TEMA No 2

MICROSCOPIA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS

LENTES Y DESVIACIÓN DE LA LUZ

El término lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plástico u otro
material transparente, generalmente de diámetro circular, que posee dos
superficies pulidas y diseñadas de una manera específica para producir la
convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. La acción de
una lente depende de los principios de refracción y reflexión, los cuales pueden
entenderse mediante unas sencillas reglas de geometría que rigen el paso y
trayecto de la luz a través de la lente. Estos conceptos son materia de estudio de
la Óptica Geométrica y permiten comprender el proceso de magnificación, las
propiedades de las imágenes real y virtual, así como también los defectos
(aberraciones) de las lentes (Langueron, 1949).
Las lentes son instrumentos ópticos que concentran o dispersan los rayos de luz.
Sus dos superficies pueden ser curvas (biconvexas, bicóncavas o cóncavo-
convexas) o una de ellas puede ser plana (plano-convexas, plano-cóncavas). Las
lentes de superficies convexas se denominan positivas, convergentes,
recolectoras o de aumento. Las lentes de superficies cóncavas son conocidas
como negativas, divergentes, de dispersión y producen una imagen reducida
(Langueron, 1949).

Figura 2.1.-Diversos tipos de lentes.

La luz se propaga con una trayectoria rectilínea y con una velocidad constante en
cada medio. Cuando incide en un objeto, el rayo luminoso se comporta de
diversas maneras, produciéndose: Refracción, Reflexión, Difracción, Absorción-
Transmisión, Interferencia y Polarización. Describiremos someramente la
refracción y la reflexión por su utilidad en la formación de las imágenes
aumentadas por las lentes.
REFRACCIÓN
Cuando un haz luminoso pasa de un medio a otro, ocurre un cambio de la
velocidad produciéndose una disminución y también produciéndose un cambio de
dirección. La nueva dirección que toma el rayo refractado depende de la densidad
del medio que atraviesa y tratándose particularmente de lentes también depende
de la forma del mismo. Los efectos de la refracción son responsables de algunos
fenómenos que nos son familiares, por ejemplo, la aparente deformidad de un
objeto parcialmente sumergido en un vaso de agua. La refracción de la luz visible
en las lentes es de vital importancia, pues les permite concentrar un haz de rayos
luminosos en un punto específico.

Figura 2.2-Refracción de los rayos luminosos en la interface aire-agua.

INDICE DE REFRACCIÓN

 El índice de refracción se obtiene del cociente de la velocidad de la luz en el

vacío dividida entre la velocidad de la luz en un medio transparente, es
decir en este caso del medio que se estudia.
n: índice de refracción
c: velocidad de la luz en el vacío
v: velocidad de la luz en el medio material transparente
El índice de refracción de un medio es una medida para saber cuánto se reduce la
velocidad de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el índice de
refracción del agua es n= 1,33, quiere decir que la luz es 1,33 veces más rápida
en el vacío que en el agua y es un valor que tiene que ver con las propiedades de
las lentes (La luz y sus propiedades)

MATERIAL INDICE DE REFRACCIÓN

VACÍO 1
AIRE 1,00029
AGUA ( A 20oc) 1,333
HIELO 1,31
DIAMAMTE 2,417
GLICERINA 1,473

Tabla 2-1.- Índice de refracción en algunos medios transparentes. (*) en

condiciones normales de presión y temperatura, se considera 1 el valor.
Modificado de García, A. F. Física con ordenador. Curso Interactivo de Física en
Internet. La ley de Snell de la refracción (García, A.F.)
PUNTO FOCAL
El punto focal se da cuando un haz luminoso atraviesa una lente convexa, se
define como el punto en el cual los haces refractados confluyen.

Figura 2.3.- Refracción de la luz a través de una lente convexa.

En la figura,
A, b y c= Haz de luz incidente
C’, n y a’ = haz de luz refractada
F = Punto focal.
DISTANCIA FOCAL
La distancia focal es la distancia que separa el punto focal del centro óptico de la
lente (Langueron,1949).

UNIDADES UTILIZADAS PARA EXPRESAR EL TAMAÑO DE LOS

MICROORGANISMOS
Los microorganismos son seres vivos que por sus tamaños escapan a la vista, es
por esta razón que para describir sus tamaños se utilizan unidades especiales
como lo son las micras o micrómetros. Sin embargo, existen otras unidades cuya
relación es más pequeña que las micras, como los son los nanómetros,
picómetros y amstrong, cuyas equivalencias se detallan a continuación:

1cm=10-2 m: 1mm=10-3mt:

1m=10-6 mt:1nm=10-9 mt:

1A=10-10mt:1pc=10-12mt
HISTORIA DE LOS MICROSCOPIOS
El nombre microscopio deriva del griego: mikrós=pequeño, skopéo=observar. Este
término designa, en sentido amplio, a todo instrumento utilizado para amplificar la
imagen de objetos que, por su tamaño, no son observables a simple vista. En la
práctica, se refiere a un aparato formado por un sistema de, al menos, dos lentes:
un objetivo y un ocular, con el mismo fin. El desarrollo del microscopio compuesto
tuvo un precedente atribuido a Galileo (1564-1642). El verdadero impulsor de la
Microscopía fue, sin duda, el holandés Anton Van Leeuwenhoek, (1632-1723).
Construyó microscopios simples, con lentes muy convexas que él mismo pulía y
con los cuales realizó observaciones muy diversas: estudió la composición de la
sangre, fue el primero en observar y dibujar los protozoos, descubrió las bacterias,
etc. Sus trabajos fueron publicados por la Real Sociedad de Londres (1683). Hoy
día, hay unanimidad en considerar a los holandeses Hans y Zacarias Janssen,
padre e hijo, como constructores del primer microscopio compuesto en 1590.
Desde entonces y hasta nuestros días, el microscopio compuesto no ha cesado de
perfeccionarse, incorporándole mejoras, revolver, portaobjetivos, visión binocular,
iluminación halógena de gran rendimiento, filtros polarizadores, equipo de
contraste de fase, microscopio de contraste interferencial, microscopio de luz
ultravioleta, etc. Pese a todo, el microscopio óptico presenta una serie de
limitaciones que le impone la naturaleza de la propia LUZ. Por encima de los
1500-2000 aumentos, las aberraciones que origina la luz impiden hacer
observaciones con nitidez. Es por ello que los investigadores tuvieron la idea de
utilizar haces de electrones en lugar de rayos luminosos y potentes electroimanes,
en lugar de lentes. Con ello nació el microscopio electrónico.

CLASIFICACIÓN DE LOS MICROSCOPIOS

Hoy en día existe una gran gamma de microscopios, los cuáles han sido
desarrollados en función de los requerimientos de cada área de trabajo. Sin
embargo todos los microscopios encajan en la siguiente clasificación:
MICROSCOPIOS SIMPLES
Son aquellos microscopios constituidos por una sola lente, comúnmente conocidos
como lupas. La principal desventaja de estos es su bajo poder de amplificación.
MICROSCOPIOS COMPUESTOS
Como microscopio compuesto se reconoce a todo aquel microscopio que está
constituido por más de una lente. A su vez los microscopios compuestos se
subdividen en microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
MICROSCOPIOS OPTICOS
Este tipo de microscopios se caracteriza por utilizar un haz de luz visible para la
formación de la imagen. Son los microscopios más comunes de encontrar por su
versatilidad y costo. A continuación se citan algunos microscopios ópticos,
mencionando algunas de sus características:
Microscopio de campo luminoso
Este microscopio se caracteriza por la formación de una imagen en cuyo campo
de observación la muestra se ve ligeramente contrastada sobre un fondo
intensamente iluminado. Para este tipo de microscopios es necesario realizar un
tratamiento de coloración a la muestra para que de esta manera aumente su
capacidad de retención de la luz, sin lo cual es problemática la observación.
Por el tratamiento de coloración realizada a la muestra los microorganismos
mueren en el proceso.
 Figura 2.4.- Muestra de hongos tratados mediante tinción de gram. Muestra
observada en microscopio de campo luminoso. 400x
Microscopio de campo oscuro
Este microscopio se caracteriza por la formación de una imagen con un campo de
observación oscurecido gracias a un condensador especial que tiene el mismo,
formando una imagen brillantemente iluminada. En este tipo de microscopios no
se hace necesario realizar un procedimiento de coloración a los microorganismos,
por lo que se los puede ver vivos, posibilitando esto el estudio de ciertos aspectos
de interés como ser el movimiento de algunos microorganismos, formas de
reproducción y cuantificación aproximada en un sustrato.
La gran desventaja de este microscopio es que no permite visualizar estructuras
celulares específicas, solamente bordes de células.

Figura 2.5.- Treponema pallidium observada en un microscopio de campo

oscuro. 400x
Microscopio de contraste de fases
El microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y
resulta especialmente útil para células vivas. La mayoría de los organismos vivos
no pueden ser teñidos debido a que los colorantes utilizados pueden dañar su
estructura celular hasta el punto de su muerte. Esta técnica de microscopía,
aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas
partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que
pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y
queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la
muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de
anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera
de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las
partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen;
las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo
tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y
cortes semifinos no coloreados. Pese a que este microscopio tiene un fin muy
similar al microscopio de campo oscuro, este saca ventaja al permitir observar
subestructuras de la célula cosa que no es posible en el microscopio de campo
oscuro.

Figura 2.6.- Hongo filamentoso observado en microscopio de contraste de

fases. 400x
Microscopio de fluorescencia
Los microscopios descritos hasta ahora producen una imagen a partir de la luz
que pasa a través de una muestra. Sin embargo un objeto puede verse también
porque emite realmente luz, ésta es la base del microscopio de fluorescencia.
Cuando algunas moléculas absorben energía radiante quedan excitadas y
posteriormente liberan energía atrapada en forma de luz. Cualquier luz emitida por
una molécula excitada tendrá una longitud de onda superior (o de energía inferior)
a la radiación original absorbida. La luz fluorescente es emitida muy rápidamente
por una molécula excitada, al liberar la energía atrapada y recuperar un estado
más estable.
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Un microscopio electrónico es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de
fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios
electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a la de los
microscopios ópticos, como una comparación por ejemplo los microscopios
ópticos pueden observar objetos en un rango de 100 micras a 100 nanómetros, en
cambio los microscopios electrónicos abarcan desde 100 micras hasta 0.1
nanómetros, rango que hacen que con los microscopios electrónicos se pueden
observar incluso virus, lo que no es posible con los microscopios ópticos.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
Permite la observación de muestras de cortes muy finos. Una parte de los
electrones son absorbidos o rebotan por el objeto y otros lo atraviesa formando
una imagen aumentada del objeto en cuestión. Las muestras no deben ser
mayores de un par de miles de angstroms. Este tipo de microscopios puede
aumentar la imagen hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido (MEB)

En éste no es necesario que el espécimen se encuentre en capas finas para
observarlo. Este microscopio explora la superficie de la imagen punto a punto y
recorre la muestra con un haz muy concentrado de electrones. Estos pueden
provocar la aparición de electrones secundarios, que posteriormente serán
recogidos por un dispositivo situado a los lados del objeto en cuestión. Los
microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar la imagen unas 200000
veces.
SISTEMAS DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO
Los microscopios ópticos estas compuestas por una gran cantidad de partes,
todas ellas englobadas en tres sistemas:
a. Sistema óptico
El sistema óptico está compuesto por los lentes oculares y lentes objetivos.
Lentes oculares.- Estos son lentes que se encuentran en el cabezal del
microscopio, cuando el microscopio contiene un solo lente se denomina
microscopio monocular, si contiene dos lentes se denomina microscopio
binocular. Las potencias de amplificación que suelen traer los oculares pueden
variar entre 5x a 20x.
Lentes objetivos.- Estos se disponen en una pieza giratoria denominada
revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos,
y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos
 utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de
inmersión.

 Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna

entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que
indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por
ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que
el objetivo es plan acromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65,
calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía
con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los
objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
 El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de
lentes. Estos lentes objetivos utilizan alguna sustancia fluida entre la muestra y
el lente para poder observar, de manera que la lente frontal entra en contacto
con el fluido de inmersión. Como fluidos de inmersión se pueden utilizar aceite
de cedro, glicerol, agua y otros, sin embargo, el fluido a utilizar viene
especificado en el tambor de la lente, ya sea de forma escrita o utilizando un
código de colores estandarizado a nivel internacional. Por ejemplo se utiliza
una franja de color negra para aceite, franja naranja para el glicerol, franja
blanca para el agua y roja cuando el lente objetivo puede utilizar cualquier
sustancia de inmersión. Generalmente, estos objetivos son de 100X.

b. Sistema de iluminación

El sistema de iluminación está compuesto por las siguientes partes:

 Foco o bombilla, se constituye en la fuente de iluminación que

dependiendo del microscopio este puede estar equipado con lámparas
incandescentes las cuales proporciona una luz de color amarilla. También
los microscopios pueden estar equipados con luz halógena, lámparas que
tienen un halógeno( yodo o bromo) dentro de la ampolleta, aspecto que
mejora la eficiencia de la lámpara y mejora el tiempo de vida útil brindando
una iluminación en una región del espectro electromagnético más alta,
produciendo una luz de color blanca. Se pueden también encontrar
microscopios con lámparas LED, sistema de iluminación que se caracteriza
por un bajo consumo energético y larga vida útil.

 Reostato, es un elemento eléctrico (resistor), se encuentra en la base del

microscopio y permite la regulación de la intensidad luminosa.
 Condensador, es un sistema de lentes que se encuentra ubicado debajo
de la platina, su función es la de concentrar la luz emanada por la lámpara.
Está equipada con un tornillo, el cual permite el desplazamiento del
condensador en sentido vertical permitiendo de esta manera regular la
intensidad luminosa, aumentándola a medida que se acerca a la
preparación, brindando el máximo de iluminación cuando este está
prácticamente pegada a la platina.

 Diafragma o iris, elemento que se encuentra dentro del condensador, es

una especie de cortina concéntrica, misma que esta provista de una
pequeña palanca la cual permite regular el diámetro de la abertura,
permitiendo de esta manera controlar la cantidad de luz que vaya a pasar a
través del condensador.

c. Sistema mecánico
Dentro del sistema mecánico se encuentran las siguientes partes:

 Pie o Base, es la superficie donde se inserta el brazo. Se constituye en la

parte de apoyo de todo el microscopio y contienen generalmente al foco y
reóstato.

 Brazo, estructura metálica en la cual vienen insertados y sujetados todos

los sistemas del microscopio. Algunos autores la llaman el esqueleto del
microsocopio.

 Platina, superficie metálica que sirve como soporte para la muestra. En el

centro de su estructura esta provista de un orificio para permitir pasar la luz.
Asimismo, contiene a las pinzas.

 Pinzas, parte mecánica que sirve para sujetar el portaobjetos. Esta provista
de un par de tornillos concéntricos, los cuales permiten desplazar las pinzas
en diferentes sentidos con la finalidad de ubicar exactamente la parte de la
muestra que se desea observar.

 Tornillo macro y micrométrico, son dos tornillos concéntricos que

permiten el desplazamiento del sistema óptico respecto de la platina o
viceversa dependiendo del modelo de microscopio, en cualquier caso la
finalidad es acercar la muestra al sistema de lentes del microscopio. Estos
tornillos se encuentran atravesando el brazo, el tornillo más grande se llama
macrométrico y tiene como función la de realizar movimientos grandes y se
 la utiliza al principio de la observación con la finalidad de encontrar en
primera instancia una imagen difusa. El tornillo más pequeño es llamado
tornillo micrométrico y como su nombre indica (micro=pequeño), permite
realizar movimientos pequeños de la platina, su uso tiene como fin afinar la
calidad de la imagen observada.

 Revolver, elemento mecánico que contiene a los lentes objetivos,

generalmente los microscopios vienen equipados con cuatro lentes
objetivos, pudiendo variar esto dependiendo de los modelos. Este elemento
tiene como función, la de permitir seleccionar un lente objetivo para su uso.

CAPACIDAD DE AMPLIFICACIÓN Y CAPACIDAD DE RESOLUCIÓN

La capacidad de amplificación de un microscopio óptico es la capacidad del

mismo de amplificar una imagen un número determinado de veces. Los
microscopios ópticos tienen una capacidad limitada de amplificación, pudiendo
alcanzar los 1000 aumentos, aspecto que permite observar a todos los
microorganismos, excepto virus debido a su tamaño mucho más pequeño que
el de las bacterias, los virus son cien veces más pequeñas que las bacterias.
La capacidad de amplificación total de un microscopio viene determinada por la
capacidad del objetivo utilizado multiplicado por la capacidad de amplificación
del ocular en uso, por ejemplo si se está utilizando un ocular de 10x y un
objetivo de 40x, la capacidad de amplificación total serán 400x ( 400
aumentos).

La capacidad de resolución de una lente se refiere a la capacidad de la lente

de distinguir claramente entre objetos pequeños que se encuentran muy
próximos entre sí. Esta característica es muy importante ya que el trabajo en
microbiología pasa por el reconocimiento de los microorganismos que desde
ya son muy pequeños, entonces si la lente no tiene adecuada capacidad de
resolución, estos se observarán como una masa compacta de células. Esta
capacidad de resolución puede calcularse mediante la siguiente ecuación:

d= 0.5 / nsen 

donde:

d= Distancia mínima reconocible por la lente.

λ = Longitud de onda de la fuente de luz.

n= Índice de refracción del medio.

θ = Mitad del ángulo del cono de luz incidente en el lente objetivo.

Analizando la anterior ecuación, se puede observar que una de las formas de

hacer variar la resolución de una lente es haciendo variar la longitud de onda y
la otra es variar el índice de refracción, aspecto que se reduce al uso de
objetivos húmedos o de inmersión.

La capacidad de resolución total del microscopio puede determinarse mediante

la siguiente ecuación:

dtotal=  / (Anobj+Ancond)

donde:

dtotal= Distancia total mínima detectable por el microscopio.

λ = Longitud de onda de la fuente de luz.

n= Índice de refracción del medio.

Anobj= Apertura numérica del objetivo.

Ancond= Apertura numérica del condensador.

LÍMITES DE RESOLUCIÓN DE LOS MICROSCOPIOS

Hablando de uno de los microscopios más comercialmente encontrados, el

microscopio de campo luminoso, este puede alcanzar corrientemente los 1000
aumentos, pudiendo abarcar desde los 100 µm hasta los 100 nm, siendo útil
para la observación de micoplasmas, bacterias, mohos, levaduras, eritrocitos,
células epiteliales y otras.

El microscopio más potente es el microscopio electrónico, teniendo un rango

de operación desde los 100µm hasta los 0.1 nm, pudiéndose observar en este
microscopio todo lo abarcado por el microscopio de campo luminoso, además
proteínas, aminoácidos, átomos, etc.

PROCEDIMIENTOS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Dependiendo de los objetivos buscados, las observaciones microscópicas

pueden clasificarse en dos grupos:

a. OBSERVACIÓN EN HÚMEDO
 Ésta técnica es útil cuando se desea estudiar características de los
microorganismos tales como sus métodos de reproducción, movimiento celular
y realizar una cuantificación aproximada del número de células en una muestra
líquida. En ésta técnica los microorganismos se encuentran vivos en el
procedimiento de observación. Para su utilización es recomendable contar con
un microscopio de campo oscuro.

A continuación se detalla la técnica de recuento de células en la cámara cuenta

glóbulos.

Técnica de recuento celular en la cámara cuenta glóbulos

1. Realizar una dilución 1/10 (Puede ser mayor en caso de que la muestra sea
muy concentrada).
2. Descargar sobre la cámara cuenta glóbulos.
3. Tapar con el cubreobjetos.
4. Realizar el recuento de células.

El número total de células se determina mediante la siguiente ecuación:

# Cel = 4000* (1/D)*N/F

Donde:

D= Factor de dilución utilizado para el recuento.

N= Número de células contadas

F= Número de campos utilizados para la determinación.

Este procedimiento se puede realizar en las cámaras de Neubauer, mostrada a

continuación.
Figura 2.7.- Cámara de Neubauer.

OBSERVACIÓN EN PELÍCULAS SECAS Y COLOREADAS

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben

a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células
de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio
en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin
algún tratamiento previo.

En estos procedimientos las células mueren en el tratamiento de la muestra.

De esta manera, la utilidad del método radica para el estudio de la morfología
de la célula y también sirve para estudiar las reacciones que éstas presentan
frente a los diferentes colorantes usados. Dentro de este procedimiento se
encuentran una serie de técnicas muy útiles para el reconocimiento de los
microrganismos mismas que pueden ser clasificadas en dos grupos:
 a. Tinciones simples

Éste tipo de tinción se caracteriza por la simplicidad del método, donde se

utiliza solamente un colorante. Es así que éste método solamente sirve para el
estudio de la morfología externa de la célula.

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son

colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente
pigmentadas que proceden del alquitrán.

Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la

molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de
metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados
con frecuencia en bacteriología son safranina, fucsina básica y verde
malaquita.

Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas

tienen un pH interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular
cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces.

Colorantes ácidos como rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fucsina ácida
tienen un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir
positivamente ciertos componentes como las proteínas.

b. Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten
en la aplicación de dos o más colorantes que contrastan en su intensidad o
color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre
microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una
población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o
físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en
una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en
bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistente.

Tinción de Gram

Esta tinción diferencial fue propuesta por el médico danés Christian Gram(1884)
que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó
que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el
colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente por el cristal
violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera
prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y
agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las
bacterias. La tinción de  Gram divide a las bacterias con pared del Dominio
Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva las
cuales se observan de color violeta y bacterias con pared de tipo gram negativa,
mismas que se observan de color fucsia.
El procedimiento en esta técnica se detalla a continuación:
1. Realizar el frotis de la muestra.
2. Realizar la fijación.
3. Aplicar el violeta cristal por un minuto.
4. Enjuagar con agua.
5. Aplicar solución de lugol por un minuto.
6. Enjuagar con agua.
7. Decolorar con alcohol por 30 segundos.
8. Enjuagar con agua.
9. Aplicar la solución de safranina por 30 segundos.
10. Enjuagar con agua.
11. Secar al aire.
12. Observar al microscopio.

TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE

Éste método de coloración se utiliza para la identificación de microorganismos del

género Mycobacterium, grupo de microorganismos con forma de bacilos, donde
se encuentran dos microorganismos patógenos como lo son el Mycobacterium
tuberculosis y el Mycobacterium leprae, causantes de la tuberculosis y la lepra
respectivamente. Una de las fuentes de estos gérmenes es la leche cruda, es por
esta razón que en la industria láctea se hace necesaria su identificación.
El procedimiento es como sigue:
1. Realizar el frotis.
2. Realizar la fijación.
3. Calentar una mezcla de fucsina y fenol.
4. Verter la mezcla sobre la muestra y mantenerla por 5 minutos.
5. Decolorar con alcohol.
6. Enjuagar con agua.
7. Adicionar solución de contraste, violeta de genciana y mantenerla por 5
minutos.
8. Enjugar con agua.
9. Secar y observar al microscopio.
En éste procedimiento las células pertenecientes al grupo de Mycobacterium
se observarán de color fucsia y las demás de color violeta.

TINCIÓN DE ESPORAS

Las esporas bacterianas son estructuras inactivas que algunas bacterias

suelen formar como un medio de defensa cuando éstas son sometidas a
condiciones adversas de crecimiento, como ser por ejemplo la exposición a
temperaturas superiores a la máxima de crecimiento de la bacteria en cuestión,
o la exposición a soluciones desinfectantes, etc. Cuando las bacterias forman
esporas, dejan de ser activas y la espora permanecerá inactiva mientras duren
las condiciones adversas, se han descubierto esporas que se mantuvieron en
ese estado hasta 100 años, una vez que retornan las condiciones favorables
de crecimiento, a partir de la espora se puede generar una nueva célula capaz
de llevar adelante sus procesos reproductivos.
La técnica de determinación de esporas es como se detalla a continuación:
1. Realizar el frotis.
2. Realizar la fijación.
3. Teñir con verde malaquita a emisiones de vapor por 10 minutos.
4. Lavar con agua destilada.
5. Aplicar solución de contraste, fucsina básica por 3 minutos.
6. Enjuagar con agua.
7. Secar y observar con objetivo de inmersión.

En éste procedimiento al observa la muestra las endoesporas se observarán

de color verde y el resto de la célula se colorea de fucsia.