Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166

Listas de contenidos disponibles en ScienceDirect

Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones

revista Página de inicio: www.elsevier .com / localizar / dsx

revisión

Enzimas de disociación del tejido pancreático humano para el aislamiento de islotes: avances y
perspectivas clínicas

Gopalakrishnan Loganathan un , segundo , Appakalai N. Balamurugan un , Subhashree Venugopal segundo , *

un Laboratorio clínico de células de islotes, Instituto de Innovación Cardiovascular, Departamento de Cirugía, Universidad de Louisville, Louisville, KY, EE. UU.
segundo Escuela de Biociencias y Tecnología, Instituto de Tecnología de Vellore, Vellore, India

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Antecedentes y objetivos: El trasplante clínico de aloo o auto-islote humano exitoso requiere la recuperación de un fi ciente número de islotes
Recibido el 18 de octubre de 2019 funcionales de páncreas con muerte cerebral o pancreatitis crónica, respectivamente.
Recibido en forma revisada el 26 de
enero de 2020
Métodos: En las dos últimas décadas (2000 mi 2019), signi fi Se ha avanzado mucho en la mejora de los procedimientos de aislamiento de los islotes
Aceptado el 27 de enero de 2020
humanos y en la estandarización del uso de diferentes mezclas de enzimas de disociación de tejidos (TDE; una mezcla de enzimas colagenasa y
proteasa) para recuperar mayores rendimientos en los islotes.
Palabras clave:
Resultados y Conclusiones: Esta revisión presenta información centrada en las propiedades y el papel de las mezclas de TDE durante el proceso de
Aislamiento de islotes
aislamiento de los islotes, haciendo especial hincapié en los desarrollos actuales, los desafíos asociados y las perspectivas futuras dentro de la región. fi vejez.
Trasplante de islotes
Colagenasa
Termolisina © 2020 Diabetes India. Publicado por Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
Proteasa neutra
BP-proteasa

1. Introducción
Composición de la matriz extracelular pancreática y la membrana basal: El páncreas es un
órgano compuesto por una vasta red de tejido endocrino y exocrino. Los islotes comprenden la
porción endocrina y están conectados al tejido exocrino circundante por una matriz extracelular
extensa (MEC) [ 1 , 2 ]. Un gran porcentaje de islotes humanos residen cerca de los conductos
exocrinos [ 3 ]. Para que los procedimientos de aislamiento de islotes tengan éxito, las enzimas de
disociación de tejidos (TDE) deben descomponer eficazmente este ECM que mantiene los islotes
incrustados en el tejido circundante, sin afectar su función. Todo ECM consta de ambos fi brillar y no fi proteínas
brillar. El predominante
fi Las proteínas brillar incluyen los tipos de colágeno I, III y V [ 4 ]. Todas estas proteínas comparten
una estructura común de triple hélice que contribuye a la fuerza de la proteína, pero también sirven
como un objetivo importante para las colagenasas utilizadas en el aislamiento de islotes [ 5 ].
Recientemente se ha identificado colágeno tipo VI fi ed como otro componente clave en la ECM
pancreática que es abundante en el islote y la interfaz acinar exocrina circundante.
Abreviaturas: TDE, enzima de disociación de tejidos; WU, Unidades Wunsch; NP, proteasa neutra; MTF, libre de
tejidos de mamíferos; CDA, ensayo de degradación de colágeno; Wunsch, Medición de la actividad C2.
Se diferencia de otros tipos de colágeno en que no se forma fi brils. También es resistente a la
escisión por proteasas bacterianas debido a sus niveles excepcionalmente altos de disul fi de residuos
de cisteína formadores de puentes [ 6 ]. Más cerca de la superficie de los islotes y que recubren los
conductos exocrinos, hay un área distinta de ECM conocida como la membrana basal (BM) que tiene
un signi fi composición ligeramente alterada en comparación con el resto del ECM. Si bien contiene
algunos de los fi proteínas brillar, tiene una concentración mucho más alta de colágeno tipo IV y
laminina [ 7 ].
Varios factores afectan la composición de la ECM pancreática haciendo que cada órgano sea
único. Esta variabilidad en la ECM tiene implicaciones drásticas para el aislamiento de islotes, ya que
la ECM de páncreas de ciertos grupos de pacientes tiene una mayor resistencia a las mezclas
estándar de TDE. Se ha observado bien que algunos TDE digieren más fácilmente el tejido y liberan
islotes del tejido pancreático de donantes mayores, en comparación con los donantes jóvenes [ 1 ]. Un
estudio identi fi ed que una alteración en la BM del tejido acinar en el páncreas de donantes de 50
años [ 6 ], al permitir que las soluciones enzimáticas se perfunden retrógradamente a través de los
conductos pancreáticos, permitió un acceso más fácil para liberar los islotes deseados. Aunque
Bedossa et al., Informaron mayores cantidades de colágeno total en pacientes [ 8 ], un estudio
reciente notó una signi fi No puede aumentar la cantidad de colágeno tipo IV y laminina, los principales
elementos de la MO, en páncreas de pacientes más jóvenes [ 9 ]. Esta estructura distintiva del BM
podría ser la causa de una disminución de la digestión en páncreas más jóvenes. Pancreatitis crónica
avanzada

* Autor correspondiente. Escuela de Biociencias y Tecnología, Instituto de Tecnología de Vellore, Vellore, India.

Dirección de correo electrónico: vsubhashree@vit.ac.in (S. Venugopal).

https://doi.org/10.1016/j.dsx.2020.01.010
1871-4021 / © 2020 Diabetes India. Publicado por Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
160 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166

(ahora vendido por Roche), " Liberase ™ - Hola Puri fi mezcla de enzimas ed ", se introdujo en 1994.
(CP) también se ha demostrado que disminuye los rendimientos durante los aislamientos de islotes ( Figura 1 SEGUNDO).

También se ha observado que el tejido pancreático de pacientes con PC tiene signi fi Cantidades de colágeno Esta enzima se ofreció como un vial con un
significativamente más altas que los páncreas normales [ 10 , 11 ]. fi dosis de enzima fija. Contenía el C1 / C2 colagenasa de
C. histolyticum y termolisina (TL), una proteasa neutra termoestable de Bacillus thermolyticus rokko, y
una baja contaminación por endotoxinas. La introducción de esta enzima en el mercado mejoró
inmediatamente los rendimientos de los islotes a partir de procedimientos clínicos de aislamiento de
1.1. Enzimas de disociación de tejidos
islotes [ 25 ]. Como resultado, el uso de enzima bruta disminuyó para el aislamiento de islotes
humanos. Sin embargo, puri fi La catión de colagenasa no eliminó la variabilidad de los lotes, ya que
Perspectivas históricas: Los colágenos son un componente importante de la ECM del tejido
muchos laboratorios todavía obtenían resultados inconsistentes de aislamiento de islotes.
conectivo en todo el cuerpo humano. Como lo implica su nombre, la colagenasa ha sido el
componente estándar en muchas mezclas de enzimas utilizadas para el aislamiento celular, y tiene la
capacidad única de cortar la estructura de triple hélice del colágeno nativo [ 12 ]. Era fi disponible
En los últimos años, las mezclas de enzimas de aislamiento han comenzado a contener puri fi ed C1
comercialmente por primera vez en laWorthington Biochemical Corporation en 1959. En 1970 ' Muchos
/ C2 colagenasas. C1 es más estable y tiene una mayor actividad hacia el colágeno nativo; mientras, C2
otros proveedores ofrecieron un " colagenasa cruda " producido desde Clostridium histolyticum que,
tiene la capacidad de digerir una gama más amplia de sustratos de péptidos en comparación con C1.
además de la colagenasa, contenía muchas otras enzimas, como fosfolipasa, clostripaína, elastasa,
aminopeptidasa, galactosidasa y otras proteasas [ 13 ]. Este producto crudo fue ampliamente utilizado
Entre los tres proveedores de enzimas conocidos (VitaCyte, Serva y Roche), solo VitaCyte y Roche C1
para aislar especi fi c tipos de células de diferentes fuentes de tejidos como el páncreas [ 14 ], hígado [ 15
/ C2 se conoce la proporción de colagenasa (60:40) [ 26 ]. Algunos estudios han indicado que la
], cartílago [ dieciséis ], corazón [ 17 ], adiposo [ 18 ], y hueso [ 19 ].
relación entre C1 y C2 colagenasas es importante para el aislamiento óptimo de islotes en páncreas
de rata y humano [ 27 , 28 ]; Por el contrario, estudios previos han demostrado que diferentes C1 / C2 proporciones
y dosis de puri fi ed colagenasa, cuando se probó para el aislamiento de islotes humanos, no tuvo
signi fi efecto sobre la digestión y rendimiento de los islotes [ 29 ].
Las colagenasas son Zn-metaloproteinasas con capacidades de endopeptidasa producidas a
partir del caldo de fermentación de C. histolyticum.
Teniendo en cuenta que la mayoría de las otras proteasas son ineficaces para degradar el colágeno ' s
Colagenasa: Para separar los islotes del resto del tejido del islote pancreático, es necesario
triple hélice, la especificación única fi ciudad que comparten las colagenasas ha sido el motivo de una
digerir la interfaz entre los islotes y el tejido exocrino. El colágeno es el componente principal de esta
extensa investigación sobre sus propiedades biológicas y enzimáticas [ 20 ]. La colagenasa es
interfaz. Las colagenasas son enzimas proteolíticas, que rompen las moléculas de proteínas en
producida por dos genes distintos, ColG y ColH, codificación para la clase I ( C1) y Clase II ( C2) colagenasas
forma de cadena larga en péptidos. Las enzimas proteolíticas son clasi fi ed basado en su sitio
que tienen pesos moleculares de 116 kDa y 114 kDa, respectivamente [ 21 ]. C1 y C2 Las
objetivo de escisión. Hay dos grupos principales, exopeptidasas, que se dirigen a los extremos
colagenasas parecen digerir la mayoría de las formas de fi colágeno brillar ya que la estructura de
terminales de las proteínas, y endopeptidasas, que se dirigen a sitios dentro de una proteína. Las
triple hélice es un componente clave de estas moléculas. los C1 y C2 las enzimas trabajan
enzimas proteolíticas están presentes en mamíferos, bacterias y algunos virus y plantas. Las
sinérgicamente para hidrolizar estas estructuras helicoidales en péptidos más pequeños [ 22 , 23 ].
colagenasas se unen a especi fi básicamente a, y corta, secuencias de aminoácidos que contienen
Pro-X-Gly-Pro, donde X es usualmente un aminoácido que es neutro, como arginina o lisina. La
combinación de estas secuencias es inusual en proteínas distintas de los colágenos. Por lo tanto, las
colagenasas son muy específicas fi c en su actividad y también son las únicas enzimas que pueden
La colagenasa se ha utilizado comúnmente para la digestión del páncreas humano. Su eficacia
degradar el colágeno nativo [ 30 mi 32 ]. Hay dos isoformas de colagenasa, clase I y clase II, también
en el aislamiento de islotes pancreáticos lo ha convertido en la base estándar de casi todas las
llamadas ColG y ColH, respectivamente. Dos genes homólogos pero separados, colG y colH,
mezclas de enzimas para protocolos de aislamiento de islotes clínicos y de investigación. Hasta 1990 '
codifican las respectivas isoformas [ 33 ].
s, el uso de
" crudo " o colagenasa enriquecida para el aislamiento de islotes pancreáticos [ 24 ] vino con algunos
problemas, como la variabilidad de la actividad enzimática de un lote a otro y la contaminación por
endotoxinas. Para superar estos obstáculos, un puri fi mezcla de enzimas ed de Boehringer Mannheim
Biochemicals

Figura 1. Aislamiento de islotes dif fi cultivos debido a la variabilidad de donante a donante, la gravedad de fi brosis y morfología de islotes incrustados de páncreas de donante joven: imagen representativa de (A) páncreas de donante con muerte cerebral, (B)
páncreas de pancreatitis crónica e (C) imagen de islote incrustado (islote rodeado de tejido exocrino) morfología de donantes jóvenes que resultan con grandes tamaño de pellet (D).

Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166
Las dos clases tienen actividad endopeptidasa y exopeptidasa. Tienen speci similares fi ciudad, pero
se complementan entre sí en términos de su modo de acción sobre la triple hélice del colágeno.
Clase I ( C1) la colagenasa hidroliza los loci en los extremos de la triple hélice y luego continúa
escindiendo las tres hebras simultáneamente cerca del Cterminus. Clase II ( C2) colagenasa, por otro
lado, comienza a escindir los interiores de la hélice [ 34 mi 36 ]. También hay diversidad de formas (es
decir, diferentes isoformas) dentro de cada clase de colagenasa. No se sabe mucho sobre cómo
funcionan estas isoformas [ 37 ], pero parecen tener una reacción cruzada [ 38 ]. La relación entre las
clases de colagenasa I y II también parece afectar la ef fi cacia de la mezcla de enzimas en la
digestión del páncreas. Sin embargo, no de fi Se pueden sacar conclusiones finitas porque algunos
estudios han indicado un mayor éxito en aislamientos humanos al reducir la actividad de clase I [ 39 ],
mientras que se ha encontrado lo contrario en roedores, donde solo se necesita colagenasa de clase
II para la digestión pancreática si la colagenasa se complementa con proteasa neutra [ 40 , 41 ].
Colagenasas anteriores de C. histolyticum
comúnmente se llama colagenasa cruda, porque C. histolyticum
produce varias colagenasas diferentes que pueden degradar diferentes tipos de colágeno. Además
de producir colagenasas, esta cepa bacteriana también produce otras proteasas como
aminopeptidasa, clostripaína, fosfolipasa y proteasa neutra, todas las cuales han estado presentes
en los lotes de colagenasa disponibles comercialmente. Tomados en conjunto, estos factores
contribuyen en gran medida a la variabilidad de la actividad enzimática entre diferentes lotes de
colagenasa y, a veces, incluso de un vial a otro debido a la inestabilidad de las enzimas [ 42 ] y
dosificación del producto en los viales. Durante estos años, la colagenasa puri fi catión ha mejorado.
Usando puri fi ed colagenasa sola sin complementar la mezcla de enzimas, sin embargo, puede
resultar en fi ciente digestión del páncreas. La presencia de estas otras proteasas parece ser esencial
para la liberación adecuada de los islotes del parénquima pancreático, y estas enzimas adicionales
se sinergizan con la colagenasa para producir una digestión eficaz del páncreas. Es necesario tener
precaución en la digestión, ya que una exposición excesiva a las proteasas puede desintegrar y
fragmentar los islotes y, por lo tanto, reducir el rendimiento de los islotes [ 43 , 44 ]. Las colagenasas
que contienen concentraciones más altas de actividad de tipo tríptico (TLA) parecen facilitar la
significación fi rendimientos de islotes significativamente más altos que los de lotes con cantidades
menores de esta actividad, una observación que puede ser cierta tanto en roedores como en
humanos [ 45 ].
Proteasas: Dado que la colagenasa sola puede no ser suficiente fi ciente para aislar islotes
humanos, puri corriente fi Las colagenasas ed se complementan con proteasas para lograr mayores
rendimientos en los islotes ( Tabla 1 ). Proteasa neutra (NP) de C. histolyticum y termolisina (TL) se
han utilizado ampliamente en aislamientos clínicos de islotes. Además, BP proteasa (BPP), o
dispasa, de Paneibacillus polymyxa y clostripaína de C. histolyticum también se han utilizado con
éxito para aislamientos de islotes humanos [ 29 , 46 ]. NP, TL y BPP son todas Znmetaloproteasas que
varían de 30 a 35 kDa. TL ha sido un tema de interés durante muchos años debido a su estructura
térmicamente estable como resultado de cuatro iones de calcio espectadores [ 47 ] y su muy amplio
sustrato speci fi ciudad, que incluye muchos componentes del ECM intersticial y la membrana basal [ 48
mi 52 ]. Aunque NP y BPP parecen tener especi fi ciudades que TL [ 53 mi 55 ], se ha demostrado que las
tres proteasas escinden preferentemente los enlaces N-terminales de los residuos hidrófobos [ 56 mi 58
]. Otra proteasa utilizada por algunos laboratorios de aislamiento de islotes humanos es la
clostripaína, una cisteína-proteasa heterodimérica también aislada de C. histolyticum. Se produce en
forma inactiva antes de que una reacción de autocatálisis elimine un péptido enlazador [ 59 ]. los fi La
enzima activa final consiste en una cadena pesada de 43 kDa y una cadena ligera de 15 kDa [ 60 ]. Se
ha demostrado que posee propiedades de amidasa y esterasa, así como la capacidad de escindir
laminina, un componente importante de la membrana basal [ 61 ]. Un estudio ha sugerido la
posibilidad de que la clostripaína pueda proporcionar un mejor efecto fi eficiencia de los aislamientos
de islotes cuando se utiliza en
Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
161
junto con colagenasa ( C1 y C2) y NP [ 62 ].
Evaluación de la actividad de la enzima colagenasa: Los proveedores de enzimas de
aislamiento clínico de islotes (VitaCyte, Serva / Nordmark y Roche) expresan su actividad enzimática
(colagenasa) en ' Unidades Wunsch '. Los ensayos de Wunsch y FALGPA utilizan un sustrato
peptídico que detecta preferentemente la actividad de colagenasa; sin embargo, estos ensayos de
peptidasa detectan principalmente C2 actividad y evaluar solo la función del dominio catalítico. Por el
contrario, la verdadera actividad de colagenasa funcional se detecta utilizando un sustrato de
colágeno nativo. VitaCyte ' s
fl El ensayo de actividad de degradación de colágeno en microplaca fluorescente (CDA) mide la
enzima que contiene un dominio catalítico y un dominio de unión al colágeno. El colágeno debe fi Primero
se unen de forma segura al colágeno nativo antes de que el dominio catalítico en la misma molécula
pueda cortar el colágeno. ' s estructura de triple hélice. El tratamiento de colagenasa con quimotripsina
conduce a la eliminación de los dominios de unión al colágeno y a la pérdida de casi toda la actividad
CDA con un cambio mínimo en la actividad de Wunsch. Estudia en VitaCyte LLC han mostrado el
speci fi C
Actividad CDA de C1 116 kDa es alrededor de 7 mi 8 veces más alto que el C1 100 kDa
o C2 114 kDa formas de colagenasa [ 63 ].
1.2. Perspectivas clínicas
Liberase-HI se ha utilizado durante muchos años en todo el mundo para el trasplante clínico de
islotes. En 2007, el puri fi ed enzima Liberase-HI, se retiró del mercado debido a problemas de
seguridad (el uso de materiales derivados del cerebro bovino durante el proceso de fermentación). La
identificación de una mezcla de enzimas de reemplazo adecuada se convirtió en una de las
principales prioridades para el éxito continuo de los programas clínicos de trasplante de islotes en
todo el mundo [ 64 ]. Durante este tiempo, la única enzima disponible para el aislamiento clínico fue la
colagenasa NB1 de Serva / Nordmark [ sesenta y cinco ]. El puri fi Las enzimas colagenasa de grado
clínico y proteasa neutra ed se suministraron en viales separados. Al carecer de alternativas viables,
muchos centros lucharon por establecer protocolos de aislamiento estandarizados con estas
enzimas, lo que resultó en menores rendimientos de los islotes que eventualmente condujeron a
menos procedimientos de trasplante de islotes [ 64 , 66 ].
Szot y col. utilizó la enzima Serva / Nordmark para aislar islotes y utilizó un alto porcentaje de
estas preparaciones para alotrasplantes clínicos [ 67 ]. Como parte del grupo de islotes de la
Universidad de Minnesota, nuestro grupo también informó que la misma enzima podría utilizarse con
éxito para el aislamiento de islotes autólogos de páncreas CP. Los resultados de los aislamientos de
islotes autólogos utilizando la colagenasa NB1 fueron comparables con el Liberase-HI tradicional en
términos de rendimiento de islotes y resultados clínicos [ 68 ]. Sin embargo, el grupo de Minnesota no
pudo obtener rendimientos de islotes lo suficientemente altos a partir de páncreas de donantes
cadavéricos cuando se utilizó la enzima Serva / Nordmark para mejorar el porcentaje de aislamiento
exitoso de islotes que se utilizó para trasplantes [ 69 ], Se utilizó VitaCyte Colagenasa HA en lugar de
la Colagenasa Serva NB. La comparación bioquímica de estos productos mostró que la enzima
Serva / Nordmark contenía una fracción más alta de colagenasa de clase I truncada que la que se
encontró en la colagenasa VitaCyte, que contenía principalmente colagenasa intacta
C1 colagenasa. Como se señaló anteriormente, intacto C1 colagenasa tiene una especificación más alta fi c
CDA que truncado C1 o intacto C2 colagenasa.
El uso de Serva / Nordmark ' s La enzima colagenasa NB-1 afectó los rendimientos de los islotes,
ya que digirió mal el tejido, lo que dio como resultado islotes con manto (islotes incrustados en tejido
exocrino), que a su vez conducen a fi culty durante el puri fi proceso catiónico [ 70 ]. Puri fi Las mezclas de
enzimas de disociación de tejidos (TDE) son fundamentales para el éxito del aislamiento de los
islotes humanos, pero se sabía poco sobre las enzimas clave de clase I ( C1) y clase II ( C2) características
de colagenasa. Nosotros fuimos los fi primer grupo para demostrar diferencias únicas entre los C1 colagenasa
encontrada en puri fi ed colagenasa fabricados por tres proveedores principales y evaluó el impacto de
C1 diferencias entre dos proveedores sobre el rendimiento de islotes humanos. Nuestros resultados
enfatizaron la
162 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166

tabla 1
Características de las enzimas de aislamiento de islotes.

Enzima Bacterias Sustratos Estructura Papel en la digestión de ECM pancreática

Colagenasa Clostridium Escinde preferentemente los enlaces Zn-metaloproteasa (155 kDa) C1 tiene una menor capacidad para digerir el
G (ColG, histolyticum Nterminales de los residuos de Gly. que contiene dos enlaces de colágeno colágeno tipo III y produce una significativa fi patrón
C1) dentro de los típicos tripletes de colágeno-motivo. dominios, CBD. Los CBD ubicados en el más alto de digestión ligeramente diferente al de su
speci fi ciudad es para Gly-Pro- el extremo C-terminal de la proteína son X y Gly-X-Hyp, que son muy colagenasa acompañante, ColH. Aflojamiento
capaz de identificar la triple hélice de previo del ECM por escisión ColH de estos
característica del colágeno [ 85 ]. Sus Moléculas de colágeno. La peptidasa
Los sustratos ECM conocidos incluyen: El sitio activo juega un papel crucial en, no fi Las moléculas brillar pueden permitir el acceso de
Colágeno tipos I, III, V [ 41 , 86 ]. solo escindiendo el especi fi c péptidos, pero también ColG a los componentes para los que es mejor fi tted
reconociéndolos [ 85 ]. A la derecha hay una para escindir, como el colágeno tipo V [ 41 ].
representación de cinta [ 87 ]. A la izquierda está la
estructura de dominio de C1
[ 63 ].
Colagenasa Clostridium Me gusta C1, preferentemente escinde los enlaces Zn-metaloproteasa (155 kDa) Como lo muestra Fujio, C2 parece ser un importante fi
H (ColH, histolyticum N-terminales de los residuos Gly dentro de los típicos que contiene un sitio de unión de colágeno. Me gusta C1, su primer paso en la degradación de la ECM
C2) tripletes de motivos de colágeno. El más alto speci fi city
CBD, que reconoce el colágeno ' s triple hélice, está pancreática. Posiblemente, debido a su mayor af fi nidad
es para Gly-ProX y Gly-X-Hyp, que son muy presente en el extremo C-terminal y, de manera similar, para el colágeno tipo III y un patrón distinto de
característicos del colágeno [ 85 ]. Sus sustratos ECM el sitio activo de la peptidasa juega un papel en su especi fi digestión en comparación con C1 [ 41 ], parece ser
conocidos incluyen: ciudad. A la derecha hay una representación de cinta [ 87 ]. más adecuado para la degradación inicial del ECM,
A la izquierda está la estructura de dominio de C2 [ 63 ]. lo que permite una mayor degradación con la
Colágeno tipos I, II, III [ 41 ] posterior

adición de otras enzimas.

Neutral Clostridium Similar a la termolisina, Zn-metaloproteasa (32 kDa) Los residuos de His en las posiciones Como otras proteasas neutras, se cree que los estudios 364 y 368
proteasa histolyticum preferentemente escinde N-terminal son los sitios de unión para Zn, han demostrado que NP parece ser un
(NOTARIO PÚBLICO) enlaces de residuos hidrófobos y voluminosos mientras que se cree que Glu365 es el sitio catalítico [ 88 ]. No complemento eficaz para el ya
y residuos de Tyr, La representación de la cinta estaba disponible para esta enzima. Combinación probada de aislamiento de islotes ColG
dependiendo del residuo adyacente [ 88 ]. Sus / ColH. Debido a su capacidad para degradar Fn y
sustratos ECM conocidos incluyen: Colágeno tipo I, Ln, puede ser esencial para degradar la membrana
Ln [ 88 , 89 ]. basal. Aunque tiene una tasa de reacción más baja
que su contraparte popular, TL, esto puede deberse
a su naturaleza menos agresiva, lo que lo hace ideal
para preservar la función de los islotes durante el
aislamiento [ 89 , 90 ].

Termolisina Bacilo Escinde preferentemente N-terminal Térmicamente estable, zinc enrollado Debido a sus amplias capacidades de unión, TL
(TL) thermoproteolyticus enlaces de residuos hidrofóbicos con metaloproteasa (35 kDa) con alto puede ayudar a ColH y ColG a degradar los tipos de
lado más grande [ 91 ]. Su ECM conocido cantidad de tirosina, serina, colágeno I y II al mismo tiempo que degrada los
los sustratos incluyen: Tipo de colágeno I, treonina y residuos hidrofóbicos componentes clave de la membrana basal:
II, III, IV, Fn, Ln, elastina [ 89 , 92 mi 97 ]. [ 98 ]. Contribuyen cuatro átomos de calcio colágeno de tipo IV, Fn y Ln [ 102 ]. Aunque esta
a la estabilidad de la proteína [ 99 ]. La proteína tiene amplia especi fi ciudad ayuda a aumentar el
dos dominios, con His, Asp, Glu, Tyr y Arg que rendimiento durante el aislamiento de los islotes,
residen en el sitio activo [ 100 ]. A la derecha está la también puede causar un mayor daño a las células,
representación de la cinta [ 101 ]. disminuyendo su función [ 89 ]. Al igual que otras
proteasas neutras, su capacidad para degradar
eficazmente componentes clave de la membrana
Proteasa BP Bacillus polymyxa Escinde los enlaces N-terminales de los Zn-metaloproteasa (30 kDa) [ 106 ] compuesto por basal podría hacer [ 104 , 105 ] es un complemento
residuos hidrófobos [ 103 ]. Sus sustratos ECM dos dominios con una central un- hélice que muy eficaz para
conocidos incluyen: contiene varios de los residuos que ayudan en la
Tipos de colágeno I, IV, VII, Fn, En catálisis. La presencia de cuatro átomos de calcio
[ 104 , 105 ]. estabiliza la molécula. A la derecha está la
representación de la cinta [ 107 ]. Cisteína proteasa mezclas de colagenasa utilizadas para aislar islotes
heterodimérica pancreáticos.
Clostripain Clostridium Speci fi city es similar a la de la tripsina, aunque Debido a su capacidad de activación de elastasa y TLA,
(CP) histolyticum preferentemente escinde los enlaces con propiedades amidasa y esterasa. que consta de la CP parece ser una muy buena herramienta adicional
C-terminales de Arg. residuos [ 108 ]. También una cadena pesada (43 kDa) y una cadena ligera (15 en la mezcla estándar de enzimas de aislamiento de
contiene actividad similar a tríptico, TLA. Como kDa) [ 109 ]. Bajo un- contenido helicoidal. El 25% de islotes. Aunque se ha demostrado que un TLA alto
cisteína proteasa, también debería poseer algo los aminoácidos son ácidos. Asp229 es responsable degrada las colagenasas necesarias para la
de activación de elastasa. de Arg. especi fi ciudad. Se requiere calcio para la degradación de la ECM, estudios anteriores
activación automática. El sitio de la actividad demostraron que una cantidad precisa de CP puede
capacidades [ 63 ]. Sus sustratos ECM catalítica de la peptidasa es His176 [ 110 ]. [ 111 ] mejorar el aislamiento de los islotes [ 89 , 112 ].
conocidos incluyen: Ln [ 89 ]

importancia de intacto C1 colagenasa que es necesaria para el éxito del aislamiento y el trasplante
de islotes humanos [ 71 ].
Curiosamente, también se ha demostrado que la administración no simultánea de las mismas
enzimas mejora los resultados del aislamiento [ 72 ]. Brandhorst y col. realizó análisis detallados de la
actividad enzimática para los lotes de enzimas actuales [ 57 ]. El grupo determinó que el TLA alto es
un parámetro clave para el ef fi cacia de las enzimas de disociación pancreática. Con el fin de
identificar combinaciones de enzimas adecuadas, también evaluamos muchos productos de enzimas
diferentes que contienen diferentes niveles de colagenasas intactas o truncadas, utilizadas en
combinación con termolisina o proteasa neutra. Incorporamos el análisis bioquímico de las enzimas
colagenasa como parte de nuestros criterios de evaluación y

Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166
identi fi ed una nueva mezcla que contiene intacto C1 / C2 colagenasa y proteasa neutra, ambas de C.
histolyticum, y lo llamó la nueva mezcla de enzimas (NEM). Los aislamientos con nuestro NEM
fueron considerablemente más efectivos que cualquier otra combinación de enzimas, recuperando
consistentemente altos rendimientos de islotes de calidad de páncreas humanos [ 71 ]. Además, los
autotrasplantes clínicos y los alotrasplantes con islotes aislados de la NEM lograron un mayor éxito
que los trasplantes anteriores [ 73 ]. Durante este curso de estandarización enzimática, Roche
presentó Liberase MTF, una nueva preparación de puri fi ed colagenasa y puri fi termolisina ed. Análisis
de HPLC con fi rmed que su producto tenía intacto C1 colagenasa. Esta enzima se ha utilizado con
éxito para aislamientos clínicos de islotes [ 74 , 75 ]. Como se mencionó anteriormente, se han
implementado tres combinaciones de enzimas diferentes (de Serva, Vitacyte y Roche) para
preparaciones clínicas. Aunque todas estas enzimas se utilizaron con éxito para procesar
aislamientos clínicos, solo un promedio del 50% produjo suficiente fi-
número de islotes para trasplante [ 66 ]. A pesar de la utilización exitosa de combinaciones de enzimas
de diferentes proveedores de enzimas para aislar islotes humanos destinados al trasplante clínico de
islotes, uno de los desafíos persistentes que requiere atención inmediata es la variabilidad en el
rendimiento de los islotes. Varios factores contribuyen a esta variabilidad. Aún no se ha determinado
el número total de islotes dentro del páncreas completo. Se requiere una mayor optimización del tipo
o dosis de enzima y una mejor comprensión de la ECM del páncreas humano para mejorar el
rendimiento de los islotes.
1.3. Enzimas de disociación de tejidos: nuevos desarrollos
Enzimas recombinantes para el aislamiento de islotes humanos: Fabricación puri fi Las
colagenasas recombinantes ed pueden superar los problemas que se encuentran comúnmente con
puri fi ed colagenasa natural. La colagenasa recombinante de clase I (rC1) y clase II (rC2) se expresa
a partir de genes individuales en el Escherichia coli cepa que contiene baja actividad proteasa. Esto
minimiza la proteólisis de las enzimas colagenasa, lo que conduce a la generación de enzimas rC1 y
rC2 intactas. Se elimina la contaminación por clostripaína, mejorando el control de la actividad de la
proteasa durante el procedimiento de aislamiento del islote.
En nuestro estudio anterior [ 29 ], utilizamos puri con éxito fi ed recombinante rC1 y rC2 y evaluó 4
formulaciones de colagenasa diferentes para recuperar islotes de páncreas humanos (n ¼ 12, 3 por
grupo). Cantidades variables de actividad colagenasa rC1 y rC2, complementadas con un fi Se ensayó
una cantidad fija de actividad de P. polymyxa NP (BPProtease [VitaCyte LLC, Indianapolis, IN], un
NP equivalente a dispasa) usando un experimento diseñado estadísticamente en un modelo de dos
páncreas divididos. Observamos que la mezcla de enzimas colagenasa-proteasa en dosis bajas
(mezcla de enzimas colagenasa recombinante [RCEM], 100 000 CDA U, 12 WU / g de tejido, en
combinación con 23 400 U de BP-Proteasa / g de tejido) digirió el páncreas y recuperó islotes tan
eficazmente como las otras 3 mezclas de enzimas que contenían una masa de 1,38 a 1,79 veces
mayor de enzimas colagenasa recombinantes por g de tejido. Estos RCEM contenían alrededor del
42% mi 75% de la masa de puri fi ed colagenasa natural comúnmente utilizada para digerir un páncreas
de 100 g. La colagenasa recombinante es un sustituto eficaz de la enzima natural cuando se utiliza
para el aislamiento de islotes humanos. Se utilizó con éxito una colagenasa recombinante de dosis
más baja en combinación con proteasa BP para recuperar más de 5000 IEQ / g de páncreas. Los
resultados de este estudio indican la efectividad de esta mezcla de enzimas sin animales para
recuperar islotes a dosis de colagenasa que son aproximadamente el 50% de las que se usan
comúnmente para el aislamiento de islotes humanos.
En nuestro estudio seminal [ 1 ] utilizamos una dosis baja de RCEM (12 WU / g) para aislar con
éxito los islotes, con buena funcionalidad, de todo el páncreas humano. Estos resultados, en
comparación con el aislamiento de islotes realizado utilizando una mezcla de enzima colagenasa
natural (mezcla 60: 40C1: C2 que contiene aproximadamente 530 mg de colagenasa para digerir 100
g de
Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
163
páncreas) (NCEM) con equivalente (12 WU / g) o estándar (20 WU /
g) cantidades, demostró una mejor recuperación de los islotes, digestión de tejidos ef fi deficiencia,
secreción de insulina y resultados del trasplante. Este es el fi primer informe que indica que la
funcionalidad de los islotes se puede mejorar con enzima en dosis bajas. En general, las
evaluaciones de calidad y funcionalidad sugieren que esta dosis de RCEM tiene potencial para
usarse en aislamientos de islotes humanos para mejorar los resultados clínicos.
Los resultados resumidos aquí sugieren fuertemente que las colagenasas recombinantes
poseen una superioridad intrínseca a las colagenasas derivadas naturalmente, pero la bioquímica
responsable de esto aún no se ha identificado. fi ed. Esta mejora está alineada con los desafíos
regulatorios en evolución que probablemente demandarán el uso de origen animal. mi materiales
gratuitos en el proceso de aislamiento de islotes y consideraciones económicas con respecto a la
rentabilidad del trasplante de islotes que justi fi es reembolso por terceros pagadores.
Mezclas de enzimas para el aislamiento de islotes pancreáticos de donantes jóvenes: Los islotes
aislados de páncreas de donante joven (YDP) permanecieron desmantelados e incrustados por
células acinares circundantes ( Figura 1 C) resultando en pellets de gran tamaño ( Figura 1 D) después
de la digestión enzimática del páncreas [ 76 ]. Aunque la capa circundante de células acinares puede
proteger la integridad de los islotes [ 77 ], los islotes cubiertos a menudo se pierden durante el puri fi proceso
catiónico [ 78 ]. La liberación de islotes con manto de páncreas YDP probablemente se deba a la
composición de la ECM. Aceptando esta suposición, un enfoque para reducir el porcentaje de islotes
con manto de donantes jóvenes es modificar la composición de las mezclas de enzimas
colagenasa-proteasa utilizadas para liberar las células de la MEC.
Varios estudios han intentado mejorar la morfología de los islotes y puri fi catión de YDP [ 76 , 78 mi 82
] con un éxito limitado. Sin embargo, lograr una alta recuperación de los islotes después del
aislamiento de los islotes de YDP sigue siendo un desafío. En nuestro estudio reciente, identificamos fi
ed el papel único de la proteasa para digerir las proteínas ECM peri-islotes para recuperar islotes
libres de manto de páncreas de donantes jóvenes. Desarrollamos un enfoque novedoso para este
problema utilizando un " trisecado " modelo de páncreas para comparar la eficacia de diferentes
mezclas de enzimas para reducir el porcentaje de islotes con manto recuperados de YDP. Cada
páncreas se dividió en tres lóbulos: la cabeza, el cuerpo y la cola. Se evaluaron tres mezclas de
enzimas diferentes dentro de un solo páncreas, y cada lóbulo recibió una de las tres mezclas de
enzimas. Los lóbulos se alteraron entre experimentos para minimizar el sesgo anatómico. La
aplicación de esta nueva metodología mostró que el aumento de la dosis de proteasa era la variable
crítica para aumentar la liberación de islotes sin manto y mejorar los rendimientos de los islotes de
YDP. Estos resultados fueron más con fi Se confirmó cuando se realizaron 13 aislamientos
consecutivos de islotes de páncreas completos de YDP utilizando mezclas de enzimas proteasas con
aumento de colagenasa de 3 proveedores diferentes (SERVA, Roche y VitaCyte). Los resultados de
este estudio tienen inmensos beneficios clínicos fi ts; la utilización de YDP aumenta el número de
donantes aceptables para el trasplante de alo-islotes y, según informes anteriores [ 82 , 83 ], podría
mejorar los resultados clínicos [ 1 ].
Enzimas para el aislamiento de islotes de investigación: Puri fi La formulación de enzima ed está
disponible para el aislamiento clínico de islotes y ahora la utilizan muchos centros, incluidos los del
consorcio Clinical Islet Transplantation. Estos altamente puri fi La enzima colagenasa y las proteasas
ed son fabricadas por empresas conocidas como SERVA, Roche y VitaCyte, y se proporcionan en
viales separados como se describe en la sección anterior.
Además del uso clínico, los islotes humanos se aíslan rutinariamente de páncreas de donantes
con muerte cerebral ( Figura 1 A) para diversos estudios de investigación. Actualmente, la mayoría de
estos laboratorios tienden a utilizar el ya mencionado altamente puri fi mezclas de enzimas ed para
aislar islotes de páncreas de investigación. El principal inconveniente de utilizar estas mezclas de
enzimas para la preparación de la investigación es que el costo puede ser prohibitivo. Al mismo
tiempo, las enzimas brutas disponibles de Sigma y Worthington se han utilizado para aislamientos de
islotes pancreáticos tanto en humanos como en otros animales, pero no han ganado
164 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166
aplicación generalizada debido a factores tales como efectos de baja digestión fi cacia relacionada con
la impureza enzimática, combinación desequilibrada de componentes activos clave, signi fi No hay
variación enzimática de lote a lote y vial a vial y niveles altos de endotoxina.
Los lotes de colagenasa cruda son inherentemente variables, ya que son fl ect la composición
bioquímica única de su fuente, C. histolyticum los sobrenadantes de cultivo y las enzimas activas
responsables de la liberación celular de los tejidos, colagenasa y proteasa neutra, comprenden solo 3 mi
[7] Keck FS, Pfeiffer EF. los fi primera diabetes mellitus experimental. Acta Diabetol
8% de su peso seco. El resto del peso seco es biopigmento, otras actividades enzimáticas, unde fi contaminantes
nidos y endotoxinas. Esta variabilidad bioquímica entre diferentes lotes de un mismo producto lo
hace muy difícil. fi culto para aplicar colagenasa cruda ya sea para la investigación humana o para
preparaciones clínicas de islotes.
En nuestro estudio reciente [113] , un nuevo producto de colagenasa enriquecido
de VitaCyte se utilizó con éxito para mejorar el proceso de aislamiento de islotes, centrándose
principalmente en el páncreas de investigación. Este producto de colagenasa enriquecida con DE
800 (> 85% de pureza) que contiene principalmente clase I (C1) y clase II (C2) intactas C. histolyticum
colagenasa, en una relación C1: C2 de z 75:25, y con mínima contaminación por clostripaína. En
cada vial un fi Estaba presente una dosis fija de 800 unidades Wunsch. Además, un puri fi ed Dispase ™
Se añadió enzima equivalente a 19.000 mi 48.000 o 32.500 mi 78.800 proteasa neutra U (NP U) por g
de tejido, y en lo sucesivo denominadas mezclas de enzimas de proteasa baja o alta. Este nuevo
producto fue probado en tres centros de procesamiento de islotes diferentes para con fi rm el ef fi cacia
de colagenasa enriquecida de bajo costo en el rendimiento y las funciones de los islotes. El uso de
productos de colagenasa enriquecidos de bajo costo con características bioquímicas comparables a
puri fi Se demostró que las enzimas colagenasa ed son tan eficaces en el aislamiento de islotes
humanos como los productos de mayor precio.
2. Conclusiones
El colágeno es la proteína más abundante en el páncreas humano. La variabilidad en el
páncreas de donantes humanos se puede atribuir a factores genéticos y ambientales. El análisis
crítico de cómo los TDE pueden actuar sobre sustratos de tejido nuevos y conocidos presentes
dentro del ECM para una mejor disociación del tejido también es igualmente crítico. Esto podría
facilitar la mejora de los rendimientos de los islotes y también promover las terapias celulares y
moleculares asociadas con el trasplante clínico de islotes [ 2 , 84 ]. Es necesaria una evaluación
adicional para optimizar las diferentes dosis y combinaciones de enzimas para maximizar los
rendimientos de los islotes para los trasplantes clínicos. Una mezcla de enzimas que las
instalaciones centrales de los islotes en todo el mundo puedan utilizar como una mezcla de consenso
sería ideal, convirtiéndose en uno de los objetivos finales dentro de la investigación clínica de los
islotes que requiere la colaboración entre los centros de los islotes y las instalaciones principales, las
empresas de enzimas y los médicos.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Fondo para la Excelencia de la Herencia Judía por brindar un apoyo
generoso a nuestro programa. Los autores también agradecen sinceramente a Kentucky Organ
Donor Af fi sirve para un suministro constante de páncreas de donantes. Un agradecimiento especial
al Dr. Siddharth Narayanan por editar y corregir el manuscrito.
Referencias
[1] Loganathan G, Subhashree V, Narayanan S, Tweed B, Andrew Goedde M, Gunaratnam B, et al.
Recuperación mejorada de islotes humanos de páncreas de donantes jóvenes utilizando una mayor dosis de
proteasa a colagenasa para digerir la matriz extracelular peri-islote. Am J Transplant: Offc J Am Soc
Transplant Am Soc Transplant Surg 2019; 19 (3): 831 mi 43 .
[2] Narayanan S, Loganathan G, Dhanasekaran M, Tucker W, Patel A, Subhashree V, et al. Interferencia entre
células endoteliales y células beta: implicación para el trasplante de células de los islotes. Trasplante
Mundial J 2017; 7 (2): 117 mi 28 .
Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
[3] Watanabe T, Yaegashi H, Koizumi M, Toyota T, Takahashi T.
contribución de los islotes en el páncreas humano en desarrollo: un estudio de reconstrucción tridimensional
asistido por computadora. Páncreas 1999; 18 (4): 349 mi 54 .
[4] Holt RCC, Flyvbjerg A, Goldstein B. Libro de texto de diabetes. cuarta ed. Wiley-
Blackwell; 2010 .
[5] Allan FN. Los escritos de Thomas Willis, MD; diabetes trescientos años
hace. Diabetes 1953; 2 (1): 74 mi 7 .
[6] Sakula A. Paul Langerhans (1847-1888): homenaje al centenario. JR Soc Med
1988; 81 (7): 414 mi 5 .
Lat 1989; 26 (1): 79 mi 81 .
[8] Needham J, editor. La química de la vida - conferencias sobre la historia de
bioquímica. Prensa de la Universidad de Cambridge; 1970 .
[9] Spires RM, Cross SE, Brown HL, Bateman PA, Vaughan RH, Hughes SJ, et al.
Desarrollo de un ensayo in vitro sencillo para evaluar la digestión de la matriz extracelular del páncreas
humano mediante mezclas de enzimas colagenasa. Trasplante de células 2018; 27 (7): 1039 mi 46 .
[10] Banting FG, Campbell WR, Fletcher AA. Más experiencia clínica con insulina (extractos pancreáticos) en el
tratamiento de la diabetes mellitus. Br Med J 1923; 1 (3236): 8 mi 12 .
[11] King H, Aubert RE, Herman WH. Carga mundial de diabetes, 1995-2025: prevalencia, estimaciones
numéricas y proyecciones. Diabetes Care 1998; 21 (9): 1414 mi 31 .
[12] Asociación AD. Diagnóstico y clasificación fi catión de la diabetes mellitus. Diabetes Care 2014; 37 (Suppl 1):
S81 mi 90 .
[13] Kono T. Puri fi catión y caracterización parcial de enzimas colagenolíticas de Clostridium histolyticum.
Bioquímica 1968; 7 (3): 1106 mi 14 .
[14] Informe del comité de expertos en diagnóstico y clasi fi catión de la diabetes mellitus. Diabetes Care 2003; 26
(Suppl 1): S5 mi 20 .
[15] Howard RB, Christensen AK, Gibbs FA, Pesch LA. La preparación enzimática de células parenquimatosas
intactas aisladas de hígado de rata. J Cell Biol 1967; 35 (3): 675 mi 84 .
[dieciséis] Manning WK, Bonner Jr WM. Aislamiento y cultivo de condrocitos de cartílago articular adulto humano.
Artritis Rheum 1967; 10 (3): 235 mi 9 .
[17] Moustafa E, Skomedal T, Osnes JB, Oye I.Formación de AMP cíclico y morfología de células miocárdicas
aisladas de corazón adulto: efecto del Ca2 þ y Mg2 þ. Biochim Biophys Acta 1976; 421 (2): 411 mi 5 .
[18] Rodbell M. Localización de la lipoproteína lipasa en células grasas del tejido adiposo de rata. J Biol Chem 1964;
239: 753 mi 5 .
[19] Fedarko NS, Termine JD, Young MF, Robey PG. Regulación temporal del metabolismo de hialuronanos y
proteoglicanos por células óseas humanas in vitro. J Biol Chem 1990; 265 (21): 12200 mi 9 .
[20] Introducción: estándares de atención médica en diabetes-2018. Diabetes Care 2018; 41 (Suppl 1): S1 mi 2 .
[21] Hardt PD, Brendel MD, Kloer HU, Bretzel RG. ¿La diabetes pancreática (diabetes tipo 3c) está
infradiagnosticada y mal diagnosticada? Diabetes Care 2008; 31 (Supl.
2): S165 mi 9 .
[22] Moran A, Brunzell C, Cohen RC, Katz M, Marshall BC, Onady G, et al. Pautas de atención clínica para
quísticos fi Diabetes relacionada con la brosis: declaración de posición de la Asociación Estadounidense de
Diabetes y guía de práctica clínica de la Fundación de Fibrosis Quística, respaldada por la Sociedad
Endocrina Pediátrica. Diabetes Care 2010; 33 (12): 2697 mi 708 .
[23] Rickels MR, Bellin M, Toledo FG, Robertson RP, Andersen DK, Chari ST, et al. Detección, evaluación y
tratamiento de la diabetes mellitus en la pancreatitis crónica: recomendaciones de PancreasFest 2012.
Pancreatology 2013; 13 (4): 336 mi 42 .
[24] Ricordi C, Carroll P, Tzakis A, Zeng Y, Rilo HL, Alejandro R, et al. Resultado del aislamiento y alotrasplante
de islotes humanos en 20 casos consecutivos. Diabetes Nutr Metabol 1992; 5 (Suppl 1): 193 mi 8 .
[25] Linetsky E, Bottino R, Lehmann R, Alejandro R, Inverardi L, Ricordi C. Mejor aislamiento de islotes humanos
utilizando una nueva mezcla de enzimas. Liberase. Diabetes. 1997; 46 (7): 1120 mi 3 .
[26] Daneman D. Mortalidad relacionada con la diabetes. Un pediatra ' s vista. Diabetes Care 2001; 24 (5): 801 mi 2 .
[27] Danaei G, Lawes CM, Vander Hoorn S, Murray CJ, Ezzati M. Mortalidad global y regional por cardiopatía
isquémica y accidente cerebrovascular atribuible a una concentración de glucosa en sangre superior a la
óptima: evaluación comparativa del riesgo. Lancet 2006; 368 (9548): 1651 mi 9 .
[28] Kin T, Zhai X, O ' Gorman D, Shapiro AM. Efecto perjudicial del exceso de colagenasa de clase II sobre el
resultado del aislamiento de islotes humanos. Transpl Int: Offc J Eur Soc Organ Transplant 2008; 21 (11): 1059 mi sesenta
y cinco .
[29] Balamurugan An GM, Breite AG, Loganathan G, Wilhelm JJ, Tweed B, Vargova L, Lockridge A, Kuriti M,
Hughes MG, Williams SK, Hering BJ, Dwulet F, McCarthy RC. Identificar dianas de actividad enzimática
eficaces para la colagenasa recombinante de clase I y clase II para el aislamiento exitoso de islotes
humanos. Transplantation Direct; 2015 .
[30] Richard Mayne REB, editor. Estructura y función de los tipos de colágeno. Prensa académica; 1987 .
[31] Alan J, Barrett NDR, Fred Woessner J, editores. Manual de enzimas proteolíticas. segunda ed. Elsevier Ltd;
2004 .
[32] Peterkofsky B. [21] colagenasa bacteriana. Métodos de enzimología, vol.82. Prensa académica; 1982. p. 453 mi
71 .
[33] Matsushita O, Jung CM, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. Duplicación de genes y multiplicidad
de colagenasas en Clostridium histolyticum. J Bacteriol 1999; 181 (3): 923 mi 33 .
 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166
[34] Mookhtiar KA, Van Wart HE. Colagenasas de Clostridium histolyticum: una nueva mirada a algunas enzimas
antiguas. Matrix 1992; 1: 116 mi 26 (Stuttgart, Alemania) Suplemento .
[35] Francés MF, Mookhtiar KA, Van Wart HE. Proteólisis limitada del colágeno tipo I en sitios hiperreactivos por
colagenasas de Clostridium histolyticum de clase I y II: patrones de digestión complementarios. Bioquímica
1987; 26 (3): 681 mi 7 .
[36] Bond MD, Van Wart HE. Caracterización de las colagenasas individuales de Clostridium histolyticum.
Bioquímica 1984; 23 (13): 3085 mi 91 .
[37] Bertuzzi F, Cainarca S, Marzorati S, Bachi A, Antonioli B, Nano R, et al. Isoformas de colagenasa para la
digestión del páncreas. Trasplante celular 2009; 18 (2): 203 mi 6 .
[38] Bond MD, Van Wart HE. Relación entre las colagenasas individuales de Clostridium histolyticum: evidencia
de evolución por duplicación de genes. Bioquímica 1984; 23 (13): 3092 mi 9 .
[39] Brandhorst H, Raemsch-Guenther N, Raemsch C, Friedrich O, Huettler S, Kurfuerst M, et al. La relación
entre colagenasa clase I y clase II en
fl influye en el ef fi ciente liberación de islotes del páncreas de rata. Trasplante 2008; 85 (3): 456 mi 61 .
[40] Wolters GH, Vos-Scheperkeuter GH, Lin HC, van Schilfgaarde R. Diferentes roles de colagenasa de
Clostridium histolyticum de clase I y clase II en el aislamiento de islotes pancreáticos de rata. Diabetes 1995;
44 (2): 227 mi 33 .
[41] Fujio A, Murayama K, Yamagata Y, Watanabe K, Imura T, Inagaki A, et al. La colagenasa H es crucial para el
aislamiento de islotes pancreáticos de rata. Trasplante de células 2014; 23 (10): 1187 mi 98 .
[42] Barnett MJ, Zhai X, LeGatt DF, Cheng SB, Shapiro AM, Lakey JR. Evaluación cuantitativa de mezclas de
colagenasa para el aislamiento de islotes humanos. Trasplante 2005; 80 (6): 723 mi 8 .
[43] Bucher P, Bosco D, Mathe Z, Matthey-Doret D, Andres A, Kurfuerst M, et al. Optimización de la relación de
actividad de proteasa neutra a colagenasa para el aislamiento del islote de Langerhans. Transplant Proc
2004; 36 (4): 1145 mi 6 .
[44] Al-Adra DP, Gill RS, Imes S, O ' Gorman D, Kin T, Axford SJ y col. Trasplante de islotes de donante único e
independencia de insulina a largo plazo en pacientes seleccionados con diabetes mellitus tipo 1. Trasplante
2014; 98 (9): 1007 mi 12 .
[45] Brandhorst H, Friberg A, Andersson HH, Felldin M, Foss A, Salmela K, et al. La importancia de la actividad
tríptica en puri fi mezclas de enzimas ed para ef fi aislamiento de islotes cient. Trasplante 2009; 87 (3): 370 mi 5 .
[46] Cryer PE, Davis SN, Shamoon H. Hipoglucemia en la diabetes. Diabetes Care 2003; 26 (6): 1902 mi 12 .
[47] Nathan DM, Genuth S, Lachin J, Cleary P, Crofford O, Davis M, et al. El efecto del tratamiento intensivo de la
diabetes sobre el desarrollo y la progresión de complicaciones a largo plazo en la diabetes mellitus
insulinodependiente. N Engl J Med 1993; 329 (14): 977 mi 86 .
[48] Banarer S, Cryer PE. Insuficiencia autónoma asociada a hipoglucemia relacionada con el sueño en la
diabetes tipo 1: reducción del despertar del sueño durante la hipoglucemia. Diabetes 2003; 52 (5): 1195 mi 203 .
[49] Geddes J, Schopman JE, Zammitt NN, Frier BM. Prevalencia de alteración del conocimiento de la
hipoglucemia en adultos con diabetes tipo 1. Diabet Medz: J Br Diabetic Assoc. 2008; 25 (4): 501 mi 4 .
[50] Awoniyi O, Rehman R, Dagogo-Jack S. Hipoglucemia en pacientes con diabetes tipo 1: epidemiología,
patogenia y prevención. Curr Diabetes Rep 2013; 13 (5): 669 mi 78 .
[51] Voulgari C, Pagoni S, Paximadas S, Vinik AI. "Fragilidad" en la diabetes: más fácil de hablar que de romper.
Diabetes Technol Therapeut 2012; 14 (9): 835 mi 48 .
[52] Kelly WD, Lillehei RC, Merkel FK, Idezuki Y, Goetz FC. Alotrasplante de páncreas y duodeno junto con el
riñón en la nefropatía diabética. Cirugía 1967; 61 (6): 827 mi 37 .
[53] Gruessner RW, Gruessner AC. El estado actual del trasplante de páncreas. Nat Rev Endocrinol 2013; 9 (9):
555 mi 62 .
[54] Dolensek J, Rupnik MS, Stozer A. Similitudes y diferencias estructurales entre el páncreas humano y de
ratón. Islotes 2015; 7 (1): e1024405 .
[55] Froud T, Ricordi C, Baidal DA, Ha fi z MM, Ponte G, Cure P, et al. Trasplante de islotes en diabetes mellitus
tipo 1 utilizando islotes cultivados e inmunosupresión libre de esteroides: experiencia en miami. Am J
Transplant: Offc J Am Soc Transplant Am Soc Transplant Surg 2005; 5 (8): 2037 mi 46 .
[56] Rickels MR, Fuller C, Dalton-Bakes C, Markmann E, Palanjian M, Cullison K, et al. Restauración de la
contrarregulación de la glucosa mediante el trasplante de islotes en la diabetes tipo 1 de larga duración.
Diabetes 2015; 64 (5): 1713 mi 8 .
[57] Shapiro AM, Ricordi C, Hering BJ, Auchincloss H, Lindblad R, Robertson RP, et al. Ensayo internacional del
protocolo de Edmonton para el trasplante de islotes. N Engl J Med 2006; 355 (13): 1318 mi 30 .
[58] Daly B, O ' Kelly K, Klassen D. Procedimientos intervencionistas en trasplante de páncreas de células de los
islotes y órganos completos. Semin Intervent Radiol 2004; 21 (4): 335 mi 43 .
[59] Williams PW. Notas sobre la diabetes tratada con extracto y mediante injertos de oveja ' s páncreas. Br Med J
1894; 2: 1303 mi 4 .
[60] Moskalewski S. Aislamiento y cultivo DE los islotes DE langerhans DEL conejillo de Indias. Gen Comp
Endocrinol 1965; 5: 342 mi 53 .
[61] Ballinger WF, Lacy PE. Trasplante de islotes pancreáticos intactos en ratas. Cirugía 1972; 72 (2): 175 mi 86 .
[62] Kemp CB, Knight MJ, Scharp DW, Lacy PE, Ballinger WF. Trasplante de islotes pancreáticos aislados en la
vena porta de ratas diabéticas. Naturaleza 1973; 244 (5416): 447 .
[63] McCarthy RC, Breite AG, Green ML, Dwulet FE. Enzimas de disociación de tejidos para el aislamiento de
islotes humanos para trasplantes: factores a considerar en el contexto
Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
165
Criterios de aceptación de enzimas. Trasplante 2011; 91 (2): 137 mi 45 .
[64] Alejandro R, Barton FB, Hering BJ, Wease S, Collaborative Islet Transplant Registry I. Actualización del
registro colaborativo de trasplantes de islotes. Trasplante 2008; 86 (12): 1783 mi 8. 2008 .
[sesenta yBrandhorst
cinco] H, Friberg A, Nilsson B, Andersson HH, Felldin M, Foss A y col. Comparación a gran escala de
Liberase HI y colagenasa NB1 utilizada para el aislamiento de islotes humanos. Trasplante de células 2010;
19 (1): 3 mi 8 .
[66] Balamurugan AN, Naziruddin B, Lockridge A, Tiwari M, Loganathan G, Takita M, et al. Características del
producto de islotes y factores relacionados con el éxito del trasplante de islotes humanos del Registro
Colaborativo de Trasplantes de Islotes (CITR) 1999-2010. Am J Transplant: Offc J Am Soc Transplant Am
Soc Transplant Surg 2014; 14 (11): 2595 mi 606 .
[67] Szot GL, Lee MR, Tavakol MM, Lang J, Dekovic F, Kerlan RK, et al. Aislamiento clínico exitoso de islotes
utilizando una colagenasa fabricada por GMP y una proteasa neutra. Trasplante 2009; 88 (6): 753 mi 6 .
[68] Anazawa T, Balamurugan AN, Bellin M, Zhang HJ, Matsumoto S, Yonekawa Y, et al. Aislamiento de islotes
humanos para trasplante autólogo: comparación de rendimiento y función utilizando enzimas SERVA /
Nordmark versus Roche. Am J Transplant: Offc J Am Soc Transplant Am Soc Transplant Surg 2009; 9 (10):
2383 mi 91 .
[69] Ricordi C, Tzakis AG, Carroll PB, Zeng YJ, Rilo HL, Alejandro R, et al. Aislamiento y alotrasplante de islotes
humanos en 22 casos consecutivos. Trasplante 1992; 53 (2): 407 mi 14 .
[70] Tzakis AG, Ricordi C, Alejandro R, Zeng Y, Fung JJ, Todo S, et al. Trasplante de islotes pancreáticos tras
exenteración abdominal superior y sustitución hepática. Lancet 1990; 336 (8712): 402 mi 5 .
[71] Balamurugan AN, Breite AG, Anazawa T, Loganathan G, Wilhelm JJ, Papas KK, et al. Aislamiento y
trasplante exitosos de islotes humanos que indican la importancia del ensayo de actividad de degradación
del colágeno y colagenasa de clase 1. Trasplante 2010; 89 (8): 954 mi 61 .
[72] Kin T, O ' Gorman D, Zhai X, Pawlick R, Imes S, Senior P, et al. Administración no simultánea de enzimas de
disociación del páncreas durante el aislamiento de islotes. Trasplante 2009; 87 (11): 1700 mi 5 .
[73] Balamurugan AN, Green ML, Breite AG, Loganathan G, Wilhelm JJ, Tweed B, et al. Identificar dianas de
actividad enzimática eficaces para la colagenasa recombinante de clase I y clase II para el aislamiento
exitoso de islotes humanos. Trasplante directo 2016; 2 (1): e54 .
[74] Caballero-Corbalan J, Friberg AS, Brandhorst H, Nilsson B, Andersson HH, Felldin M, et al. Vitacyte
collagenase HA: una nueva mezcla de enzimas para ef fi cient aislamiento de islotes humanos. Trasplante
2009; 88 (12): 1400 mi 2 .
[75] Qi M, Valiente L, McFadden B, Omori K, Bilbao S, Juan J, et al. La elección de la enzima para la digestión
del páncreas humano es un factor crítico para aumentar el éxito del aislamiento de los islotes. Transplant
Direct 2015; 1 (4) .
[76] Balamurugan AN, Chang Y, Bertera S, Sands A, Shankar V, Trucco M, et al. Idoneidad de los islotes
pancreáticos juveniles humanos para uso clínico. Diabetología 2006; 49 (8): 1845 mi 54 .
[77] Ricordi C, Alejandro R, Rilo HH, Carroll PB, Tzakis AG, Starzl TE, et al. Función in vivo a largo plazo de los
islotes del manto humano obtenida por disociación pancreática incompleta y puri fi catión. Transplant Proc
1995; 27 (6): 3382 .
[78] Ricordi C, Alejandro R, Zeng Y, Tzakis A, Casavilla A, Jaffe R, et al. Aislamiento de islotes humanos y puri fi catión
de donantes en edad pediátrica. Transplant Proc 1991; 23 (1 Pt 1): 783 mi 4 .
[79] Socci C, Davalli AM, Vignali A, Pontiroli AE, Maf fi P, Magistretti P, y col. Un signi fi No se puede aumentar el
rendimiento de los islotes mediante la inyección temprana de colagenasa en el conducto pancreático de donantes
jóvenes. Trasplante 1993; 55 (3): 661 mi 3 .
[80] Miki A, Ricordi C, Messinger S, Yamamoto T, Mita A, Barker S, et al. Hacia la mejora del aislamiento de los
islotes humanos de los donantes más jóvenes: rescate puri fi cation es ef fi cient para islotes atrapados. Trasplante
de células 2009; 18 (1): 13 mi 22 .
[81] Shimoda M, Noguchi H, Naziruddin B, Fujita Y, Chujo D, Takita M, et al. Método mejorado de aislamiento de
islotes humanos para donantes jóvenes. Transplant Proc 2010; 42 (6): 2024 mi 6 .
[82] Meier RP, Sert I, Morel P, Muller YD, Borot S, Badet L, et al. Aislamiento del islote de Langerhans de
páncreas de donantes pediátricos y juveniles. Transpl Int: Offc J Eur Soc Organ Transplant 2014; 27 (9): 949 mi
55 .
[83] Ihm SH, Matsumoto I, Sawada T, Nakano M, Zhang HJ, Ansite JD, et al. Efecto de la edad del donante sobre
la función de islotes humanos aislados. Diabetes 2006; 55 (5): 1361 mi 8 .
[84] Jawahar AP, Narayanan S, Loganathan G, Pradeep J, Vitale GC, Jones CM, et al. Reprogramación de células
ductales a células similares a beta productoras de insulina como una fuente potencial de reemplazo de células beta
para la pancreatitis crónica. Curr Stem Cell Res Ther 2019; 14 (1): 65 mi 74 .
[85] Eckhard U, Huesgen PF, Brandstetter H, CM general. Especificación de proteasa proteómica fi ciudad pro fi La
presencia de colagenasas clostridiales revela su naturaleza intrínseca como degradadores dedicados del
colágeno. J Proteom 2014; 100: 102 mi 14 .
[86] Shima H, Inagaki A, Imura T, Yamagata Y, Watanabe K, Igarashi K, et al. El colágeno V es un sustrato
potencial para la colagenasa G clostridial en el aislamiento de islotes pancreáticos. J Diabetes Res 2016;
2016. 4396756 .
[87] Eckhard U, Schonauer E, Brandstetter H. Base estructural para la regulación de la actividad y la preferencia
de sustrato de las colagenasas clostridiales G, H y T. J Biol Chem 2013; 288 (28): 20184 mi 94 .
[88] Maeda H, Nakagawa K, Murayama K, Goto M, Watanabe K, Takeuchi M, et al. Clonación de una proteasa
neutra de Clostridium histolyticum, determinando su sustrato speci fi ciudad, y diseñando una especi fi c
sustrato. Appl Microbiol Biotechnol 2015; 99 (24): 10489 mi 99 .
[89] Dendo M, Maeda H, Yamagata Y, Murayama K, Watanabe K, Imura T, et al.
166 G. Loganathan y col. / Diabetes y síndrome metabólico: investigaciones clínicas y revisiones 14 (2020) 159 mi 166
Efecto sinérgico de la proteasa neutra y la clostripaína en el aislamiento de islotes pancreáticos de rata.
Trasplante 2015; 99 (7): 1349 mi 55 .
[90] Balamurugan AN, Loganathan G, Bellin MD, Wilhelm JJ, Harmon J, Anazawa T, et al. Una nueva mezcla de
enzimas para aumentar el rendimiento y la tasa de trasplante de productos de islotes humanos autólogos y
alogénicos. Trasplante 2012; 93 (7): 693 mi 702 .
[91] Matsubara H, Sasaki R, Cantante A, Jukes TH. Speci fi c naturaleza de la hidrólisis de la insulina y la proteína
del virus del mosaico del tabaco por termolisina. Arch Biochem Biophys 1966; 115 (2): 324 mi 31 .
[92] Hoffmann C, Leroy-Dudal J, Patel S, Gallet O, Pauthe E. Plasma humano marcado con isotiocianato de
fluoresceína fi bronectina en la remodelación de la matriz extracelular. Anal Biochem 2008; 372 (1): 62 mi 71 .
[93] Dziadek M, Clements R, Mitrangas K, Reiter H, Fowler K.Análisis de la degradación del nidogen de la
proteína de la membrana basal, utilizando un speci fi c anticuerpo monoclonal. Eur J Biochem 1988; 172 (1):
219 mi 25 .
[94] Lauer-Fields JL, Minond D, Sritharan T, Kashiwagi M, Nagase H, Fields GB. La conformación del sustrato
modula la agrecanasa (ADAMTS-4) af fi nidad y especificación de secuencia fi ciudad. Sugerencia de una
especificación topológica común fi ciudad de proteasas funcionalmente diversas. J Biol Chem 2007; 282 (1):
142 mi 50 .
[95] Birkedal-Hansen H, Taylor RE, Bhown AS, Katz J, Lin HY, Wells BR. Escisión del colágeno de piel bovina
tipo III por enzimas proteolíticas. Resistencia relativa del fi forma brillar. J Biol Chem 1985; 260 (30): 16411 mi 7 .
[96] Morihara K, Tsuzuki H. Propiedades elastolíticas de diversas proteinasas de origen microbiano. Arch
Biochem Biophys 1967; 120 (1): 68 mi 78 .
[97] Mainardi CL, Hasty DL, Seyer JM, Kang AH. Speci fi c Escisión del colágeno de tipo III humano por elastasa
de leucocitos polimorfonucleares humanos. J Biol Chem 1980; 255 (24): 12006 mi 10 .
[98] Ohta Y, Ogura Y, Wada A. Proteasa termoestable de bacterias termofílicas.
I. Termostabilidad, propiedades fisicoquímicas y composición de aminoácidos. J Biol Chem 1966; 241 (24):
5919 mi 25 .
[99] Matthews BW, Weaver LH, Kester WR. La conformación de la termolisina. J Biol Chem 1974; 249 (24): 8030 mi
44 .
[100] Burstein Y, Walsh KA, Neurath H. Evidencia de un residuo de histidina esencial en termolisina. Bioquímica
1974; 13 (1): 205 mi 10 .
Descargado para María Fernanda Virú Nieto ( maria.viru@urp.com ) en Ricardo Palma University de ClinicalKey.es por Elsevier en septiembre 29, 2020.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorización. Copyright © 2020. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
[101] Inglés AC, Groom CR, Hubbard RE. Mapeo experimental y computacional de la superficie de unión de una
proteína cristalina. Proteína Eng 2001; 14 (1): 47 mi 59 .
[102] Yurchenco PD. Membranas basales: andamios celulares y plataformas de señalización. Cold Spring Harbor
Perspect Biol. 2011; 3 (2) .
[103] Grif fi n PJ, Fogarty WM. Propiedades fisicoquímicas de la metaloproteasa nativa preparada con zinc y
manganeso de Bacillus polymyxa. Appl Microbiol 1973; 26 (2): 191 mi 5 .
[104] Stenn KS, Link R, Moellmann G, Madri J, Kuklinska E. Dispase, una proteasa neutra de Bacillus polymyxa,
es un poderoso fi bronectinasa y colagenasa de tipo IV. J Invest Dermatol 1989; 93 (2): 287 mi 90 .
[105] Lim LS, Riau A, Poh R, Tan DT, Beuerman RW, Mehta JS. Efecto de la denudación de dispasa sobre la
membrana amniótica. Mol Vis 2009; 15: 1962 mi 70 .
[106] Matta H, Punj V. Aislamiento y caracterización parcial de una proteasa extracelular termoestable de Bacillus
polymyxa B-17. Int J Food Microbiol 1998; 42 (3): 139 mi 45 .
[107] Ruf A, Stihle M, Benz J, Schmidt M, Sobek H. Estructura de la gentilasa, la metaloproteasa neutra de
Paenibacillus polymyxa. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 2013; 69 (Parte 1): 24 mi 31 .
[108] Mitchell WM, Harrington WF. Puri fi catión y propiedades de la clostridiopeptidasa B (clostripaína). J Biol
Chem 1968; 243 (18): 4683 mi 92 .
[109] Dargatz H, Diefenthal T, Witte V, Reipen G, von Wettstein D. La proteasa heterodimérica clostripaína de
Clostridium histolyticum está codificada por un solo gen. Mol Gen Genet MGG 1993; 240 (1): 140 mi 5 .
[110] Labrou NE, Rigden DJ. La relación estructura-función en la familia de las peptidasas clostripain. Eur J
Biochem 2004; 271 (5): 983 mi 92 .
[111] Clostripain E Labrou N. Manual de enzimas proteolíticas. 2013 [Internet] .
[112] Ståhle M, Foss A, Gustafsson B, Lempinen M, Lundgren T, Rafael E, et al. Clostripain, el eslabón perdido en
la mezcla de enzimas para ef fi cient aislamiento de islotes humanos. Transplant Direct 2015; 1 (5): e19 .
[113] Loganathan G y col. Colagenasa-puri enriquecida de bajo costo fi ed mezclas de enzimas proteasas utilizadas
con éxito para el aislamiento de islotes humanos. Trasplante OBM. 2019; 3 (2). https://doi.org/10.21926/obm.transplant.1902064
.