Tercera Unidad Microbiologia General

2020
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE INDUSTRIA

ALIMENTARIA
[GUIA TEORICA DE MICROBIOLOGIA GENERAL]
MG. MARIEL ALVAREZ RODRÍGUEZ

MICROBIOLOGÍA GENERAL Ing. Mariel Alvarez Rodríguez
TERCERA UNIDAD: CULTIVO DE BACTERIAS
Capítulo V: CULTIVO DE LAS BACTERIAS
Para estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo el

cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto es necesario conocer cuáles son los
nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante investigaciones extensas se han
determinado las necesidades nutricionales de las bacterias y esta información ha sido la causa
del desarrollo de numerosos medios de cultivo. Las bacterias también tienen diferencias
notables en lo que respecta a las condiciones del ambiente. Por ejemplo: algunas crecen a 0ºC
otras necesitan temperaturas superiores es a 45ºC y pueden reproducirse aun a 70ºC. Algunas
necesitan atmósfera de oxígeno, o bien este elemento les es indiferente.
17.- NECESIDADES NUTRICIONALES.- Desde los hombres hasta los microorganismos, todas las
formas de vida, tienen en común determinadas necesidades nutricionales en términos de
necesidades químicas para llevar a cabo su crecimiento y sus funciones normales.
a) Todo organismo necesita una fuente de energía entre las bacterias se encuentran 2 tipos de
nutrición: Fotótrofos (consumen la energía radiante) y Quimiótrofos (incapaces de asimilar
energía radiante, se valen de la oxidación de los compuestos químicos para obtener su
energía).
b) Todo organismo vivo necesita obtener carbono de alguna manera: todos requieren al menos
pequeñas cantidades de dióxido de carbono, pero la mayoría de ellas necesitan de algún
compuesto que tenga carbono orgánico como azúcar u otros carbohidratos.
 Las bacterias que necesitan el CO2 como su fuente de Carbono son autotrofos.
 Si obtienen su energía de la luz son fotoautótrofos.
 Si obtienen su energía oxidando compuestos químicos son quimioautótrofos.
 Los organismos que necesitan de compuestos orgánicos de carbono se denominan
heterótrofos.
c) Todo organismo vivo necesita obtener nitrógeno de alguna manera: las bacterias son muy
versátiles a este respecto: algunas absorben nitrógeno atmosférico, otras lo obtienen en
compuestos de nitrógeno inorgánico y otras lo toman de las proteínas o de cualquier
compuesto orgánico que lo contenga.
d) Todo organismo vivo necesita azufre y fósforo, algunas bacterias necesitan compuestos
orgánicos y otras compuestos inorgánicos de azufre, otras son capaces de utilizar el azufre
elemental. El fósforo lo obtienen generalmente de los fosfatos.
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e) Todos los organismos vivos necesitan de varios metales como Na, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, Cu,
P, y Co, para que puedan crecer normalmente. Las bacterias no son una excepción, las
cantidades de metales que requieren en algunas ocasiones son solo vestigios.
f) Todo organismo vivo necesita de vitaminas y compuestos vitaminados, también en este

caso, las bacterias presentan aspectos muy variables. Algunas son capaces de elaborar
(sintetizar) todas las vitaminas que necesitan a partir de otros compuestos presentes en el
medio. Otras no proliferan salvo que en el medio en que se les cultiva, se encuentren ya una
o más vitaminas.
18.- TIPOS DE NUTRICIÓN DE LAS BACTERIAS.-
Es posible dividir las bacterias en muchos grupos tomando como base sus requerimientos
nutricionales, cada uno de estos grupos se subdivide a su vez en base a la fuente principal de
energía que consumen para su crecimiento por ejemplo: la luz o la oxidación de compuestos
químicos.
a. Fototrofos: Existen especies que consumen CO2 como fuente principal de carbono y se
denominan fotolitotróficas, otras necesitan un compuesto orgánico y se denominan
fotoorganotróficas.
b. Quimiótrofos: Algunas bacterias son capaces de oxidar nitritos y nitratos y fijar CO 2 para
satisfacer sus necesidades de carbono y de energía como el género Nitrobacter.
c. Autótrofos y Heterótrofos: Los autótrofos tienen necesidades nutricionales más simples por
ejemplo: para el crecimiento de bacterias autotróficas que oxidan azufre se necesita un
medio de cultivo que contenga Azufre en polvo, Cloruro de Calcio, agua, etc.
19.- CLASES DE NUTRIENTES.-
19.1.- NUTRIENTES UNIVERSALES
A. El agua
Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden
considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde
el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:
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 El principal constituyente del protoplasto bacteriano;

 El medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
 Un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones
bioquímicas).
Las fuentes de agua pueden ser:
 Endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;

 Exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las
membranas.
 Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:
 Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben
(respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas
inasequibles a la bacteria.
 Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas
de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del
microorganismo.
Las bacterias tienen valores de a W normalmente entre 0.90 y 0.99.
 Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1.

 Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales,
tienen aW de alrededor de 0.995.
 Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980.
 Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950.
 En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a
aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios
acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba
citadas:
 bacterias halófilas extremas, como la arqueobacteria Halobacterium, que habita lagunas
hipersalinas;
 bacterias (y sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como levaduras)
sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares.
B. El CO2
El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:
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 Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente
de energía la luz (en el caso de las fotoautótrofas) u oxidaciones de determinadas
sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).
 Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones
procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:
CO2 + 4H2 ---------> CH4 + 2H2O
 Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de

electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas
rutas anabólicas y catabólicas.
El origen del CO2 puede ser:
 Endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente

orgánica de carbono;
 Exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.
Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero algunas
bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas
enriquecidas, con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja
afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a
tensiones normales.
C. Fósforo
Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden
usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de
ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son
hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la
fosfatasa alcalina).
El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero
aparece también en coenzimas y en proteínas.
D. Sales minerales
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Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl--) y de cationes para la célula. Los
siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+,
Mg++, Ca++, Fe++.
Capítulo VI: FACTORES DE CRECIMIENTO
Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad,
algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son
sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus
precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al
carecer de parte o toda de una ruta biosintética.
Ejemplos:
 las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios
de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.
 Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.
En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas
bacterias:
Factor o vitamina Funciones principales

p-aminobenzoico (PABA) Precursor del ácido fólico
Acido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de

grupos metilo.
Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2
Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1;

síntesis de desoxirribosa
Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en

reacciones redox
Riboflavina Precursor de FAD y FMN
Ácido pantoténico Precursor de la CoA
Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas.
Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos
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Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas,

menaquinonas, etc.)
20.- MEDIOS DE CULTIVO
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el

laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos
requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que
cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la
cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están
acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos
de medios de cultivo.
Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en
estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de
un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en
primera instancia, en tres grandes tipos:
20.1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que

son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:
Ejemplos:
 Digeridos crudos de extracto de carne

 Digeridos de extracto de levadura
 Digeridos de peptona de carne o de soja
 Digeridos de caseína (de la leche).
Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si
lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de
medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del
extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en
autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios
contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo,
con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la
composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes.
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20.2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades

concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición
concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente,
un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo
que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas.
20.3) En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores,
denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y
cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.
En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante

incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que
funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias
presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.
El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen
versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido
agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción
de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el
comportamiento nutricional de la bacteria).
El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100°C, lo
que permite su uso para la gran mayoría de bacterias, que son mesófilas.
Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual
que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas:
Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de
microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que
incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el
crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias
Gram-positivas.
Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de
bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese
comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia
indicadora presente en el medio.
Ejemplos:
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 En el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias

producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por
fermentación de ciertas fuentes de carbono.
 El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela
la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.
Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.
P. ej., el agar de MacConkey (MC). Se trata de un medio de color rosado y transparente, que
posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y
violeta cristal.
Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y
también contra selecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes
tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias
están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de
vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.
En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de

Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las
bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos,
lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al
viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias,
fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En
cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las
peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que
alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.
21.- CRECIMIENTO CELULAR
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos

que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las
bacterias.
Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es

necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el
substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer estos
factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo,
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con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a
completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc.
Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden,
sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar
su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo
que conocemos como tiempo de generación y puede variar desde unos 20 minutos en
condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo.Cada vez que transcurre un
tiempo de generación, el número de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento
exponencial.
Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de

generaciones transcurridas, el número de células final (N) será:
Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo
transcurrido, la ecuación anterior puede transformarse en la
siguiente:
Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es mejor
transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.
Para transformar las ecuaciones

anteriores en una recta, tomamos
logaritmos en los dos términos y resulta:
Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una
constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento tendrá poca
pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será rápido.
En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en paralelo.

Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en la acumulación de
metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuación
anterior N puede representar cualquiera de estos factores.
Otra forma de representar la cinética es considerando el

incremento en el número de células (dN) en un
intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación
que describe la cinética es la siguiente:
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esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al
número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad (µ) se le
denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así como la probabilidad de que una
célula se divida en un tiempo determinado.
Integrando la ecuación anterior durante el

tiempo de cultivo, se transforma en la
siguiente función exponencial:
la transformación de esta ecuación en una
recta (tomando logaritmos) rinde lo
siguiente:
esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo
siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta ecuación con la similar
presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/µ. Es
decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de
generación.
Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc.
después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de
crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células,
biomasa, etc.
El gráfico representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo (línea

roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentración
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(línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relación de

proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:
donde dS indica la variación de la concentración del substrato. Al valor Ys lo denominamos

rendimiento de utilización del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede
producirse por unidad de substrato consumido:
El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o

alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil
antropomórfico: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo) y varía
también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno
al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el
rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos
serán revisados más adelante).
La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el

organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor
será la velocidad de crecimiento (µ). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato
consumido, también mayor será la tasa de crecimiento.
Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el
rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato
tienen rendimientos más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el
rendimiento disminuye). A esta correlación inversa se le conoce con el nombre de efecto
Pasteur.
22.- FACES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos

que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y
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podríamos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposición con el cultivo continuo que
desarrollaremos más adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado
en la siguiente figura:
Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la que el microorganismo se
adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer
activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto más grande sea
el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial
cuya cinética explicamos en la página anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay
aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la
aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la
que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k
que depende de diferentes circunstancias.
En la fase de muerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye

exponencialmente. Pero ¿qué es un microorganismo vivo en términos microbiológicos?.
Consideramos vivo al microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha
perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto
porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen porqué estar
metabólicamente inactivos.
23.- MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los

cuales presentaré a continuación. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento
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equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por
consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto.
En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos.
Métodos de recuento: Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo

microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos.
Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas
(técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de
partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que
nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La
elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características
del cultivo y del proceso.
Entre los métodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:
1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste
de fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una
célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos
permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo;
pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas.
2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación
de estos sistemas es sencilla (método de empleo) y permite rápidamente determinar el número
de partículas presentes en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que
no distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble
presente en la suspensión del cultivo.
3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un

volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la
incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá
estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil
de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por
ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra
sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra
con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento
de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo.
Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30
y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.
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4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los

que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las
partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un
equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones
coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada
(normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad
óptica. La limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células
vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a
10.000 células por mililitro.
5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una
membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema,
obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.
6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la
luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se
puede medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es
interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de
forma que esa medida indirecta detecta únicamente las células vivas.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder ser
utilizados como sistemas online. En una operación on line no es necesario extraer la muestra
del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en
gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de
contaminación.
Antes de cerrar este apartado hay que señalar que en la naturaleza hay muchísimos más
microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De
hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones
menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se
cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para
el cultivo debido a procesos de sintrofía (literalmente comer juntos. En microbiología, la
sintrofía representa una situación de simbiosis metabólica trófica en la que dos organismos
diferentes pueden degradar juntos algunas sustancias que por separado no realizarían nunca.) y
la oligotrofía (inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos
microorganismos.
23.1.- FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS
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Una vez visto cómo podemos seguir la evolución de un cultivo, vamos a recordar que en un
proceso de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan manteniendo
unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores
nos permite seguir la evolución de los otros.
¿Qué factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano?. A continuación vamos a

revisar los que son estrictamente ambientales y más adelante revisaremos los relacionados con
los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes:
A.- Temperatura
Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la

variación de la velocidad de crecimiento (v) en función de la temperatura de cultivo, podemos
observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a
temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la
temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que (v) es máxima .Por
encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se
produce la muerte celular.
Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de

reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas
suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La
ausencia de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de
crecimiento y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser
fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitación del aceite a bajas temperaturas)
impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas
se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas
lipídicas a esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy
bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué comenzar a morir. Sin embargo,
cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente
(como veremos más adelante) y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja
posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.
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Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento

mínima, máxima y óptima.
Tipo de Temp. Temp. Temp.

microorganismo mínima óptima máxima
Psicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20
Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35
Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47
Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90
Además de los indicados existen organismos hipertermófilos que pueden crecer a temperaturas
cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión, Su temperatura óptima
de crecimiento está por encima de los 80 oC y el máximo crecimiento de cultivos puros se ha
llegado a dar a entre 110 y 113 oC. Son microorganismos muy importantes desde el punto de
vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales en agronomía o en microbiología
industrial.
Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas.
Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran
contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de
producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC).
Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su

crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas
derivados de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la
esterilización de los cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado, tienen interés aplicado en
el campo de la termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación
en los que el incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los
microorganismos mesófilos patógenos presentes.
B.- Oxígeno
El oxígeno, como constituyente universal de las células, es un nutrimento proporcionado en

cantidades abundantes por el agua; sin embargo, la mayoría de los microorganismos requieren
además oxígeno molecular. Respecto a la necesidad o tolerancia de esta molécula, se tiene que
los microorganismos se clasifican en cinco grupos:
17
 Aerobias estrictas (obligadas), aquéllos que crecen de manera obligada en condiciones óxicas
o aerobias con presencia de tensiones normales de oxígeno (21%), el que utilizan como aceptor
final de electrones para cubrir sus necesidades energéticas.
 Microaerofilas, los que crecen en tensiones de O2 menores a las del aire o condiciones
microóxicas (2 a 10%).
 Anaerobias estrictas, aquéllos que no requieren de este elemento para su desarrollo, y la

presencia de O2 inhibe su desarrollo o incluso provoca su muerte. Tal es el caso de las bacterias
reductoras de sulfatos y de las bacterias metanogénicas que utilizan el CO2 como aceptor de
electrones y lo reducen a metano.
 Anaerobias Aerotolerantes, son organismos anaerobios, pero que a diferencia de los estrictos,
estos toleran el O2 y crecen en su presencia aunque no puedan utilizarlo.
 Anaerobias Facultativas, emplean alternativamente oxígeno molecular u otros compuestos

inorgánicos u orgánicos como aceptores finales de electrones por lo que crecen de acuerdo a
las condiciones que prevalecen en su hábitat, aerobias o anaerobias.
Aplicación de la temperatura en la termodestrucción de microorganismos
Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilización para la esterilización

por calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una
parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y de forma
controlada mediante tratamientos términos. En esta sección veremos cómo se puede predecir
cómo será la evolución de las poblaciones microbianas como consecuencia de su exposición a
altas temperaturas.
Habíamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la desaparición de

microorganismos seguía la cinética descrita en la ecuación siguiente:
esto es: la fase de muerte también sigue una cinética exponencial y puede ser sometida a un
tratamiento matemático similar al usado para el tratamiento matemático del crecimiento. Si
representamos la variación del logaritmo del número de células supervivientes a un
18
tratamiento térmico realizado a una temperatura dada en función del tiempo de tratamiento,
se obtiene una gráfica como la siguiente:
el descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una
pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción. Se define el valor D como el
tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que
es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si
consideramos No como el número de células al inicio del tratamiento y Nx el número de células
supervivientes después de un tratamiento de x minutos a una temperatura t, el tiempo de
termodestrucción se calcula de la siguiente manera:
Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada
temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es
menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes
condiciones fisiológicas.
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica tal

y como se indica en la siguiente gráfica:
19
De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número
de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la
temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la
décima parte del inicial. La fórmula incluida en la gráfica permite calcular el valor z cuando
conocemos el incremento de temperatura (t2-t1) y los respectivos valores D.
Los valores d y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por
ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetativas de los mismos
microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener
valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder
determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico para destruir
microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z.
Otro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la microbiología de la

termodestrucción es el parámetro F que corresponde al tiempo equivalente (medido en
minutos de tratamiento a 250ºF, o 121.1ºC) a todo el calor recibido considerando su capacidad
de destruir microorganismos. Al valor de la integral del calor recibido se la denomina Fo.
Cuando consideramos que el calentamiento es un proceso instantáneo, se puede calcular
usando la siguiente fórmula:
Otros tratamientos tecnológicos para destruir microorganismos (radiación, por ejemplo) son
susceptibles de tratamientos matemáticos similares a los descritos en esta sección.
20
Consideraciones sobre las bajas temperaturas
Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma diferente según se trate de

condiciones de refrigeración (0ºC-8ºC) o de congelación (por debajo de -20ºC).
En condiciones de refrigeración los microorganismos mesófilos y termófilos detienen su

crecimiento y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los psicrófilos y psicrótrofos
pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una
causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeración).
En condiciones de congelación, la formación de cristales en el interior de las células produce

unas altas mortalidades que reducen el tamaño de la población. En el momento de la
congelación se produce la muerte rápida de muchos microorganismos y, a tiempos más largos,
la tasa de muerte se reduce aunque el número de viables sigue disminuyendo. En esta segunda
fase, la mortalidad es más rápida cuando la temperatura de congelación es más alta (más
próxima a valores de -20ºC) que cuando es menor (valores de -80ºC).
La tolerancia a la congelación de diferentes microorganismos puede variar.
No se puede considerar la congelación un procedimiento de esterilización sino sólo (en el caso

de microbiología de alimentos) un procedimiento de conservación.
Se pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de células eucarióticas

congelados en medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol.
21

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2020

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE INDUSTRIA

[GUIA TEORICA DE MICROBIOLOGIA GENERAL]

MG. MARIEL ALVAREZ RODRÍGUEZ

TERCERA UNIDAD: CULTIVO DE BACTERIAS

Capítulo V: CULTIVO DE LAS BACTERIAS

Para estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo el

f) Todo organismo vivo necesita de vitaminas y compuestos vitaminados, también en este

18.- TIPOS DE NUTRICIÓN DE LAS BACTERIAS.-

19.- CLASES DE NUTRIENTES.-

19.1.- NUTRIENTES UNIVERSALES

 El principal constituyente del protoplasto bacteriano;

Las fuentes de agua pueden ser:

 Endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;

Las bacterias tienen valores de a W normalmente entre 0.90 y 0.99.

 Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1.

El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

CO2 + 4H2 ---------> CH4 + 2H2O

 Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de

El origen del CO2 puede ser:

 Endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente

Capítulo VI: FACTORES DE CRECIMIENTO

Factor o vitamina Funciones principales

Acido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de

Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1;

Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en

Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas,

20.- MEDIOS DE CULTIVO

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el

20.1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que

 Digeridos crudos de extracto de carne

20.2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante

 En el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias

Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de

21.- CRECIMIENTO CELULAR

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de

Para transformar las ecuaciones

En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en paralelo.

Otra forma de representar la cinética es considerando el

Integrando la ecuación anterior durante el

El gráfico representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo (línea

(línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relación de

donde dS indica la variación de la concentración del substrato. Al valor Ys lo denominamos

El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o

La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el

22.- FACES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos

En la fase de muerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye

23.- MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los

En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos.

Métodos de recuento: Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo

Entre los métodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:

3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un

4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los

23.1.- FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS

¿Qué factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano?. A continuación vamos a

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la