Química Analítica e Instrumental

Cromatografía

Prof. Amancio Guzmán Rodríguez

Magister en Ciencias

1
 Química Analítica e Instrumental

SEMANA SESIÓN CONTENIDOS DE APRENDIZAJE

CONOCIMIENTO DESEMPEÑO

CONCEPTUAL PROCEDIMENTAL ACTITUDINAL

Introducción a la
cromatografía. Reseña
histórica. Fundamentos
generales. Clasificación de las
técnicas cromatográficas.
13 1
( 7 horas) Parámetros de evaluación de diagrama de las
la columna cromatográfica.
Cromatograma y análisis
cuantitativo. Ejemplos de
aplicaciones.
Determina y analiza Valora el trabajo en equipo.
el espectro de Muestra tolerancia y respeto a los
absorción y la curva compañeros de clase,
de calibración del
Anaranjado de
Metilo. Elabora un
técnicas operativas
ejecutadas en el
laboratorio y realiza
su interpretación
química.

2
 CROMATOGRAFÍA
Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido

Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la

fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de

manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas

α= ______[moléculas adsorbidas]_____
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
 FASE MÓVIL

FASE
ESTACIONARIA
Clasificaciones de cromatografía

1. Según como se encuentre la fase estacionaria

a. Columna
(flujo contínuo)

b. Batch
(por lotes)

c. Plana: cromatografía en papel y en capa fina

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil

Fase estacionaria Fase móvil

Sólida Líquida o gaseosa

Líquido adsorbido Líquida o gaseosa

3. Según el tipo de flujo empleado

a. Gravedad b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fluido a presión (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión

Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas está formado por pequeñas

partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable

o vidrio grueso
FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y

equipamiento especialmente diseñado para
separar o purificar proteínas

Las columnas de FPLC soportan menos

presión que las de HPLC
4. Según la finalidad del experimento

Separación y purificación Preparativa

Separación, cuantificación y Analítica

caracterización
5. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto

a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga

b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico

c. Cromatografía de afinidad variada pero específica

d. Cromatografía de afinidad por metales enlaces covalentes

inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolos

Cromatografía de intercambio iónico

La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado

Las interacciones son electrostáticas

Dos tipos

Intercambio aniónico: matriz cargada

positivamente (DEAE, TEA, QAE)

Intercambio catiónico: matriz cargada

negativamente (carboximetilos,
sulfonatos, fosfatos)

Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o

ambos
 Condiciones iniciales Aplicación de la muestra
- -
+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
- - + + + - + + + -
- - - -
- -
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+ -
+ + + -
+
- + + + -
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+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
- - + + + - + + + -
- - - -
- -
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+ -
+ + + -
+
- + + + -
- -
-
- -
+ - -
+ + + - +
+ + + - +
- - + + + - +
- - - + + + -
- -
-
Aumento en la concentración de sales Elución de la proteína de interés
- - - -
+ + + +
+ + + - + + + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ - +
+ + + + + + -
- -
- -

- - -
+ + + +
+ + - + ++ + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ +
+ + + - + + + -
- -
- -
- - -
-
+ +
+ + + - + + + + - +
+ + + -
- + + + - - -
- - - -
-
Cromatografía de afinidad

Se basa en una interacción biológica específica:

Enzima-sustrato

Anticuerpo-antígeno

Enzima-coenzima

Proteína-ligando específico

La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a

la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean
capaces de debilitar la interacción
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones

metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)

Principalmente a los iones divalentes de metales de transición

como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el

imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH
Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes

Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+
Cromatografía de interacción hidrofóbica

El soporte está sustituido con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos

u otros grupos hidrofóbicos

La interacción es de tipo hidrofóbica

La fase móvil debe tener una alta concentración de sales

((NH4)2SO3 2 – 4 M)

Salting out

Para la elución se disminuye la concentración de sales en la

fase móvil
 Cromatografía de fase reversa

Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica

pero son diferentes

El soporte está sustituido por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos)
y la densidad de sustituyentes es mayor

La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no

polares para la elución

Desnaturaliza proteínas

Se utiliza en HPLC
Gel filtration (cromatografía de exclusión molecular)

No es una cromatografía

La separación se da por tamaño

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y
sin carga

Múltiples aplicaciones:

Cambios de buffer

Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de

mayor tamaño

Determinación del peso molecular

Resultado final: cromatograma

y y

Velución (mL) Velución (mL)

y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad

del pico (espectrometría de masa), entre otras
Concluyendo….

La pregunta más importante…

¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?