la inactivación completa con un
inmovilizadas disminuyen al 73% de las de las enzimas libres, lo que provoca cierta pérdida de
aumento de la resistencia de las enzimas inmovilizadas que se unen al sustrato. Esta es la razón por
actividades durante la inmovilización.
la que la actividad de la enzima disminuye al nivel más bajo a pH 7,0 y luego aumenta lentamente. De
MG Holyavka y col. [ 35 ] inulinasa inmovilizada en matriz de resina de intercambio iónico KU-2 e
manera similar, también hay otras investigaciones que informan que la curva de pH e ff El efecto sobre
indicó que la inulinasa inmovilizada muestra 60% de actividad de inulinasa libre, que podría atribuirse
la reacción incluye tanto el pico como el valle [ 29 , 30 ], lo que demuestra el carácter distintivo del pH e ff ect
a la di ff resistencia al uso entre las enzimas macromoleculares adsorbidas en las microcavidades
sobre la reacción de reticulación.
internas de las resinas de intercambio iónico y los sustratos en el ambiente externo [ 36 ]. Además,
para la estrategia de adsorción de la enzima inmovilizadora, el ffi La cantidad de enzima en el interior
Figura 6 b demuestra la e ff efecto del tiempo sobre la reacción de reticulación. En la etapa de 0 - 2,5
es baja, mientras que la enzima en la superficie no es estable. Es a la vista de la desventaja de los
h, existe una correlación positiva entre la actividad de la enzima inmovilizada y el tiempo, atribuida a
portadores porosos actuales que estamos comprometidos a desarrollar nuevos portadores con poros
la creciente cantidad de enzima libre di ff usando en los poros poco profundos, y luego el valor pico
poco profundos en la superficie para la unión covalente a la enzima, de modo que puedan significar fi Reduzca
aparece a las 2.5 h. Después de 2,5 h, considerando que los poros superficiales han sido ocupados
la resistencia de transferencia y mejore la estabilidad mientras oculta las proteínas enzimáticas.
por inulinasa, los esferoides de proteínas enzimáticas provocan un gran impedimento estérico, lo que
da como resultado el hecho de que la enzima libre solo

6
Y. Yang y col.
Figura 6. Actividades enzimáticas bajo di ff diferentes condiciones de inmovilización. (a) E ff efecto del pH en la reacción de reticulación. (b) E ff efecto del tiempo en la reacción de reticulación. (c) E ff efecto de la relación molar de enzima y grupos
amino portadores en la reacción de reticulación. (d) E ff efecto de la relación molar de glutaraldehído y grupos amino portadores en la reacción de reticulación.
Por otro lado, la pendiente de la curva de enzimas inmovilizadas disminuye y el rango adecuado
se amplía. La inulinasa inmovilizada aún mantiene más del 90% de actividades relativas en un pH de
5,0 - 7.0 y más del 95% en un alcance de temperatura de 50 - 60 ° C. En el proceso industrial, la
temperatura alta es más propicia para la hidrólisis enzimática de la inulina, debido a la mayor
solubilidad del sustrato, menor contaminación microbiana y mejor conversión de la reacción [ 37 ]. En
comparación con la literatura reportada por H. Hang et al. [ 38 ], donde la inulinasa inmovilizada
muestra una actividad óptima a un pH de aproximadamente 5 y mantiene un 65% de las actividades
relativas a 60 ° C, el resultado de este estudio muestra una adaptabilidad de pH y temperatura más
amplia y más favorable para aplicaciones industriales. Además, similar a la literatura reportada por
RS Singh [ 39 ], el pH óptimo no convertido de la inulinasa inmovilizada podría atribuirse a la inercia
del material portador, mientras que el cambio de temperatura óptima podría deberse a la
conformación molecular estable de las proteínas enzimáticas causada por la reticulación rígida. En
resumen, las enzimas inmovilizadas demuestran una estabilidad más excelente cuando se someten
a cambios de pH y temperatura.
Figura 7 c re fl ects el signi fi no puedo di ff diferencias que existen entre la inulinasa libre e
inmovilizada sobre la estabilidad térmica. Después de 3 h de conservación por calor a 70 ° C, la
inulinasa inmovilizada aún mantiene el 69,20% de sus actividades iniciales mientras que la inulinasa
libre solo mantiene el 33,79%. El resultado sugiere que la sensibilidad de las enzimas inmovilizadas
al medio ambiente disminuye y la adaptabilidad mejora, debido al hecho de que los portadores
proporcionan ciertos refugios para las enzimas en forma de enlaces covalentes para fortalecer la
conformación de las enzimas y resistir las reacciones de desnaturalización térmica [ 40 , 41 ]. Así,
inmovilizado
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Catálisis molecular 486 (2020) 110871
La inulinasa puede desempeñar su función catalítica a una temperatura relativamente alta en vista de su
excelente estabilidad térmica.
Figura 7 d muestra la curva de atenuación de las actividades de inulinasa libre e inmovilizada con
el tiempo de almacenamiento. Después de 6 semanas de almacenamiento a 4 ° C, la inulinasa
inmovilizada aún mantiene el 71,43% de sus actividades iniciales mientras que la inulinasa libre solo
mantiene el 44,25%. Aunque ambas actividades enzimáticas están disminuyendo, la tasa de reducción
de las enzimas inmovilizadas se ralentiza obviamente. Después de todo, la estabilidad mejorada de la
conformación de la enzima durante la reticulación química puede e ff prevenir eficazmente la posible
degeneración estructural causada por factores externos adversos [ 42 ].
Figura 7 e muestra la curva de atenuación de las actividades de inulinasa inmovilizada con
reutilizaciones. La inulinasa inmovilizada todavía mantiene el 77,93% de sus actividades iniciales
después de 10 reutilizaciones, y se calcula que la vida media para la reutilización es
aproximadamente 22 veces. La disminución de la actividad de las enzimas inmovilizadas reutilizables
puede deberse a la separación de las enzimas de los portadores y al encuentro repetido entre
enzimas y sustratos [ 43 , 44 ]. La reutilización de las enzimas inmovilizadas es la principal
característica que las distingue de las enzimas libres. Es por esta razón que las enzimas
inmovilizadas pueden usarse ampliamente en la producción industrial continua. KS Paripoorania y
col. [ 45 ] inmovilizar inulinasa en micropartículas de magnetita quitosana para preparar un
biocatalizador estable y reciclable para la producción de jarabe de alta fructosa. Aunque muestra
cierta ventaja en la separación enzimática debido a la introducción de partículas magnéticas, la
inulinasa insolubilizada disminuye al 50% de sus actividades iniciales después de 8 reutilizaciones. El
fenómeno puede deberse al hecho de que el material principal del soporte, el quitosano, no
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Figura 7. Propiedades enzimáticas. (a) Adaptación del pH de la inulinasa libre e inmovilizada. (b) Adaptación a la temperatura de la inulinasa libre e inmovilizada. (c) Estabilidad térmica de la inulinasa libre e inmovilizada
a 70 ° C. (d) Estabilidad en almacenamiento de inulinasa libre e inmovilizada a 4 ° C. (e) Reutilización de inulinasa inmovilizada. (f) Gráfico de Lineweaver-Burk de inulinasa libre e inmovilizada.

tienen buena resistencia mecánica y no pueden mantener su ffi ciente estabilidad durante ciclos
repetidos. Por lo tanto, los portadores de microesferas porosas poco profundas con perlas de vidrio
como capa central, al tiempo que satisfacen una fácil separación de las enzimas inmovilizadas,
mejoran la resistencia mecánica y la estabilidad operativa más específicamente. fi cally. RS Singh y col.
[ 39 ] usar modi fi ed nanotubos de carbono de paredes múltiples como soporte para preparar inmovilizar
la inulinasa, mientras que su actividad residual se conserva 28% después de 10
ciclos por lotes. Este resultado podría atribuirse al hecho de que la enzima expuesta en la superficie
del portador carece de e ff protección eficaz y no puede resistir la pérdida por fricción durante el
proceso de hidrólisis repetido. Es precisamente debido a los poros poco profundos que la proteína
está moderadamente oculta en este estudio, lo que hace que la enzima inmovilizada exhiba una
excelente estabilidad de reutilización que otras.
Figura 7 f es el gráfico de Lineweaver-Burk, que muestra la relación del

8
Y. Yang y col.
velocidades iniciales de descomposición de la inulina y el concentrado de inulina cuando se usa
inulinasa libre e inmovilizada. Los parámetros cinéticos se calculan
culado como K m = 2,81 mg / ml y V max = 147,06 U / mg gratis en
ulinasa mientras que K m = 10,82 mg / ml y V max = 90,09 U / mg para inulinasa inmovilizada. Es obvio
que el proceso de inmovilización de
enzima conduce al aumento de K metro y la disminución de V máx. Una explicación razonable es que la
rígida transición del concepto espacial
formación de las moléculas de enzima y la subsecuente di ff límite de resistencia al uso ffi nidad de
enzimas a sustratos [ 46 , 47 ].
4. Conclusiones
Este estudio revela principalmente un nuevo diseño de desarrollo de portadores de microesferas
porosas poco profundas con estructura de núcleo-capa. La caracterización de FT-IR, TGA-DSC, XPS,
XRD y SEM demuestra que los portadores de microesferas porosas poco profundas amorfas están
compuestos principalmente de perlas de vidrio, que representan el 60% del peso total y el quitosano
forma una capa de injerto recubierta uniformemente en la superficie. , que representa el 40% del peso
total. En el proceso de inmovilización de inulinasa en portadores de microesferas porosas poco
profundas, el valor de pH de la reacción de reticulación debe controlarse estrictamente en vista de la
signi fi no puedo en fl influencia sobre la actividad enzimática.
Debido a la resistencia mecánica de la capa central, los numerosos sitios de la capa de la
cáscara y la protección moderada de los poros poco profundos, la inulinasa inmovilizada mantiene
más del 90% de actividades relativas en un pH de 5,0. - 7.0 y 95% de actividades relativas en un
alcance de temperatura de 50 - 60 ° C, que muestra una mejor tolerancia y estabilidad ambiental. En
particular, la inulinasa inmovilizada aún conserva el 77,93% de su actividad inicial después de 10
ciclos, presentando una excelente estabilidad de reutilización que otras, que se puede aplicar
adicionalmente a la producción industrial continua.
Declaración de contribución de autoría de CRediT
Yang Yang: Conceptualización, Metodología, Redacción - borrador original. Hongmei Yu: Validación,
Investigación, Visualización. Xiaohua Zhou: Recursos, Supervisión, Administración de proyectos. Zhen
Zhou:
Análisis formal, redacción - revisión y edición.
Declaración de intereses en competencia
Los autores declaran que no tienen conocimiento de competencia fi intereses financieros o
relaciones personales que podrían haber aparecido en fl influyen en el trabajo informado en este
documento.
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